外源基因表達產(chǎn)物分離純化

1、外源基因表達產(chǎn)物的分離純化第1頁，共98頁，2022年，5月20日，8點27分，星期四一、 重組蛋白分離純化方法選擇的基本原則針對不同的產(chǎn)物表達形式采取不同的策略針對不同性質(zhì)的重組蛋白選擇不同的層析類型多種分離純化技術(shù)的聯(lián)合運用合適分離純化介質(zhì)的選擇分離純化過程的規(guī)?；?頁，共98頁，2022年，5月20日，8點27分，星期四1. 針對不同的產(chǎn)物表達形式采取不同的策略 采用分泌型戰(zhàn)略表達重組蛋白，通常體積大、濃度低，因此應(yīng)在純化之前采用沉淀或超濾等方法先進行濃縮處理； 采用包涵體型戰(zhàn)略表達重組蛋白，應(yīng)先離心回收包涵體； 采用融合型戰(zhàn)略表達重組蛋白，一般是胞內(nèi)可溶性的，擬首先選用親和層析進行純

2、化 表達在細胞膜和細胞壁之間的間隙中的蛋白質(zhì)，應(yīng)用低濃度的溶菌酶處理，然后再用滲透壓休克法釋放重組蛋白。第3頁，共98頁，2022年，5月20日，8點27分，星期四2. 針對不同性質(zhì)的重組蛋白選擇不同的層析類型 等電點處于極端區(qū)域（pI5 或 pI8）的重組蛋白應(yīng)首選離子交換法進行分離，這樣很容易除去幾乎所有的雜蛋白； 重組蛋白特異性的配體、底物、抗體、糖鏈等都是首選親合層析 疏水層析和反相層析是根據(jù)蛋白質(zhì)的疏水性差異進行分離的； 凝膠過濾層析是根據(jù)蛋白的分子量和體積差異進行分離的；第4頁，共98頁，2022年，5月20日，8點27分，星期四3. 多種分離純化技術(shù)的聯(lián)合運用在選擇分離純化方法時

3、應(yīng)遵循下列原則：應(yīng)選擇不同分離純化機理的方法聯(lián)合使用應(yīng)首先選擇能除去含量最多雜質(zhì)的方法應(yīng)盡量選擇高效的分離方法應(yīng)將最費時、成本最高的分離純化方法安排在最后階段第5頁，共98頁，2022年，5月20日，8點27分，星期四4. 合適分離純化介質(zhì)的選擇 常用的蛋白質(zhì)分離純化介質(zhì)有Sephadex和Superose。理想的分離純化介質(zhì)應(yīng)具有下列性質(zhì)：對目標蛋白具有較高的分離效率對目標蛋白不會造成變性化學性能和機械性能穩(wěn)定，重復(fù)性好價格低廉第6頁，共98頁，2022年，5月20日，8點27分，星期四Sephadex 是由葡聚糖通過環(huán)氧氯丙烷交聯(lián)形成的三維網(wǎng)狀凝膠顆粒 Superose是在珠狀瓊脂糖顆粒的

4、基礎(chǔ)上經(jīng)過兩次交聯(lián)后得到的 第7頁，共98頁，2022年，5月20日，8點27分，星期四5. 分離純化過程的規(guī)?；?蛋白質(zhì)分離純化的實驗室工藝、技術(shù)、方法在大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化過程未必合適，如：實驗室方法在工程上可能難以實現(xiàn)（超聲波破細胞壁）實驗室方法在大規(guī)模生產(chǎn)中可能成本過高（超速離心） 因此，在很多情況下，實驗室的技術(shù)路線不等于生產(chǎn)工藝。第8頁，共98頁，2022年，5月20日，8點27分，星期四1. 離子交換層析二、常用的分離方法離子交換層析的基本原理離子交換介質(zhì)的基本性質(zhì)離子交換層析的基本操作離子交換介質(zhì)的選擇原則第9頁，共98頁，2022年，5月20日，8點27分，星期四離子交換層析的基本原

