宏基因組學(xué)課件

1、 宏基因組學(xué)通過(guò)直接從環(huán)境樣品中提取全部微生物的 DNA,構(gòu)建宏基因組文庫(kù),利用基因組學(xué)的研究策略研究環(huán)境樣品所包含的全部微生物的遺傳組成及其群落功能。 宏基因組學(xué)通過(guò)直接從環(huán)境樣品中 宏基因組學(xué)研究已滲透到各個(gè)領(lǐng)域,包括海洋、 土壤、 熱液口、 熱泉、 人體口腔及胃腸道等,并在醫(yī)藥、 替代能源、 環(huán)境修復(fù)、 生物技術(shù)、 農(nóng)業(yè)、生物防御及倫理學(xué)等各方面顯示了重要的價(jià)值。 宏基因組學(xué)研究已滲透到各個(gè)領(lǐng)域,包括海洋、 土壤、 熱宏基因組學(xué) 也稱微生物環(huán)境基因組學(xué), 環(huán)境基因組學(xué)，元基因組學(xué),生態(tài)基因組學(xué)。 環(huán)境基因組學(xué)建立在對(duì)疾病病因認(rèn)識(shí)的基礎(chǔ)上 ,深入探討環(huán)境脅迫 - 基因、 基因- 基因間交互

2、作用。其目標(biāo)是研究環(huán)境脅迫對(duì)機(jī)體遺傳變異的過(guò)程和機(jī)理 ,包括發(fā)掘環(huán)境應(yīng)激和應(yīng)答基因的多態(tài)性 ,探究這些多態(tài)性基因的功能及其與患病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系 ,其與毒理基因組學(xué)密切相關(guān) ,是在人類(lèi)基因組基礎(chǔ)上發(fā)展的功能基因組學(xué)內(nèi)容之一。宏基因組學(xué) 環(huán)境基因組學(xué)建立在對(duì)疾病病因認(rèn)識(shí)的基礎(chǔ)上 ,為什么要研究宏基因組學(xué)呢？99%以上的微生物未 (難 )被純培養(yǎng), 對(duì)微生物世界的認(rèn)識(shí)集中在不到1%的微生物上人們對(duì)微生物的認(rèn)識(shí)主要基于實(shí)驗(yàn)室純培養(yǎng)的單一微生物物種,對(duì)微生物群落作為整體的功能的認(rèn)識(shí)遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于對(duì)其個(gè)體的認(rèn)識(shí)為什么要研究宏基因組學(xué)呢？99%以上的微生物未 (難 )被純宏基因組學(xué)課件環(huán)境基因組學(xué)的研究方法 以基因

3、組學(xué)技術(shù)為依托 主要的程序包括: 1、從環(huán)境樣品 (例如土壤 )中直接提取 DNA; 2、將 DNA克隆到合適的載體中; 3、將載體轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)菌建立環(huán)境基因組文庫(kù); 4、對(duì)得到的環(huán)境基因組文庫(kù)進(jìn)行分析和篩選。 環(huán)境基因組學(xué)的研究方法 宏基因組學(xué)課件由于環(huán)境基因組的高度復(fù)雜性 ,需要通過(guò)高通量和高靈敏度的方法來(lái)篩選和鑒定文庫(kù)中的有用基因。篩選技術(shù)大致可分為4類(lèi): 第 1類(lèi)基于核酸序列差異分析 (序列驅(qū)動(dòng) )； 第 2類(lèi)基于克隆子的特殊代謝活性 (功能驅(qū)動(dòng) )； 第 3類(lèi)基于底物誘導(dǎo)基因的表達(dá) ； 第 4類(lèi)基于包括穩(wěn)定性同位素和熒光原位雜交在內(nèi)的其它技術(shù)。由于環(huán)境基因組的高度復(fù)雜性 ,需要通過(guò)高

