分子雜交課件

1、轉(zhuǎn)基因水稻外源基因拷貝數(shù)檢測第二部分：分子雜交轉(zhuǎn)基因水稻外源基因拷貝數(shù)檢測第二部分：分子雜交Southern BlottingDNA抽提DNA酶切酶切產(chǎn)物電泳轉(zhuǎn)膜烘膜預(yù)雜交探針準(zhǔn)備及標(biāo)記雜交洗膜/顯影1212345679(kb)12335轉(zhuǎn)基因植物拷貝數(shù)檢測Southern BlottingDNA抽提DNA酶切酶切產(chǎn)分子雜交課件實驗原理Hind IIIprobe酶切、轉(zhuǎn)膜雜交、顯影不同的插入拷貝產(chǎn)生不同大小的雜交帶HHHH實驗原理Hind IIIprobe酶切、轉(zhuǎn)膜雜交、顯影不同的1212345679(kb)123351212345679(kb)12335植物總DNA的快速少量抽提（CTAB法

2、）植物總DNA的快速少量抽提（CTAB法）保證核酸一級結(jié)構(gòu)的完整性。（3050KB）排除其它分子的污染不存在對工具酶有抑制作用的有機溶劑和過高濃度的金屬離子。其它生物大分子的污染應(yīng)降到最低程度。DNA純化的要求分離純化核酸總的原則保證核酸一級結(jié)構(gòu)的完整性。（3050KB）不存在對工具酶有CTAB是一種非離子去污劑，CTAB與核酸形成復(fù)合物，此復(fù)合物在高鹽（0.7mM）濃度下可溶，并穩(wěn)定存在，但在低鹽濃度（0.1-0.5mM NaCl）下CTAB-核酸復(fù)合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白質(zhì)及多糖等仍溶解于溶液中。經(jīng)離心棄上清后，CTAB-核酸復(fù)合物再用7075%酒精浸泡可洗脫掉CTAB。C

3、TAB法原理：CTAB是一種非離子去污劑，CTAB與核酸形成復(fù)合物，此復(fù)合操作步驟：采取新鮮幼嫩葉片在研缽中用液態(tài)氮冷凍，研磨成細粉； 取約0.4g左右細粉于1.5ml離心管，加入1ml預(yù)熱至95C以上的1.5CTAB，混勻； 65C水浴中放置30分鐘，每隔5分鐘上下顛倒混合數(shù)次 (DNase變性，促進內(nèi)溶物釋放)； 12000g離心2分鐘； 吸取600l上清于新的1.5ml離心管，加入等體積氯仿/異戊醇（24:1），上下顛倒混合至下層有機相呈深綠色；操作步驟：采取新鮮幼嫩葉片在研缽中用液態(tài)氮冷凍，研磨成細粉； 12000g離心5-10分鐘；吸取450l上清于新的1.5ml離心管，加入兩倍體積

4、95乙醇和1/10體積3M NaAc，輕輕的上下顛倒混勻至白色絮狀沉淀出現(xiàn)12000g離心10分鐘；棄去上清。用500l 75乙醇浸洗沉淀5分鐘，除去離子及CTAB殘余，12000g離心5分鐘，棄上清,自然干燥；加入50lTE（含20g/ml RNaseA），放于4C溶解；充分溶解后，測定并調(diào)整濃度 12000g離心5-10分鐘；1盡量取材幼嫩葉片，如太老，酚類物質(zhì)多，必須用10mM的-ME處理2研缽預(yù)凍，粉末轉(zhuǎn)管前至加CTAB前不要融化324:1的苯酚氯仿抽提時動作應(yīng)輕柔，氯仿的操作要在通風(fēng)柜中進行4實驗操作戴手套 思考： （1）試分析DNA降解的可能原因 （2）提高DNA產(chǎn)量的措施本實驗注

5、意事項： 1盡量取材幼嫩葉片，如太老，酚類物質(zhì)多，必須用10mM的氯仿/異戊醇（24:1）：氯仿是有機溶劑，去除植物色素，蛋白質(zhì)和多糖等，異戊醇可減少蛋白質(zhì)變性過程中氣泡的產(chǎn)生，配合使用兩有機溶劑，比用單一有機溶劑去除蛋白質(zhì)更有效。DNA沉淀：無水或95的乙醇，異丙醇3M NaAC (或10M NH4AC） 協(xié)助乙醇沉淀DNA。75% 乙醇去除微量Na+、K+、Mg2+等陽離子及小分子量的有機分子，洗脫CTAB所用到的試劑及作用氯仿/異戊醇（24:1）：氯仿是有機溶劑，去除植物色素，蛋白TE（1mM EDTA，10mM Tris.HCl pH8.0）溶解并長期保存DNA。EDTA螯合Mg2+、