5、理 離子交換層析是以離子交換劑為固定相，以特定的含離子溶液為流動相，利用離子交換劑對待分離的各種離子結(jié)合力的差異，而將混合物進行分離的層析技術(shù)。第10頁，共98頁，2022年，5月20日，8點27分，星期四離子交換介質(zhì)的基本性質(zhì) 離子交換劑亦稱離子交換介質(zhì)，通常是一種不溶性高分子化合物如樹脂，纖維素，葡聚糖，醇脂糖等； 離子交換劑中所含的可解離基團在水溶液中能與溶液中的其它陽離子交換劑的基本性能離子或陰離子起交換作用 不同蛋白質(zhì)與離子交換劑之間形成離子鍵數(shù)目不同，即親和力大小有差異，因此只要選擇適當?shù)南疵摋l件便可將混合物中的成分逐個洗脫下來，達到分離純化的目的第11頁，共98頁，2022年，5

6、月20日，8點27分，星期四 陰離子交換劑：強堿型和弱堿型離子交換劑的分類 陽離子交換劑：強酸型和弱酸型第12頁，共98頁，2022年，5月20日，8點27分，星期四陽離子交換劑分為強酸型、中強酸型和弱酸型三類，強酸型含有RSO3H，中強酸型含有PO3H2、PO2H2或OPO2H2，弱酸型含有COOH或OH。 陽離子交換進行的反應(yīng)如下：第13頁，共98頁，2022年，5月20日，8點27分，星期四陰離子交換劑分為強堿型、中強堿型和弱堿型三類，含有四級銨鹽 N+(CH3)3 為強堿型，三級以下銨鹽 N(CH3)2、 NHCH3、 NH2 都屬弱堿型；同時具有強堿和弱堿型基團的，為中強堿型。陰離子

7、交換樹脂進行的反應(yīng)如下：第14頁，共98頁，2022年，5月20日，8點27分，星期四強離子交換劑的電離率基本不受pH值影響，離子交換作用的pH范圍寬弱離子交換劑的電離率受pH影響很大，離子交換作用的pH范圍小弱酸性陽離子交換劑在pH值降低時，其電離率逐漸降低，離子交換能力逐漸減弱弱堿性陰離子交換劑在pH值升高時，其電離率逐漸降低，離子交換能力逐漸減弱第15頁，共98頁，2022年，5月20日，8點27分，星期四常用的離子交換劑離子交換樹脂： 最常見的離子交換樹脂是含有酸性或堿性基團的人工合成的聚苯乙烯-二乙烯苯不溶性高分子化合物 離子交換樹脂的優(yōu)點是：流速快，對小分子物質(zhì)的交換容量大，因而適

8、合用于氨基酸、核苷酸等小分子生化物質(zhì)的分離純化第16頁，共98頁，2022年，5月20日，8點27分，星期四離子交換纖維素： 離子交換纖維素是攜帶功能基團纖維素衍生物，具有松散的親水性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)以及較大的表面積，大分子可以自由通過，因而對生物大分子（如蛋白質(zhì)）的交換容量比離子交換樹脂大 陽離子型離子交換纖維素包括羥甲基纖維素（CM纖維素）等維素） 陰離子型離子交換纖維素包括二乙基氨基乙基纖維素（DEAE纖第17頁，共98頁，2022年，5月20日，8點27分，星期四離子交換葡聚糖： 離子交換葡聚糖是葡聚糖經(jīng)環(huán)氧氯丙烷交聯(lián)后形成的具有多孔三維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)并帶有離子交換功能基團。Sephadex的優(yōu)

9、點如下： 親水性強、不會引起生物分子的變性和失活，母鏈對蛋白質(zhì)、核酸及其它生物分子的非特異性吸附能力小 電離基團在母體上取代程度高，交換容量大，裝柱方便，流速快 既有離子交換作用，又有分子篩效應(yīng) 因而Sephadex是一類廣泛應(yīng)用的色譜分離介質(zhì)第18頁，共98頁，2022年，5月20日，8點27分，星期四 常用的離子交換葡聚糖包括： 陽離子交換劑CM-Sephadex C-25，CM-Sephadex C-50 陰離子交換劑DEAE-Sephadex A-25，DEAE-Sephadex A-50QAE-Sephadex A-25，QAE-Sephadex A-50 第19頁，共98頁，202

