多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增片段經(jīng)典版

1、關(guān)于多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增片段經(jīng)典版第1頁(yè)，共33頁(yè)，2022年，5月20日，19點(diǎn)45分，星期三DNA指紋法在案件偵破中有重要作用，刑偵人員通過案發(fā)現(xiàn)場(chǎng)的血液、頭發(fā)等樣品中提取的DNA，與犯罪嫌疑人的DNA進(jìn)行比較，就由可能為案件的偵破提供證據(jù)。討論：1.犯罪嫌疑人留在現(xiàn)場(chǎng)的樣品一般都是極少量的，刑偵人員要怎樣才能得到足夠量的DNA呢？2.你還能說出DNA鑒定技術(shù)在其他方面的應(yīng)用嗎？第2頁(yè)，共33頁(yè)，2022年，5月20日，19點(diǎn)45分，星期三分子生物學(xué)研究中最強(qiáng)大的實(shí)驗(yàn)技術(shù)之一其本質(zhì)是在體外模擬細(xì)胞內(nèi)DNA分子復(fù)制的過程美國(guó)科學(xué)家穆利斯(K.B.Mullis)發(fā)明了PCR技術(shù)1993年諾貝爾獎(jiǎng)

2、 第3頁(yè)，共33頁(yè)，2022年，5月20日，19點(diǎn)45分，星期三（一）DNA分子的結(jié)構(gòu)C、H、O、N、P1.元素組成：脫氧核苷酸2.基本單位:一、基礎(chǔ)知識(shí)脫氧核苷酸脫氧核苷磷酸脫氧核糖含氮堿基嘌呤嘧啶腺嘌呤（A）鳥嘌呤（G）胞嘧啶（C）胸腺嘧啶（T）第4頁(yè)，共33頁(yè)，2022年，5月20日，19點(diǎn)45分，星期三一個(gè)核苷酸上的磷酸基團(tuán)上的“OH”和另一個(gè)核苷酸分子的第3位碳原子上的羥基之間失去一分子水，形成磷酸二酯鍵，即在相鄰的兩個(gè)脫氧核苷酸的3和5碳原子之間形成磷酸二酯鍵。數(shù)量龐大的四種脫氧核苷酸通過3，5-磷酸二酯鍵彼此連接起來形成脫氧核苷酸鏈。通常將DNA的羥基“OH”末端稱為3端，而磷酸

3、基團(tuán)的末端稱為5端3.脫氧核苷酸鏈的形成脫氧核苷酸鏈結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)圖第5頁(yè)，共33頁(yè)，2022年，5月20日，19點(diǎn)45分，星期三DNA分子的平面結(jié)構(gòu)ATGCAGCT氫鍵5端3端5端3端 識(shí)別 ：-OH端為3; 磷酸基團(tuán)的末端為5。第6頁(yè)，共33頁(yè)，2022年，5月20日，19點(diǎn)45分，星期三4.DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu).DNA分子是由 的（即一條鏈為35，另一條鏈為53）脫氧核苷酸長(zhǎng)鏈盤旋而成的規(guī)則 結(jié)構(gòu)。. 與 交替連結(jié)，排列在外側(cè)，構(gòu)成基本骨架； 排列在鏈的內(nèi)側(cè)。.兩條鏈上的堿基通過 連結(jié)起來，形成堿基對(duì)。堿基對(duì)的組成有特定的規(guī)律：即腺嘌呤一定與 配對(duì)， 一定同胞嘧啶配對(duì)。雙螺旋兩條反向平行脫氧核

4、糖磷酸堿基氫鍵胸腺嘧啶鳥嘌呤第7頁(yè)，共33頁(yè)，2022年，5月20日，19點(diǎn)45分，星期三（1）DNA分子是由 的（即一條鏈為35，另一條鏈為53）脫氧核苷酸長(zhǎng)鏈盤旋而成的規(guī)則 結(jié)構(gòu)。4.DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：（2） 與 交替連結(jié)，排列在外側(cè)，構(gòu)成基本骨架； 排列在鏈的內(nèi)側(cè)。（3）兩條鏈上的堿基通過 連結(jié)起來，形成堿基對(duì)。堿基對(duì)的組成有特定的規(guī)律：即腺嘌呤（A）一定與 配對(duì)，鳥嘌呤（G）一定同 配對(duì)。兩條反向平行雙螺旋脫氧核糖磷酸堿基氫鍵胸腺嘧啶（T）胞嘧啶（C）第8頁(yè)，共33頁(yè)，2022年，5月20日，19點(diǎn)45分，星期三（二）DNA的復(fù)制：1.概念：由一個(gè)DNA形成兩個(gè)完全相同的DNA的過