6、Ca2+等二價陽離子，從而抑制DNase等的活性。1.5 CTAB CTAB 15 g 1 M TrisCl (pH 8.0) 75 ml 0.5 M EDTA 30 ml NaCl 61.4 g Add ddH2O to 1000 ml 外環(huán)境條件：pH8.0防止脫氨作用；65 CTAB中DNase變性，促進內(nèi)溶物釋放；離心時15以防CTAB沉淀而降低DNA量。TE（1mM EDTA，10mM Tris.HCl pH8.DNA純度：吸光值檢測：檢測260nm、280nm吸光值，紫外分光光度計A260/A280=1.81.9； 1.8最佳，低于1.8說明有蛋白質(zhì)，大于1.8說明有RNA。電泳檢

7、測DNA大?。涵傊悄z電泳DNA質(zhì)量檢測DNA純度：吸光值檢測：檢測260nm、280nm吸光值，紫Hoechst33258:可與納克級的DNA結(jié)合，而幾乎沒有RNA親和性，激發(fā)波長365nm，發(fā)射波長460nm。0.1g/ml Hoechst33258適用于檢測500ng/ml的DNA濃度，染料增加到1g/ml，分析范圍可延至15g/ml，但會降低一定的靈敏度。 缺點：更易于結(jié)合AT豐富區(qū)，對DNA組成敏感。EB:與DNA組成無關(guān)，但不如Hoechst33258敏感，且能結(jié)合RNA，激發(fā)波長302nm，發(fā)射波長590nm。DNA的定量（1）熒光檢測儀1 OD50 g/ml DS-DNA 或

8、 1 OD 40 g/ml RNA or SSDNA （2.）分光光度計Hoechst33258:可與納克級的DNA結(jié)合，而幾乎沒有瓊脂糖凝膠電泳 帶電荷的物質(zhì)在電場中的趨向運動稱為電泳。電泳的種類多，應(yīng)用非常廣泛，它已成為分子生物學(xué)技術(shù)中分離生物大分子的重要手段。瓊脂糖凝膠電泳由于其操作簡單、快速、靈敏等優(yōu)點，已成為分離和鑒定核酸的常用方法。 瓊脂糖凝膠電泳 帶電荷的物質(zhì)在電場中的趨向運動稱為電泳。電泳在pH值為8.08.3時，核酸分子帶負電，在電泳時由負極向正極移動。采用適當(dāng)濃度的凝膠介質(zhì)作為電泳支持物，在分子篩的作用下，使分子大小和構(gòu)像不同的核酸分子泳動率出現(xiàn)較大的差異，從而達到分離核酸

9、片段檢測其大小的目的。核酸分子中嵌入熒光染料（如EB）后，在紫外燈下可觀察到核酸片段所在的位置。實驗原理：在pH值為8.08.3時，核酸分子帶負電，在電泳時由負極向影響DNA遷移速率的因素 DNA分子大小：遷移速率U與logN成反比（N為堿基對數(shù)目）。分子越大，遷移越慢。等量的空間結(jié)構(gòu)緊密的電泳快（超螺旋線性DNA）瓊脂糖濃度：logU=logU0 Kr 膠濃度，U為遷移率，U0 為DNA的自由電泳遷移率，為膠濃度，Kr為介質(zhì)阻滯系數(shù)。不同的凝膠濃度，分辨不同范圍的DNA Agarose：0.5%： 1-30 kb；0.7%： 0.8-12 kb 1.2%： 0.4-7 kb； 1.5%： 0

10、.2-3 kb. 影響DNA遷移速率的因素 DNA分子大?。哼w移速率U與logDNA構(gòu)象：一般遷移速率超螺旋環(huán)狀線狀DNA單鏈開環(huán)。當(dāng)條件變化時，情況會相反，還與瓊脂糖的濃度、電流強度、離子強度及EB含量有關(guān)。所加電壓：低電壓時，線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。使分辨效果好，凝膠上所加電壓不應(yīng)超過5V/cm堿基組成與溫度：一般影響不大4 -30 DNA構(gòu)象：一般遷移速率超螺旋環(huán)狀線狀DNA單鏈開環(huán)。當(dāng)嵌入染料的存在：降低線性DNA遷移率，(不提倡加在電泳液中)電泳緩沖液的組成及其離子強度：影響DNA的遷移率，無離子存在時，核酸基本不泳動，離子強度過大產(chǎn)熱厲害，熔化凝膠并導(dǎo)致DNA變性