10、2年，5月20日，8點27分，星期四離子交換瓊脂糖： 離子交換瓊脂糖是攜帶DEAE或CM基團的Sepharose CL-6B尤其是介質(zhì)受pH和離子強度的影響所引起的膨脹和收縮效應(yīng)較小，因具有硬度大、性質(zhì)穩(wěn)定，流速好，分離能力強等優(yōu)點此具有穩(wěn)定的外形體積第20頁，共98頁，2022年，5月20日，8點27分，星期四離子交換介質(zhì)的選擇原則一般而言：酸性物質(zhì)用陰離子交換劑分離氨基酸、核苷酸、蛋白質(zhì)等兩性電解質(zhì)，可根據(jù)其pI值及離子化堿性物質(zhì)用陽離子交換劑分離曲線來選擇第21頁，共98頁，2022年，5月20日，8點27分，星期四12346789105pH+-蛋白質(zhì)凈電荷等電點吸附陰離子交換劑吸附陽離

11、子交換劑pH pI（-）對pI=5的某酸性蛋白質(zhì)在pH5.5-9.0的范圍內(nèi)，當?shù)鞍踪|(zhì)為陰離子時，應(yīng)首選DEAE纖維素；在pH3.5-4.5的范圍內(nèi)，當?shù)鞍踪|(zhì)為陽離子時，應(yīng)首選CM纖維素第22頁，共98頁，2022年，5月20日，8點27分，星期四離子交換層析的基本操作(1) 層析柱平衡平衡緩沖液的用量至少為柱體積的 2 倍平衡緩沖液的流速可略高于正常操作流速平衡終點以流出液的離子濃度、導(dǎo)電性、pH值與緩沖液一致 為準，其中pH值最重要目的：保證待分離物質(zhì)如蛋白質(zhì)的穩(wěn)定； 使各個待分離物質(zhì)與離子交換劑有適當?shù)慕Y(jié)合； 使待分離樣品和雜質(zhì)與離子交換劑的結(jié)合有較大的差別。 第23頁，共98頁，202

12、2年，5月20日，8點27分，星期四(2) 樣品進柱為了達到滿意的分離效果，進樣量一般為介質(zhì)交換容量的10-20%為了避免進樣溶液中的離子強度過高，樣品濃度不宜太高交換容量：離子交換劑中全部可交換的離子或功能基團的總數(shù)第24頁，共98頁，2022年，5月20日，8點27分，星期四離子交換層析的基本操作(3) 樣品洗脫恒定洗脫階段洗脫梯度洗脫102030405060708090分子濃度離子強度pH值第25頁，共98頁，2022年，5月20日，8點27分，星期四1.平衡階段:離子交換劑與反離子結(jié)合2.吸附階段：樣品與反離子進行交換3、4. 解吸附階段：用梯度緩沖溶液洗脫，先洗下弱吸附物質(zhì)，后洗下強

13、吸附物質(zhì)5.再生階段：用原始平衡液進行充分洗滌，既可重復(fù)使用12345原始緩沖溶液的反離子樣品溶液梯度濃度第26頁，共98頁，2022年，5月20日，8點27分，星期四時刻要記?。旱鞍踪|(zhì)是由氨基酸聚合形成的聚合物，所以蛋白質(zhì)也存在等電點（pI），蛋白質(zhì)在溶液中帶電狀況同氨基酸相同，取決于所處溶液的pH 值。當pI pH時，蛋白質(zhì)帶凈正電荷。舉一例子：已知蛋白X等電點為7，設(shè)計實驗利用陰離子交換樹脂純化。答案：建立陰離子交換柱，比如Q-Sepharose。用pH8.5的緩沖液平衡柱子，同時蛋白X溶解于pH8.5的緩沖液中，在此pH值下蛋白X帶有負電，將含有蛋白X的混合液上樣，然后用起始液沖洗，蛋

14、白X會與此柱結(jié)合，然后鹽梯度洗脫。第27頁，共98頁，2022年，5月20日，8點27分，星期四2. 凝膠層析凝膠層析的基本原理凝膠介質(zhì)的基本性質(zhì)凝膠層析的基本操作凝膠介質(zhì)的選用原則第28頁，共98頁，2022年，5月20日，8點27分，星期四凝膠層析的基本原理 凝膠層析是利用有一定孔徑范圍的多孔凝膠作為固定相，對混合物中各組份按分子大小進行分離的層析技術(shù)，又稱為分子篩。 分子直徑比凝膠最大孔隙直徑大的，會被全部排阻在凝膠顆粒之外，即全排阻； 鑒于上述原理，凝膠層析可用于重組蛋白溶液脫鹽、分子量測定以及分離純化。第29頁，共98頁，2022年，5月20日，8點27分，星期四凝膠過濾的作用機制第