5、程。2.時(shí)期：有絲分裂間期，減數(shù)第一次分裂前的間期。3.場(chǎng)所：細(xì)胞核（主要）、線粒體、葉綠體4.基本條件：酶:解旋酶、DNA聚合酶能量:ATP原料:四種脫氧核苷酸模板:DNA的兩條鏈第9頁(yè)，共33頁(yè)，2022年，5月20日，19點(diǎn)45分，星期三5.復(fù)制特點(diǎn)：a.邊解旋邊復(fù)制b.半保留復(fù)制6.遵循原則：堿基互補(bǔ)配對(duì)原則7.精確復(fù)制的原因a.規(guī)則的雙螺旋結(jié)構(gòu)為復(fù)制提供了精確的模板b.堿基互補(bǔ)配對(duì)保證了復(fù)制準(zhǔn)確無誤的進(jìn)行8.復(fù)制的意義:DNA分子通過復(fù)制將遺傳信息從親代傳給了后代，保持了遺傳信息的連續(xù)性。第10頁(yè)，共33頁(yè)，2022年，5月20日，19點(diǎn)45分，星期三參與的組分在DNA復(fù)制中的作用解

6、旋酶DNA母鏈4種脫氧核苷酸DNA聚合酶引物總結(jié)：細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制的基本體系打開DNA雙鏈提供DNA復(fù)制的模板合成子鏈的原料催化合成DNA子鏈?zhǔn)笵NA聚合酶能夠從引物的3端開始連接脫氧核苷酸第11頁(yè)，共33頁(yè)，2022年，5月20日，19點(diǎn)45分，星期三解旋酶DNA母鏈4種脫氧核苷酸DNA聚合酶引物（ RNA）打開DNA雙鏈模板合成子鏈的原料催化子鏈合成使DNA聚合酶能從引物3端開始連接脫氧核苷酸 思考：體外擴(kuò)增DNA時(shí)，如何提供與體內(nèi)DNA復(fù)制相似條件？ 變性（ 80100 ）Taq DNA聚合酶（耐高溫）2030個(gè)核苷酸構(gòu)成DNA或RNA第12頁(yè)，共33頁(yè)，2022年，5月20日，19點(diǎn)4

7、5分，星期三二、PCR（多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）（一）PCR原理DNA雙鏈變性（加熱80-100 ）復(fù)性（緩慢冷卻）DNA單鏈變性的目的：解開雙鏈復(fù)性的目的：有利于引物1和引物2與兩條單鏈的結(jié)合第13頁(yè)，共33頁(yè)，2022年，5月20日，19點(diǎn)45分，星期三PCR擴(kuò)增儀PCR擴(kuò)增儀實(shí)際上就是一臺(tái)能夠自動(dòng)調(diào)控溫度的儀器，它可以根據(jù)DNA的熱變性原理，通過自動(dòng)改變溫度，達(dá)到擴(kuò)增DNA片段的目的。第14頁(yè)，共33頁(yè)，2022年，5月20日，19點(diǎn)45分，星期三1234522557294時(shí)間（min）溫度（）適溫延伸高溫變性低溫復(fù)性重復(fù)13步30輪DNA復(fù)制的方向：DNA的合成方向總是從子鏈的5端向3端延伸變

8、性 復(fù)性（退火） 延伸（二）PCR的反應(yīng)過程：第15頁(yè)，共33頁(yè)，2022年，5月20日，19點(diǎn)45分，星期三二、PCR的反應(yīng)過程 5/3/3/5/5/3/引物5/3/引物變性95oC復(fù)性55oC延伸72oC5/3/3/5/第16頁(yè)，共33頁(yè)，2022年，5月20日，19點(diǎn)45分，星期三5引物15引物2第二次復(fù)制第一次復(fù)制55 55 5 5模板DNA55 555 5 552530 次循環(huán)（復(fù)制）后，模板DNA的含量可以擴(kuò)大100萬（220）倍以上。第17頁(yè)，共33頁(yè)，2022年，5月20日，19點(diǎn)45分，星期三三、 PCR實(shí)驗(yàn)操作1、PCR儀（一）設(shè)備及用具2、微量離心管一種薄壁塑料管，總?cè)莘e

9、為0.5mL3、微量移液器 用于定量轉(zhuǎn)移PCR配方中的液體，其上的一次性吸液槍頭用一次更換一次實(shí)質(zhì)上是能夠自動(dòng)調(diào)控溫度的儀器第18頁(yè)，共33頁(yè)，2022年，5月20日，19點(diǎn)45分，星期三第19頁(yè)，共33頁(yè)，2022年，5月20日，19點(diǎn)45分，星期三4、離心機(jī)一種通過高速轉(zhuǎn)動(dòng)產(chǎn)生離心現(xiàn)象，能將固體與液體分開的設(shè)備。第20頁(yè)，共33頁(yè)，2022年，5月20日，19點(diǎn)45分，星期三（1）按配方將所需試劑擺放在實(shí)驗(yàn)桌上（準(zhǔn)備）（2）用微量移液器按配方在微量離心管中依次加入各組分（移液）（3）蓋嚴(yán)離心管口的蓋子，用手指輕輕彈擊管壁（混合）（4）將微量離心管放在離心機(jī)上（離心）（5）將離心管放入PCR

