基因表達分析的技術(shù)

1、關(guān)于基因表達分析技術(shù)第1頁，共81頁，2022年，5月20日，8點19分，星期四基因mRNA蛋白質(zhì)多肽鏈基因表達第2頁，共81頁，2022年，5月20日，8點19分，星期四一、通過檢測mRNA揭示基因轉(zhuǎn)錄水平的表達特征根據(jù)分析方法的原理和功能特性，可將基因表達分析分為:封閉性系統(tǒng)研究方法: 例如DNA微陣列、Northern印跡、實時RT-PCR等方法。只能研究已知的基因。開放性系統(tǒng)研究方法: 如差異顯示PCR、雙向基因表達指紋圖譜、分子索引法、隨機引物PCR指紋分析等，可以發(fā)現(xiàn)和分析未知的基因。這里主要針對已知基因的常用表達分析方法做一介紹。第3頁，共81頁，2022年，5月20日，8點19

2、分，星期四（一）基于雜交原理檢測mRNA的表達水平1Northern 印跡（Northern blot）是一種基于RNA-DNA雜交原理建立的一種RNA分析技術(shù)指將RNA變性及電泳分離后，并轉(zhuǎn)移到固相支持物上，用雜交反應來鑒定其中特定mRNA分子的含量及其大小。第4頁，共81頁，2022年，5月20日，8點19分，星期四三種印跡技術(shù)的比較第5頁，共81頁，2022年，5月20日，8點19分，星期四RNA瓊脂糖凝膠電泳3kb0.4 kbNt36382604623Northern blot hybridization28S18S第6頁，共81頁，2022年，5月20日，8點19分，星期四分子雜交實

3、驗第7頁，共81頁，2022年，5月20日，8點19分，星期四放射自顯影照片目 錄第8頁，共81頁，2022年，5月20日，8點19分，星期四2核糖核酸酶保護實驗（ribonuclease protection assay，RPA）是靈敏度和特異性很高的mRNA定量分析方法 基本原理 是將標記的特異RNA探針（32P或生物素）與待測的RNA樣品液相雜交，標記的特異RNA探針與目的RNA結(jié)合，形成雙鏈RNA，免受RNA酶的消化；而未結(jié)合的單鏈RNA經(jīng)RNA酶A或RNA酶T1消化形成寡核糖核酸。第9頁，共81頁，2022年，5月20日，8點19分，星期四RPA基本程序：待測RNA的分離體外轉(zhuǎn)錄標記

4、RNA探針待測RNA與探針RNA進行液相雜交 RNA酶消化不同大小雜交片段凝膠電泳分離第10頁，共81頁，2022年，5月20日，8點19分，星期四核糖核酸酶保護實驗原理示意圖32P標記的探針：雜交雙鏈進行變性PAGE， 用放射自顯影或磷屏成像系統(tǒng)檢測探針的信號；生物素標記的探針：雜交雙鏈經(jīng)過變性PAGE后，電轉(zhuǎn)移至尼龍膜，用鏈霉親和素辣根過氧化物酶和化學發(fā)光底物與膜上biotin標記的探針結(jié)合，X射線膠片或化學發(fā)光圖像分析儀檢測雜交信號。第11頁，共81頁，2022年，5月20日，8點19分，星期四RPA比Northern Blot的優(yōu)勢：1.過量的探針與目的基因的雜交在液相環(huán)境完成，反應更

5、加完全 2.RPA比Northern Blot靈敏15150倍，適合檢測各種表達水平之基因 3.RPA通量高，同時檢測多個基因，可評價他們在同一情況下的差異表達 4.一次RPA就能完成10 多次Northern Blot的工作，加快研究速度第12頁，共81頁，2022年，5月20日，8點19分，星期四可細胞或組織中原位表達的mRNA進行區(qū)域定位標記探針特異性地與目標靶mRNA序列雜交，檢測標記信號來確定基因在組織和細胞內(nèi)表達的區(qū)位信息?？勺鳛槎糠治龅难a充。3原位雜交（in situ hybridization，ISH）第13頁，共81頁，2022年，5月20日，8點19分，星期四原位雜交技術(shù)