15、30頁，共98頁，2022年，5月20日，8點27分，星期四帶網(wǎng)孔的葡聚糖珠小分子進入葡聚糖珠內(nèi)大分子不能進入珠內(nèi)，經(jīng)珠之間縫隙流出凝膠過濾層析過程示意圖第31頁，共98頁，2022年，5月20日，8點27分，星期四凝膠過濾層析過程示意圖小分子大分子凝膠基質(zhì)凝膠珠第32頁，共98頁，2022年，5月20日，8點27分，星期四第33頁，共98頁，2022年，5月20日，8點27分，星期四第34頁，共98頁，2022年，5月20日，8點27分，星期四第35頁，共98頁，2022年，5月20日，8點27分，星期四第36頁，共98頁，2022年，5月20日，8點27分，星期四凝膠介質(zhì)的基本性質(zhì) 葡聚糖

16、凝膠的種類有G10、G15、G25、G50、G75、G100 葡聚糖凝膠對堿比較穩(wěn)定，在酸性環(huán)境中其糖苷鍵易水解 濕態(tài)的葡聚糖可加熱到110，干的則能耐受120高溫葡聚糖凝膠（ Sephadex ）葡聚糖凝膠G10 700 葡聚糖凝膠G15 1500 葡聚糖凝膠G25 1000-5000 葡聚糖凝膠G50 1000-30,000 第37頁，共98頁，2022年，5月20日，8點27分，星期四 瓊脂糖凝膠是由瓊脂中分離出來的天然凝膠，常見的有Sepharose（ Sepharose 2B、4B、6B）。瓊脂糖凝膠 當溫度高于50時瓊脂糖凝膠便融化，只能在較低的溫度下使用。 瓊脂糖凝膠是一種大孔凝

17、膠，因而適合于分離分子量較大的生物大分子物質(zhì)（如蛋白質(zhì)和DNA）。第38頁，共98頁，2022年，5月20日，8點27分，星期四 聚丙烯酰胺凝膠是一種以丙烯酰胺為單位由甲叉雙丙烯酰胺交聯(lián)而成的人工合成凝膠，控制交聯(lián)劑的用量可制成各種型號的凝膠，交聯(lián)劑越多，孔隙越小。 聚丙烯酰胺凝膠的商品名為Bio-Gel，型號從P-2至P-300共10種聚丙烯酰胺凝膠第39頁，共98頁，2022年，5月20日，8點27分，星期四凝膠介質(zhì)的選用原則 將樣品中的大分子物質(zhì)與小分子物質(zhì)分開，稱為組別分離，其分離策略是使高分子物質(zhì)完全被排阻，小分子物質(zhì)完全滲入凝膠內(nèi)。 組別分離一般選用Sephadex G-25或G-

18、50，對于小肽和低分子量的物質(zhì)（分子量范圍1000-5000）的脫鹽可選用Sephadex G-10、G-組別分離15、Bio-Gel P-2或P-4第40頁，共98頁，2022年，5月20日，8點27分，星期四 將樣品中一些分子量比較接近的物質(zhì)分開，這種分離叫分級分離 分級分離一般選用排阻限度略大于樣品中最高分子量物質(zhì)的凝膠。在層析過程中，樣品中各組份均能不同程度地深入到凝膠內(nèi)部，但由分級分離于深入凝膠空隙程度上的差異，最后得到分離。第41頁，共98頁，2022年，5月20日，8點27分，星期四凝膠層析的基本操作平衡溶液的流速應(yīng)低于層析時需要的流速注意凝膠的斷層和氣泡層析柱平衡操作壓控制平衡