11、，一般采用1TAE，0.5TBE，1TPE（均含EDTA pH8.0） 嵌入染料的存在：降低線性DNA遷移率，(不提倡加在電泳液中)實驗步驟：用膠帶將洗凈、干燥的制膠板的兩端封好，水平放置在工作臺上；調(diào)整好梳子的高度；稱取0.24 g瓊脂糖于30 ml 0.5TBE中，在微波爐中使瓊脂糖顆粒完全溶解，冷卻至溫?zé)釙r倒膠；凝膠凝固后，小心拔去梳子，撕下膠帶；實驗步驟：用膠帶將洗凈、干燥的制膠板的兩端封好，水平放置在工將電泳樣品與上樣緩沖液混合后將樣品依次點入加樣孔中；將制膠板放入電泳槽中，加入電泳液，打開電泳儀，使核酸樣品向正極泳動（注意點樣孔在電泳槽的負極一端）；電泳完成后切斷電源，取出凝膠，放

12、入0.5 g/ml的溴化乙錠（EB）中浸泡1015 min，在紫外透射儀上觀察電泳結(jié)果并照相記錄。將電泳樣品與上樣緩沖液混合后將樣品依次點入加樣孔中；電泳指示劑：核酸電泳常用的指示劑有兩種，溴酚藍（bromophenol blue, Bb）呈藍紫色；二甲苯晴（xylene cyanol, Xc）呈藍色，它攜帶的電荷量比溴酚藍少，在凝膠中的的遷移率比溴酚藍慢。 1. 含甘油或蔗糖，利于DNA樣品沉入點樣孔中2. 含有電泳指示劑，以指示電泳的進程上樣緩沖液：電泳指示劑：核酸電泳常用的指示劑有兩種，溴酚藍（bromop實驗室常用核酸染料EBGel red（UniRed）/Gel greenSybr

13、green ISybr Green II（RNA）Gold View實驗室常用核酸染料EBEB：溴化乙錠，可嵌入DNA分子中，受紫外光激發(fā)而發(fā)出熒光，利用它可檢測DNA。是誘變劑，可引起插入突變，并有中度毒性，操作時應(yīng)注意防護。操作時應(yīng)戴手套，盡量減少臺面污染。1000貯存液(0.5mg/mL )，使用時按1：1000稀釋配制染色液。EB的去除EB：溴化乙錠，可嵌入DNA分子中，受紫外光激發(fā)而發(fā)出熒光，有特定的識別序列 ，通常為46堿基的回文對稱序列。切割位點位于識別序列內(nèi)的固定位置上，切割后在5末端有磷酸基團，3末端有羥基。切割后形成粘性末端或平末端，前者又分為3突出端（如PstI）和5突出

14、端(如EcoRI)兩種其活性發(fā)揮只需Mg2作輔酶。II類限制性內(nèi)切酶的特點有特定的識別序列 ，通常為46堿基的回文對稱序列。II類限限制酶的一個活性單位（1U）：原則上指在50l 反應(yīng)體系中，37下，經(jīng)過1小時的反應(yīng)將1 g的DNA完全分解所需要的酶量。限制酶的star活性：限制酶在某些極端非標(biāo)準(zhǔn)條件下對底物DNA的特異性可能降低，即可將與原來識別的特定DNA序列不同的堿基序列切斷，這種現(xiàn)象叫限制酶的star活性。它的出現(xiàn)的頻率與酶、底物及反應(yīng)條件有關(guān)。限制酶的一個活性單位（1U）：原則上指在50l 反應(yīng)體系中引起星星活性的主要因素：高濃度的甘油（5）；酶過量（100U/ g）；低離子強度（p

15、H8.0)；有機溶劑（DMSO，乙醇，乙二醇，二甲基乙酰胺；用其他二價陽離子代替Mg2+(Mn2+,Cu2+,Co2+,Zn2+)不同的酶對上述因素的敏感程度不同引起星星活性的主要因素：氯化鎂、氯化鈉/鉀、Tris鹽酸鹽、巰基乙醇或二硫蘇糖醇（DTT）牛血清白蛋白（BSA）典型的限制性內(nèi)切酶作用的緩沖體系成分包括：氯化鎂、氯化鈉/鉀、Tris鹽酸鹽、典型的限制性內(nèi)切酶作用的注意注意閱讀商家提供的產(chǎn)品說明書，了解所使用工具酶的濃度和最適作用條件，不要用錯了buffer和作用的溫度等涉及到酶的操作時,一律在冰上操作使用移液器吸取酶時，tip頭只能剛剛插入液面吸取如果有多個反應(yīng)，酶、buffer、水