4、通量和高靈敏度的方法序列分析法 需要根據(jù)已知的基因和基因表達(dá)產(chǎn)物的保守序列設(shè)計(jì)引物和探針，PCR是序列分析中最常用的技術(shù)。對(duì)鑒定新的基因成員有一定的局限性 ,但它已被有效地用于鑒定系統(tǒng)發(fā)育學(xué)中的標(biāo)志基因(如 16S rRNA基因 )和帶有高度保守域的酶基因(如聚酮化合物合成酶、 葡萄糖酸還原酶和腈水合酶等 ) 。序列分析法 需要根據(jù)已知的基因和基因表達(dá)產(chǎn)物的保守序列設(shè)計(jì)引序列分析法微序列技術(shù) (Micr oarray)采用集約化和平面處理原理 ,在微小片基上高密度而有序地排列大量基因片段、 EST或寡核苷酸片段 ,從而形成 DNA微矩陣 ,又稱基因芯片。 焦磷酸測(cè)序技術(shù)( Pyrosequen

5、cing) 是在焦磷酸鹽測(cè)序法的基礎(chǔ)上結(jié)合一種乳膠材料和皮升級(jí)反應(yīng)孔 ,將基因組 DNA進(jìn)行隨機(jī)切割 ,批量地進(jìn)行整個(gè)測(cè)序反應(yīng)，能夠在相同的時(shí)間內(nèi)破譯 6 106組以上的基因組序列 ,比 Sanger法要快100倍 ,提高了測(cè)序的效率。序列分析法微序列技術(shù) (Micr oarray)采用集約化和焦磷酸測(cè)序技術(shù)由4種酶催化的同一反應(yīng)體系中的酶級(jí)聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。原理：引物與模板DNA退火后，在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和三磷酸腺苷雙磷酸酶4種酶的協(xié)同作用下，將引物上每一個(gè)dNTP的聚合與一次熒光信號(hào)的釋放偶聯(lián)起來(lái)，通過(guò)檢測(cè)熒光的釋放和強(qiáng)度，達(dá)到實(shí)時(shí)測(cè)定DNA序列的目的。焦磷酸測(cè)序技術(shù)的

6、反應(yīng)體系由反應(yīng)底物、待測(cè)單鏈、測(cè)序引物和4種酶構(gòu)成。反應(yīng)底物為5-磷酰硫酸、熒光素。焦磷酸測(cè)序技術(shù)由4種酶催化的同一反應(yīng)體系中的酶級(jí)聯(lián)化學(xué)發(fā)光反反應(yīng)過(guò)程脫氧核苷酸三磷酸(dNTP) DNA聚合酶（能和DNA模板的下一個(gè)堿基配對(duì)） 添加到測(cè)序引物的3末端 （釋放） 焦磷酸(PPi) ATP硫酸化酶加入 APS 特異的檢測(cè)峰 （微弱光檢測(cè)） ATP氧化熒光素（產(chǎn)生可見(jiàn)光） 加入熒光素反應(yīng)過(guò)程脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)宏基因組學(xué)課件序列分析法鳥(niǎo)槍法測(cè)序 ( Shotgun sequencing) 將一條完整的目標(biāo)序列隨機(jī)打斷成小的片段 ,分別測(cè)序 ,然后利用計(jì)算機(jī)根據(jù)序列間的重疊關(guān)系進(jìn)行排序和重新

7、組裝, 并確定它們?cè)诨蚪M中的正確位置 。序列分析法鳥(niǎo)槍法測(cè)序 ( Shotgun sequencin優(yōu)點(diǎn)：為篩選新的天然產(chǎn)物提供了一種可選擇的途徑, 從中挖掘上百萬(wàn)個(gè)新基因,揭示不可培養(yǎng)微生物的代謝途徑.缺點(diǎn)：耗費(fèi)大,需大量人力和物力。與個(gè)體微生物基因相比,對(duì)序列片段進(jìn)行分析則極為困難。優(yōu)點(diǎn)：為篩選新的天然產(chǎn)物提供了一種可選擇的途徑, 從中挖掘上功能篩選法方法一：對(duì)具有特殊功能的克隆子進(jìn)行直 接檢測(cè) ；方法二：基于異源基因的宿主菌株與其突 變體在選擇性條件下功能互補(bǔ)生 長(zhǎng)的特性進(jìn)行。功能篩選法方法一：對(duì)具有特殊功能的克隆子進(jìn)行直 功能篩選法以活性測(cè)定為基礎(chǔ) ,通過(guò)建立和優(yōu)化合適的方法從基因組