19、和洗脫時應(yīng)維持流速恒定第42頁，共98頁，2022年，5月20日，8點27分，星期四上柱樣品溶液的體積根據(jù)分離要求來確定：進樣體積進行組別分離時，樣品溶液最大可為柱體積的10%進行分級分離時，樣品溶液的體積要小，使樣品層盡可能窄，這樣洗脫出的峰形好第43頁，共98頁，2022年，5月20日，8點27分，星期四3. 親和層析親和層析的基本概念親和層析載體的性質(zhì)與選擇親和層析配基的性質(zhì)與選擇親和層析的基本操作第44頁，共98頁，2022年，5月20日，8點27分，星期四親和層析的基本概念 親和層析是利用待分離物質(zhì)與其特異性配體之間特異性的親和力進行分離的一類特殊的層析技術(shù)，它有如下特點：純化過程簡

20、單、迅速，且分離效率高特別適用于分離純化一些含量低、穩(wěn)定性差的生物大分子親和層析的基本特點純化倍數(shù)大，產(chǎn)物純度高必須針對某一分離對象制備專一的配基及尋求穩(wěn)定的層析條件因此應(yīng)用范圍受到一定的限制第45頁，共98頁，2022年，5月20日，8點27分，星期四抗原與抗體DNA與互補DNA或RNA（cDNA、mRNA)酶與其底物、競爭性抑制劑、輔酶因子激素或藥物與其受體具有特異性親和作用的生物分子維生素于其特異性結(jié)合蛋白糖蛋白與其相應(yīng)的植物凝集素第46頁，共98頁，2022年，5月20日，8點27分，星期四親和的一對分子中的一方以共價鍵形式與不溶性載體相連作為固定相吸附劑當含有混合組份的樣品（流動相）

21、通過此固定相時，只有和固定相分子有特異親和力的物質(zhì)，才能被固定相吸附結(jié)親和層析的基本原理合，其它沒有親和力的無關(guān)組份就隨流動相流出然后改變流動相成份，將結(jié)合的親和物洗脫下來第47頁，共98頁，2022年，5月20日，8點27分，星期四親和層析（affiuity chromatography）應(yīng)用 分離純化酶、 抗原、抗體 分離純化核酸 研究酶的結(jié)構(gòu)與功能+待純化分子配體a. 理論依據(jù)：待純化分子和配體間具有親和性+基質(zhì)b. 活性基質(zhì)與配體結(jié)合產(chǎn)生親和吸附劑+雜質(zhì)c. 待純化分子與親和吸附劑結(jié)合，與雜質(zhì)分離+d. 偶聯(lián)復(fù)合物經(jīng)解離后，得到純的待純化分子原理：基質(zhì) 纖維素、聚丙烯酰胺凝膠、 sep

22、harose、sephadex第48頁，共98頁，2022年，5月20日，8點27分，星期四親和層析原理示意圖蛋白質(zhì)混合物配體與配體結(jié)合的蛋白質(zhì)加入的可溶性配基專一性結(jié)合蛋白質(zhì)沒有結(jié)合的蛋白質(zhì)非專一性結(jié)合蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)濃度洗脫體積與配體專一性結(jié)合蛋白質(zhì)加入配基基質(zhì)第49頁，共98頁，2022年，5月20日，8點27分，星期四親和層析載體的性質(zhì)與選擇具有多孔的立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，能使被親和吸附的大分子自由通過具有良好機械性能的均勻珠狀顆粒，具有良好的流速親和層析載體的選擇具有惰性，盡量減少非專一性吸附具有相當量的易活化的基團，在溫和的條件下能與配基共價合偶聯(lián)在偶聯(lián)、吸附和洗脫時，有較好的物理化學穩(wěn)定性第

23、50頁，共98頁，2022年，5月20日，8點27分，星期四纖維素葡聚糖凝膠 常用的親和層析載體瓊脂糖凝膠 聚丙烯酰胺凝膠其它新型載體 第51頁，共98頁，2022年，5月20日，8點27分，星期四純化對象和配基之間必須有較強的親和力但親和力太高也是有害的，因為在解離配基復(fù)合物時所需的親和層析配基的選擇條件就要強烈，這樣可能使生物分子變性配基必須具有適當?shù)幕瘜W基團，這種基團不參與配基與生物分子之間特異結(jié)合，但可用于和載體相連，同時又不影響配基與生物分子之間的親和力第52頁，共98頁，2022年，5月20日，8點27分，星期四酸酐法N-取代羥基琥珀酰亞胺法配基的偶聯(lián)疊氮化作用還原性烷基化合物（西