6、主要步驟：材料處理及細胞樣品的固定；樣品的制備和預處理；探針的制備和預雜交；探針及樣品的變性；雜交溫育；檢測雜交信號，進行結(jié)果分析。第14頁，共81頁，2022年，5月20日，8點19分，星期四（二）RT-PCR常用的mRNA檢測方法1反轉(zhuǎn)錄PCR可用于mRNA的半定量分析 反轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription-PCR，RT-PCR） 它以mRNA為模板，體外擴增cDNA，再以cDNA為模板進行特定基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的PCR擴增。RT-PCR技術(shù)一般用于RNA的定性分析；如果設(shè)置陽性參照，則可對待測RNA樣品進行半定量分析。反轉(zhuǎn)錄實時定量PCR 第15頁，共81頁，2022年，5

7、月20日，8點19分，星期四逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶mRNAcDNA雜化雙鏈PCR擴增第16頁，共81頁，2022年，5月20日，8點19分，星期四PCR技術(shù)原理第17頁，共81頁，2022年，5月20日，8點19分，星期四5Primer 15Primer 2Cycle 2Cycle 155 55 5 5Template DNA55 555 5 55一、基本工作原理目 錄第18頁，共81頁，2022年，5月20日，8點19分，星期四Cycle 355 555 5 555 5 55 555 52530 次循環(huán)后，模板DNA的含量可以擴大100萬倍以上。目 錄第19頁，共81頁，2022年，5月20日，8點

8、19分，星期四模板DNA 特異性引物耐熱DNA聚合酶 dNTPs Mg2+ PCR體系基本組成成分第20頁，共81頁，2022年，5月20日，8點19分，星期四PCR的基本反應步驟變性95C延伸72C退火Tm-5C第21頁，共81頁，2022年，5月20日，8點19分，星期四實驗儀器電泳儀第22頁，共81頁，2022年，5月20日，8點19分，星期四瓊脂糖凝膠電泳槽第23頁，共81頁，2022年，5月20日，8點19分，星期四PCR儀第24頁，共81頁，2022年，5月20日，8點19分，星期四PCR反應PCR反應條件PCR過程PCR的特點第25頁，共81頁，2022年，5月20日，8點19分

9、，星期四實驗結(jié)果PCR結(jié)果。1、對照(無模板)；26、PCR產(chǎn)物（5ul樣品）第26頁，共81頁，2022年，5月20日，8點19分，星期四凝膠成像系統(tǒng)第27頁，共81頁，2022年，5月20日，8點19分，星期四Target AmplificationNo. ofNo. Amplicon CyclesCopies of Target122438416532664201,048,576301,073,741,8241 cycle = 2 Amplicon2 cycle = 4 Amplicon3 cycle = 8 Amplicon4 cycle = 16 Amplicon5 cycle =

10、32 Amplicon6 cycle = 64 Amplicon7 cycle = 128 Amplicon第28頁，共81頁，2022年，5月20日，8點19分，星期四常規(guī)PCR方法的局限性分析：無法對起始模板準確定量,只能對終產(chǎn)物進行分析必須在擴增后用電泳方法分析,費時費力而且EB有毒無法對擴增反應實時檢測第29頁，共81頁，2022年，5月20日，8點19分，星期四2、實時熒光定量PCR （real-time PCR）第30頁，共81頁，2022年，5月20日，8點19分，星期四非特異性的嵌入熒光染料 （Non-specific DNA binding dyes）SYBR Green I

11、SYBR GoldEthidium Bromide 第31頁，共81頁，2022年，5月20日，8點19分，星期四Extension53535353Extension ContinuedApply ExcitationWavelength535355TaqTaq353TaqTaq55RepeatDNA binding dyesBDBDBDBDBDBDBDBDBDBDlllll第32頁，共81頁，2022年，5月20日，8點19分，星期四實時PCR技術(shù)原理目 錄第33頁，共81頁，2022年，5月20日，8點19分，星期四非特異性的嵌入熒光染料評價優(yōu)點：與特異性的熒光探針相比價格便宜 只需要設(shè)計

12、PCR引物缺點：由于它和模板的結(jié)合是非特異性 的，它可以和所有的雙鏈DNA包括引物和非特異性擴增產(chǎn)物結(jié)合，不能真實反映目 的基因的擴增情況。第34頁，共81頁，2022年，5月20日，8點19分，星期四TaqMan探針 評價優(yōu)點：熒光信號強 與其它探針相比設(shè)計簡單 可用于多通道檢測 可用于SNP的檢測缺點：比DNA結(jié)合染料價格高第35頁，共81頁，2022年，5月20日，8點19分，星期四Ct value and Real-Time Quantitative PCR TheoryCt值（Threshold Cycle） PCR擴增過程中，擴增產(chǎn)物熒光信號超過基線值（進入指數(shù)增長期）時的循環(huán)數(shù)。