8、文庫(kù)中獲得具有特殊功能的克隆.依賴于功能基因或編碼功能蛋白在外源宿主中的表達(dá) 。功能篩選法以活性測(cè)定為基礎(chǔ) ,通過(guò)建立和優(yōu)化合適的方法從基因底物誘導(dǎo)基因表達(dá)法 代謝相關(guān)基因或酶基因往往在有底物存在的條件下才表達(dá) ,反之則不表達(dá) ,SIGEX即利用這個(gè)原理來(lái)篩選目的代謝基因。底物誘導(dǎo)基因表達(dá)法 代謝相關(guān)基因或酶基因往往在有底物存底物誘導(dǎo)基因表達(dá)法第一步：以 p18GFP為載體構(gòu)建宏基因組文庫(kù)；第二步：在無(wú)底物情況下以異丙基 2 D硫代半乳糖苷 ( IPTG)為誘導(dǎo)物去除陰性克隆和綠色熒光蛋白 基因 ( gfp)表達(dá)的克隆子； 第三步：在培養(yǎng)基中添加底物誘導(dǎo)代謝關(guān)基因的表達(dá)；第四步：根據(jù) gfp基

9、因的表達(dá)從宏基因克隆庫(kù)中篩選出表 達(dá)代謝基因的克隆子 ,利用熒光激活細(xì)胞分離儀 ( FACS)從瓊脂培養(yǎng)平板上將GFP表達(dá)的克隆子分 離出來(lái)。底物誘導(dǎo)基因表達(dá)法第一步：以 p18GFP為載體構(gòu)建宏基因組穩(wěn)定性同位素標(biāo)記技術(shù) 通過(guò) SIP實(shí)驗(yàn)使參與特定代謝過(guò)程 (例如甲烷氧化 )的生物基因組富集 ,克隆從 SIP實(shí)驗(yàn)中獲得的13C標(biāo)記的核酸 ,從而構(gòu)建一個(gè)因吸收了特定的基質(zhì)而在環(huán)境中執(zhí)行特定代謝功能的微生物宏基因組文庫(kù) ,這極大地減少了需要篩選的克隆數(shù)量。穩(wěn)定性同位素標(biāo)記技術(shù) 通過(guò) SIP實(shí)驗(yàn)使參與特定代謝過(guò)程 (應(yīng)用和研究現(xiàn)狀應(yīng)用和研究現(xiàn)狀水體宏基因組學(xué)海表層水樣 為研究海洋生命的代謝潛力和海

10、洋生態(tài)學(xué)提供了前所未有的原始素材；海洋蘊(yùn)藏著巨大的生物多樣性和復(fù)雜性 ,宏基因組學(xué)研究將大大促進(jìn)人們對(duì)它的認(rèn)識(shí)。極端環(huán)境水體 (如酸性礦水、 深海 ) 由于其苛刻的物理化學(xué)條件,使得其中的微生物群落也較為獨(dú)特 ；利用環(huán)境基因組學(xué)對(duì)其開(kāi)展微生物生物群落結(jié)構(gòu)及生理代謝對(duì)環(huán)境變化響應(yīng)的研究 ,將促進(jìn)我們更好地理解這些極端環(huán)境生態(tài)系統(tǒng)并對(duì)其加以調(diào)控和利用。 水體宏基因組學(xué)海表層水樣土壤宏基因組學(xué)從土壤宏基因組文庫(kù)中獲得新編碼基因是該技術(shù)的主要功能所在 ,已發(fā)現(xiàn)的新基因主要有生物催化劑基因、 抗生素抗性基因以及編碼轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因 土壤宏基因組學(xué)技術(shù)最引人注目的貢獻(xiàn)是新生物催化劑的發(fā)現(xiàn) , 包括腈水解酶和淀粉酶( Rondon