24、夫堿）的形成第53頁，共98頁，2022年，5月20日，8點27分，星期四親和層析的基本操作通常采用改變pH、離子強度、離子種類或者溫度等，降低其親和力。非專一性洗脫化的配基對相應(yīng)的生物大分子的親和力降低非專一性洗脫劑的作用并不是使被吸附的生物大分子的構(gòu)象發(fā)生變化，而是洗脫劑中的某一組分與固定配基形成復(fù)合物，使固定第54頁，共98頁，2022年，5月20日，8點27分，星期四使用特異的配基作為洗脫劑 溶液為洗脫劑，通過與親和配基或目標產(chǎn)物的競爭性結(jié)合來洗專一性洗脫使用含有與親和配基或目標產(chǎn)物具有親和作用的小分子化合物 脫目標產(chǎn)物第55頁，共98頁，2022年，5月20日，8點27分，星期四 親

25、和雙方吸附能力很強，可以用專一的化學方法裂解配基與載特殊性洗脫體的連接鍵，獲得的配基-蛋白絡(luò)合物后，再除去配基。第56頁，共98頁，2022年，5月20日，8點27分，星期四4. 膜分離膜分離的基本原理分離膜的主要性能影響膜分離的因素第57頁，共98頁，2022年，5月20日，8點27分，星期四膜分離的基本原理 膜分離是利用膜的選擇性，以膜的兩側(cè)存在一定量的能量差作為膜分離的基本定義推動力，由于溶液中各組分透過膜的遷移速率不同而實現(xiàn)的分離。依據(jù)濾膜孔徑和物質(zhì)粒子的大小而達到物質(zhì)分離的目的第58頁，共98頁，2022年，5月20日，8點27分，星期四分離效率高膜分離的特點不涉及相變，能耗低，運行

26、成本低膜分離為單純物理變化，無二次污染第59頁，共98頁，2022年，5月20日，8點27分，星期四分離膜的選擇通透性：是物質(zhì)分離的第一機制膜分離過程的重要參數(shù)膜分離過程的推動力：靜壓力差、濃度差、電位差物質(zhì)通過分離膜的速度：是物質(zhì)分離的第二機制第60頁，共98頁，2022年，5月20日，8點27分，星期四 根據(jù)分離膜膜內(nèi)平均孔徑、推動力和傳遞機制不同，膜分離可膜分離的主要類型反滲透（Reverse osmosis RO）透析（Dialysis DS）分成下列幾類：超濾（Uitrfiltration UF）微濾（Microfitration MF）電滲析（Electrodialysis EI）

27、第61頁，共98頁，2022年，5月20日，8點27分，星期四透析半透膜袋蛋白質(zhì)溶液透析液磁棒 磁力攪拌器 透析是利用蛋白質(zhì)等大分子不能通過半透膜的性質(zhì)，使蛋白質(zhì)和其它小分子物質(zhì)如無機鹽單糖等分開。常用的半透膜： 玻璃紙（賽璐玢紙，cellophane paper） 火綿紙（賽璐玎紙, celloidin paper） 其他改型纖維素材料第62頁，共98頁，2022年，5月20日，8點27分，星期四按照分子大小進行分離。分離取決于透析袋截留的分子量。透析液濃縮的蛋白混合樣品 透析袋 開始透析處于平衡狀態(tài)第63頁，共98頁，2022年，5月20日，8點27分，星期四反滲透（Reverse osm

28、osis RO） 反滲透其主要原理是在高于溶液滲透壓的作用下，使其它物質(zhì)溶解鹽類、膠體、微生物、熱源、有機物等，因而主要用于海水、不能透過半透膜，而將這些物質(zhì)與水分離開來，有效地去除水中的苦咸水淡化和產(chǎn)純水制備等方面第64頁，共98頁，2022年，5月20日，8點27分，星期四超濾（Uitrfiltration UF） 超濾是一種根據(jù)高分子溶質(zhì)之間或高分子與小分子溶質(zhì)之間相相應(yīng)的截留分子量范圍從500到100萬左右。對分子質(zhì)量的差別進行分離的方法。篩分孔徑范圍1 nm - 0.1 mm，第65頁，共98頁，2022年，5月20日，8點27分，星期四超濾第66頁，共98頁，2022年，5月20日