13、第36頁，共81頁，2022年，5月20日，8點19分，星期四 模板起始濃度越高，Ct值越小 Ct值與模板起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系Ct值與模板起始濃度的關(guān)系 如果模板濃度增加1倍，Ct值就提前1個循環(huán)到達 如果模板濃度減少1倍，Ct值就滯后1個循環(huán)到達第37頁，共81頁，2022年，5月20日，8點19分，星期四絕對定量可以得到某個樣本中基因的拷貝數(shù)和濃度 利用已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標代表Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。第38頁，共81頁，2022年，5月20日，8點19分，星期四第39頁

14、，共81頁，2022年，5月20日，8點19分，星期四 3、原位PCR技術(shù)第40頁，共81頁，2022年，5月20日，8點19分，星期四原位 原位聚合酶鏈式反應（In Still PCR,IsPCR）是由Haase等于1990年首創(chuàng)。它是利用完整的細胞作為一個微小的反應體系來擴增細胞內(nèi)的目的片段,在不破壞細胞的前提下,利用一些特定的檢測手段來檢測細胞內(nèi)的擴增產(chǎn)物。 直接用細胞涂片或石蠟包埋組織切片在單個細胞中進行擴增?？蛇M行細胞內(nèi)定位。 適用于檢測病理切片中含量較少的靶序列第41頁，共81頁，2022年，5月20日，8點19分，星期四16塊載玻片及24個0.2ml管的樣品block 第42頁，

15、共81頁，2022年，5月20日，8點19分，星期四第43頁，共81頁，2022年，5月20日，8點19分，星期四操作步驟1. 細胞或組織固定：細胞經(jīng)固定和乙醇通透化處理后便適于一般PCR試劑（包括引物和Taq酶）2. PCR擴增細胞內(nèi)目的片段3. 原位雜交檢測擴增產(chǎn)物A.陽性對照B.陰性對照C.原位檢測mRNA表達第44頁，共81頁，2022年，5月20日，8點19分，星期四DNA芯片(DNA chip) cDNA芯片(cDNA chip)是指將許多特定的DNA片段或cDNA片段作為探針，有規(guī)律地緊密排列固定于單位面積的支持物上 。4、基因芯片分析基因表達譜（高通量地分析基因表達）基因芯片(

16、gene chip)第45頁，共81頁，2022年，5月20日，8點19分，星期四目 錄第46頁，共81頁，2022年，5月20日，8點19分，星期四二、通過蛋白質(zhì)檢測揭示基因 翻譯水平的表達特征 Western印跡（Western blot）是一種免疫印跡技術(shù)，其基本原理與核酸分子雜交相似，只是以偶聯(lián)標記物的抗體分子作為探針，檢測轉(zhuǎn)移到固相支持物上的蛋白質(zhì)/多肽分子。當在蛋白質(zhì)水平上檢測特定基因的表達活性時，最常用的方法就是利用Western印跡對細胞或組織的總蛋白質(zhì)中的特異蛋白質(zhì)進行定性和半定量分析。（一）采用特異抗體經(jīng)Western印跡可直接 測定基因編碼多肽第47頁，共81頁，2022

17、年，5月20日，8點19分，星期四蛋白質(zhì)樣品的制備SDS分離蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜特異抗體（即第一抗體）與膜上的蛋白質(zhì)（抗原）印跡雜交再經(jīng)偶聯(lián)了可檢測標記信號的第二抗體（即抗抗體，商品試劑盒中多采用偶聯(lián)辣根過氧化物酶的Ig）最后經(jīng)與酶的底物反應而顯影、成像，經(jīng)掃描后獲取免疫印跡信息Western blot基本程序第48頁，共81頁，2022年，5月20日，8點19分，星期四第49頁，共81頁，2022年，5月20日，8點19分，星期四第50頁，共81頁，2022年，5月20日，8點19分，星期四第51頁，共81頁，2022年，5月20日，8點19分，星期四West Blot 第52頁，共81頁，2022年