16、等應(yīng)配制成mixture再分裝各種成分加完后應(yīng)混勻，然后在離心機上短暫離心注意注意閱讀商家提供的產(chǎn)品說明書，了解所使用工具酶的濃度和最檢測DNA質(zhì)量測量DNA濃度所有DNA樣品的濃度調(diào)整到大致相同限制性內(nèi)切酶操作準(zhǔn)備：檢測DNA質(zhì)量限制性內(nèi)切酶操作準(zhǔn)備：DNA ( g) 10 l10*buffer reaction 2 lEnzyme (10U) 1l (10U/l ) H2O 7 l 20 l酶切體系：注意：冰上操作DNA ( g) 10 1 5 DNA10 l (ddH2O) Hind (10U/l)1 l 5 l 10buffer2 l 10l ddH2O 7 l 35 l Total

17、20 l 37C 酶切過夜酶切體系混勻分裝 電泳檢測酶切效率：每樣品1/10量上樣，電泳檢測。若呈現(xiàn)均勻連續(xù)分布的一片，則酶切效果好，否則重做 。出現(xiàn)切爛：DNA降解，重新提DNA；切不動：雜質(zhì)多（多糖，蛋白質(zhì)，酚類，有機溶劑等），重新純化。酶切效果檢測：電泳檢測酶切效率：每樣品1/10量上樣，電泳檢測。酶切效果檢A1優(yōu)總DNA A2劣總DNA B1 酶切爛 B2酶切優(yōu) B3切不動A1優(yōu)總DNA A2劣總DNA B1總DNA酶切電泳檢測總DNA酶切電泳檢測1212345679(kb)123351212345679(kb)12335酶切反應(yīng)的終止加入終濃度為12.5m mol/L的EDTA以鰲合

18、鎂離子而終止酶的反應(yīng)多數(shù)酶在65C 10分鐘可被不可逆滅活，少數(shù)65C不失活的酶在75 C 15分鐘也能失活若酶對熱具完全抗性，可通過酚抽提乙醇沉淀來純化酶切反應(yīng)的終止加入終濃度為12.5m mol/L的EDTA以造成DNA酶切不完全的主要原因有：操作不當(dāng)，酶或DNA加至管壁上，反應(yīng)體系沒完全混合；混和后應(yīng)短暫離心；反應(yīng)條件不合適，用錯了緩沖液或溫度不合適；酶的活力不夠DNA不干凈，反應(yīng)體系中存在酶的抑制劑；造成DNA酶切不完全的主要原因有：操作不當(dāng)，酶或DNA加至管DNA樣品中抑制酶活的污染物主要有：DNA 樣品中的蛋白質(zhì)、多糖、酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、高濃度的鹽等均能抑制酶切活性

19、解決辦法：增加酶作用的單位數(shù)（10-20U/g DNA)增大反應(yīng)體積以稀釋可能的抑制劑延長反應(yīng)時間消化基因組DNA時，加入終濃度1-2.5m mol/L多聚陽離子亞精胺可改善酶切效果，其作用是結(jié)合帶負電荷的污染物。純化DNADNA樣品中抑制酶活的污染物主要有：DNA 樣品中的蛋白質(zhì)、膠濃度0.7-0.8%。膠厚度 5mm (250ml膠)。膠的均一性(不同樣品的遷移率一致)。樣品DNA量指示劑量稍大，長時間指示。點樣順序：marker，陽性對照，陰性對照，本組樣品電泳電壓：大電泳槽40V，12小時，1-1.5V/cm。電泳結(jié)束，指示劑約移動10-11cm。電泳膠濃度0.7-0.8%。電泳轉(zhuǎn)膜的

20、方式：1. Upward Capillary Transfer (Figure 1)2. Downward Capillary Transfer (Figure 2)3.Simultaneous Transfer to Two Membranes4. Electrophoretic Transfer5.Vacuum Transfer轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜的方式：轉(zhuǎn)膜Upward Capillary TransferUpward Capillary TransferUpward Capillary TransferUpwarDownward Capillary TransferDownward Capillary Transfer尼龍膜：高強度，不易破損，與DNA共價結(jié)合，反復(fù)使用10次以上不破損，不丟失DNA，吸附DNA每cm2比硝酸膜多5倍，50bp有效雜交。硝酸纖維素膜：非共價結(jié)合，易脆，易丟失DNA，不能與膜結(jié)合。轉(zhuǎn)移緩沖液（transfer buffer）帶正電荷的尼龍膜：可用高鹽