29、，8點27分，星期四分離膜的基本性能 分離膜是膜分離技術(shù)的核心，分離膜的性能主要包括分離透過性、耐酸堿性、抗氧化性、抗微生物降解性、親水性、疏水性、電性能和化學物理性能兩部分。其中，化學物理性能主要涉及到耐熱性能、毒性、機械強度等。膜的化學物理性能第67頁，共98頁，2022年，5月20日，8點27分，星期四微濾膜0.025 - 14 mm反滲透膜0.0001 - 0.001 mm超濾膜0.001 - 0.02 mm納米過濾膜平均孔徑 2 nm膜的分類按膜的孔徑大小分類：第68頁，共98頁，2022年，5月20日，8點27分，星期四對稱性膜膜截面上的孔道結(jié)構(gòu)均勻不對稱性膜由表面活性層（超薄層）

30、和惰性層（支撐層）構(gòu)成按膜的結(jié)構(gòu)分類：傳質(zhì)阻力大，透過通量低，易污染、難清洗傳質(zhì)阻力小，透過通量高，被廣泛使用第69頁，共98頁，2022年，5月20日，8點27分，星期四天然高分子膜 醋酸纖維素、硝酸纖維素、再生纖維素合成聚合物膜 聚砜、聚酰胺、聚烯、含氟聚合物按膜的材料分類：無機材料膜 陶瓷、微孔玻璃、不銹鋼、碳素第70頁，共98頁，2022年，5月20日，8點27分，星期四影響膜分離的因素影響膜分離效率的主要因素是膜的污染，其表現(xiàn)形式是：溶質(zhì)在膜孔內(nèi)吸附造成膜污染的主要原因是：蛋白質(zhì)在不同pH條件下所帶電荷對膜電荷的相互作用無機鹽通過形成復(fù)合物、改變?nèi)芤弘x子強度等機制污染膜溶質(zhì)在膜表面沉

31、淀或結(jié)晶膜分離過程中體系的粘度增大會污染膜第71頁，共98頁，2022年，5月20日，8點27分，星期四 三、 基因重組蛋白包涵體的分離和復(fù)性第72頁，共98頁，2022年，5月20日，8點27分，星期四外源基因在大腸桿菌中的表達形式位于細胞質(zhì)細胞周質(zhì)細胞外表達產(chǎn)物形式包涵體蛋白融合蛋白整合型外源蛋白分泌型外源蛋白第73頁，共98頁，2022年，5月20日，8點27分，星期四細胞質(zhì)中表達: 外源基因在大腸桿菌寄主細胞質(zhì)中高效表達時，常會發(fā)生一種特殊的生理現(xiàn)象，形成包涵體。 包涵體：存在于細胞質(zhì)中的一種由不可溶性蛋白質(zhì)聚集折疊而成的晶體結(jié)構(gòu)物。第74頁，共98頁，2022年，5月20日，8點27

32、分，星期四包涵體表達形式的優(yōu)點 在一定程度上保持表達產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定 能夠避免細胞內(nèi)蛋白水解酶的作用，有利于目標蛋白的富集 簡化外源基因表達產(chǎn)物的分離操作 包涵體的水難溶性及其密度遠大于其它細胞碎片和細胞成分，菌 體經(jīng)超聲波裂解后，直接通過高速離心即可將重組異源蛋白從細 菌裂解物中分離出來 能夠表達對大腸桿菌宿主有毒或有致死效應(yīng)的目標蛋白。第75頁，共98頁，2022年，5月20日，8點27分，星期四包涵體表達形式的缺點 以包涵體形式表達的重組蛋白喪失了原有的生物活性，必須通過 有效的變性復(fù)性操作，才能得到有正確空間構(gòu)象的目標蛋白。 體外復(fù)性蛋白質(zhì)的成功率相當?shù)?，一般不超過 30% 復(fù)性處理工藝

33、可使目標蛋白的制備成本上升。第76頁，共98頁，2022年，5月20日，8點27分，星期四包涵體直徑約0.5-1m，具有很高的密度（約1.3 mg/ml），相差顯微鏡下有折光性，呈非水溶性，只溶于高濃度變性劑如尿素、鹽酸胍等。 第77頁，共98頁，2022年，5月20日，8點27分，星期四包涵體加工流程離 心去除細胞碎片（ 膜蛋白和脂類等）機械破碎法包涵體提取如何對包涵體蛋白進行高效體外復(fù)性以獲得活性產(chǎn)品是生物工程產(chǎn)業(yè)化經(jīng)常面臨的一個難題第78頁，共98頁，2022年，5月20日，8點27分，星期四包涵體的洗滌為除去包涵體上粘附的雜質(zhì)，應(yīng)用洗滌液洗滌包涵體沉淀常用去污劑Triton X-l00