10、儀上，設(shè)置好PCR儀的循環(huán)程序（反應(yīng)）循環(huán)數(shù)變性復(fù)性延伸第一次94，5min30次94，30s55，30s72，1min最后一次4，1min55，30s72，1min（二）操作步驟：第21頁(yè)，共33頁(yè)，2022年，5月20日，19點(diǎn)45分，星期三四、 結(jié)果分析與評(píng)價(jià)DNA 含量的測(cè)定：稀釋 對(duì)照調(diào)零 測(cè)定 計(jì)算50倍蒸餾水做對(duì)照波長(zhǎng)260nm處讀數(shù)第22頁(yè)，共33頁(yè)，2022年，5月20日，19點(diǎn)45分，星期三（一）理論上DNA擴(kuò)增數(shù)目的計(jì)算四、課題成果評(píng)價(jià)1 、一條DNA，復(fù)制n次， DNA為2 n2 、 a條DNA，復(fù)制n次， DNA為a x2 n（二）實(shí)驗(yàn)中DNA含量的測(cè)定1 、原理 可

11、以通過測(cè)量DNA含量來評(píng)價(jià)擴(kuò)增的效果，DNA在260nm的紫外線波段有一強(qiáng)烈的吸收峰，峰值的大小與DNA的含量有關(guān)第23頁(yè)，共33頁(yè)，2022年，5月20日，19點(diǎn)45分，星期三光吸收波長(zhǎng)nm2602402202800.10.2第24頁(yè)，共33頁(yè)，2022年，5月20日，19點(diǎn)45分，星期三2 、過程稀釋2L PCR反應(yīng)液，加入98L蒸餾水，即將樣品進(jìn)行50倍稀釋對(duì)照調(diào)零以蒸餾水作為空白對(duì)照，在波長(zhǎng)260nm處，將紫外分光光度計(jì)的讀數(shù)調(diào)節(jié)至零取DNA稀釋液100L至比色杯中，測(cè)定260nm處的光吸收值測(cè)定并計(jì)算DNA含量（g/mL）50(260nm的讀數(shù))稀釋倍數(shù)第25頁(yè)，共33頁(yè)，2022年

12、，5月20日，19點(diǎn)45分，星期三50：在厚度為1cm比色杯中的吸光值為1, DNA 的含量為50g /mL紫外分光光度計(jì)比色杯第26頁(yè)，共33頁(yè)，2022年，5月20日，19點(diǎn)45分，星期三體內(nèi)DNA復(fù)制與PCR的技術(shù)區(qū)別：體內(nèi)復(fù)制PCR技術(shù)解旋在解旋酶作用下，細(xì)胞提供ATP，部分解開加熱到94oC,雙鏈全部解開，不需解旋酶引物一小段RNA一般用DNA片段DNA聚合酶細(xì)胞自身的DNA聚合酶（不耐高溫）TaqDNA聚合酶復(fù)制特點(diǎn)半保留復(fù)制，邊解旋邊復(fù)制，多起點(diǎn)復(fù)制。半保留復(fù)制，完全解旋后復(fù)制，從模板鏈的一端開始復(fù)制。復(fù)制的方向子鏈的5端向 3端延伸子鏈的5端向 3端延伸第27頁(yè)，共33頁(yè)，20

13、22年，5月20日，19點(diǎn)45分，星期三課堂小結(jié)多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段PCR原理DNA的復(fù)制需要酶、原料、能量、引物DNA的變性和復(fù)性受溫度影響PCR過程變性復(fù)性延伸操作步驟配制PCR反應(yīng)體系移入離心管放入PCR儀設(shè)置工作參數(shù)DNA擴(kuò)增測(cè)定含量稀釋調(diào)零測(cè)定并讀數(shù)計(jì)算第28頁(yè)，共33頁(yè)，2022年，5月20日，19點(diǎn)45分，星期三練習(xí)鞏固：1.做PCR使用的微量離心管、槍頭、緩沖液及蒸餾水使用前必須進(jìn)行的關(guān)鍵步驟是 A.反復(fù)洗滌 B.不怕外源DNA污染 C.高壓滅菌 D.在-20儲(chǔ)存2.PCR技術(shù)最突出的優(yōu)點(diǎn)是 A.原理簡(jiǎn)單 B.原料易獲得 C.Taq DNA聚合酶有耐熱性 D.快速、高效、靈活、易于操作第29頁(yè)，共33頁(yè)，2022年，5月20日，19點(diǎn)45分，星期三靶序列靶序列PCR 循環(huán)第一步：高溫變性第30頁(yè)，共33