34、或脫氧膽酸鈉和低濃度變性劑（如2mol/L尿素或鹽酸胍等，洗滌以除去脂類和膜蛋白。如：50mM Tris-HCl， pH7.0-8.5， 2M尿素，1mM EDTA第79頁，共98頁，2022年，5月20日，8點27分，星期四包涵體的溶解大多數(shù)在pH8的條件下，用強變性劑如8mol/L尿素、 6mol/L鹽酸胍，打斷包涵體蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間的各種化學鍵，使多肽伸展對于含有S-S的蛋白質(zhì)，分離的包涵體中通常含有一些鏈間形成的二硫鍵和鏈內(nèi)的非活性二硫鍵為將包涵體充分溶解，需加入還原劑（如二硫蘇糖醇 DTT、GSH、巰基乙醇 -ME）打開蛋白質(zhì)中所有二硫鍵，一般是50-100mM -ME或DTT（

35、對于目標蛋白沒有二硫鍵的有時也應(yīng)使用還原劑，因為含S-S的雜蛋白會影響包涵體的溶解）同時還應(yīng)加入金屬螯合劑，如EDTA，用來螯合Cu2+、Fe3+等金屬離子，防止已經(jīng)處于還原狀態(tài)的SH-與之發(fā)生氧化反應(yīng)。 包涵體溶解后，蛋白質(zhì)成為失去了生物學活性伸展肽鏈 第80頁，共98頁，2022年，5月20日，8點27分，星期四蛋白質(zhì)復(fù)性機理蛋白質(zhì)復(fù)性過程中，涉及兩種疏水相互作用：一是分子內(nèi)的疏水相互作用促使蛋白質(zhì)正確折疊二是肽鏈分子間的疏水相互作用導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子間聚集，形成寡聚體和多聚體再進一步聚集形成沉淀兩者互相競爭，影響蛋白質(zhì)復(fù)性收率。復(fù)性過程中，抑制肽鏈間的疏水相互作用以防止聚集，是提高復(fù)性收率的

36、關(guān)鍵。伸展態(tài)U中間體I局部肽段先由氫鍵形成一些二級結(jié)構(gòu)構(gòu)象單元，如螺旋、折疊、轉(zhuǎn)角等聚集體A天然態(tài)N快慢第81頁，共98頁，2022年，5月20日，8點27分，星期四一般說來，在優(yōu)化的條件下，大多數(shù)蛋白質(zhì)體外復(fù)性效率在20%左右 第82頁，共98頁，2022年，5月20日，8點27分，星期四復(fù)性常用方法1. 稀釋復(fù)性： 直接加入水或復(fù)性緩沖液，缺點是體積增加較大，后續(xù)處理困難。第83頁，共98頁，2022年，5月20日，8點27分，星期四 2.透析復(fù)性：好處是不增加體積，通過逐漸降低外透液濃度來控制變性劑去除速度，速度慢，不適合大規(guī)模操作。 3. 超濾復(fù)性：選擇合適載留分子量的膜，允許變性劑通過膜而蛋白質(zhì)通不過。缺點是不適合樣品量較少的情況，且有些蛋白可能在超濾過程中不可逆的變性（蛋白聚集于膜上）。第84頁，共98頁，2022年，5月20日，8點27分，星期四4. 色譜復(fù)性：兼具分離。4.1 凝膠過濾復(fù)性：該法可以起到一定的抑制凝集作用，并且在凝膠過濾中脲等變性劑脫除得相對較慢，對有些蛋白質(zhì)的復(fù)性有利。第85頁，共98頁，2022年，5月20日，8點27分，星期四4.2吸附型層析復(fù)性：原理是層析柱平衡后，將變性蛋白上樣并吸附在凝膠介質(zhì)上，然后用清洗緩沖液洗掉未吸附的變性劑和雜蛋白，最后用復(fù)性緩沖液將吸附的蛋