18、，5月20日，8點19分，星期四受檢標本+固相載體表面的抗原或抗體起反應結(jié)合特異抗體（一抗）酶連接的第二抗體（也可預先包被抗體，“吸附”抗原），再進行酶-底物反應。反應后通過專門的酶標儀測定、記錄數(shù)據(jù)。（二）酶聯(lián)免疫吸附分析（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）第53頁，共81頁，2022年，5月20日，8點19分，星期四特點：1、具有特異性；2、靈敏度很高；3、穩(wěn)定、操作簡便，標本用量少，適于大規(guī)模篩查， 尤 其適用于檢測體液中微量的特異性抗體或抗原；4、既可以做定性試驗也可以做定量分析。 酶聯(lián)免疫吸附分析第54頁，共81頁，2022年，5月20日

19、，8點19分，星期四 免疫組織化學（immunohistochemistry）是利用標記的特異性抗體通過抗原-抗體反應和顯色反應，在組織或細胞原位檢測特定抗原（即目標蛋白質(zhì)）的方法，簡稱為免疫組化實驗。近年來由于熒光標記抗體的廣泛應用，這兩種方法又被統(tǒng)稱為免疫熒光法。（三）免疫組化實驗對組織/細胞 表達的蛋白質(zhì)進行原位檢測第55頁，共81頁，2022年，5月20日，8點19分，星期四第56頁，共81頁，2022年，5月20日，8點19分，星期四人皮膚角化細胞免疫熒光染色第57頁，共81頁，2022年，5月20日，8點19分，星期四（immunofluorescence），可應用熒光（倒置）顯微

20、鏡或激光共聚焦顯微鏡（confocal microscopy）對靶分子進行定性、定量和定位分析，激光共聚焦顯微鏡還可進行斷層成像，是在蛋白質(zhì)水平分析基因表達的直觀方法。其中抗體對于蛋白質(zhì)靶點的特異性、種間交叉反應、檢測系統(tǒng)的靈敏性以及細胞或組織的固定類型是該方法的關(guān)鍵因素。運用雙重著色或多重著色程序同時對多個感興趣的靶分子進行檢測，是一種揭示更多有關(guān)細胞群的功能和它們之間相互作用信息的有效方法。免疫組化主要是作為定性、定位的技術(shù)，若結(jié)合密度計量系統(tǒng)、圖像分析系統(tǒng)等測量工具也可以得到定量的數(shù)據(jù)。第58頁，共81頁，2022年，5月20日，8點19分，星期四 流式細胞術(shù)（flow cytometr

21、y）在細胞水平分析特定蛋白質(zhì)的基本原理也是抗原-抗體反應，它利用熒光標記抗體與抗原的特異性結(jié)合，經(jīng)過流式細胞儀分析熒光信號，從而根據(jù)細胞表達特定蛋白質(zhì)的水平對某種蛋白質(zhì)陽性細胞（即特異基因表達的細胞）作出判斷。（四）流式細胞術(shù)用于分析細胞 特異表達的蛋白質(zhì)第59頁，共81頁，2022年，5月20日，8點19分，星期四流式細胞術(shù)可以檢測活細胞，也可以檢測用甲醛固定的細胞。廣泛應用于細胞表面和細胞內(nèi)分子表達水平的定量分析，并能夠根據(jù)各種蛋白質(zhì)的表達模式區(qū)分細胞亞群。此外，流式細胞術(shù)可以使用多個熒光標記的抗體同時對多個基因產(chǎn)物進行標記和監(jiān)測，是對細胞進行快速分析、分選、特征鑒定的一種有效方法。第60

22、頁，共81頁，2022年，5月20日，8點19分，星期四是將具有高度親和特異性的探針分子（如單克隆抗體）固定在基片上，用以識別復雜生物樣品溶液中的目標多肽；蛋白質(zhì)功能芯片可用來研究蛋白質(zhì)修飾、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)/DNA-蛋白質(zhì)/RNA-蛋白質(zhì)，以及蛋白質(zhì)與脂質(zhì)、蛋白質(zhì)與藥物、酶與底物、小分子-蛋白質(zhì)等的相互作用（五）蛋白質(zhì)芯片分析蛋白質(zhì)表達譜（高通量地分析基因表達）蛋白質(zhì)芯片(protein chip)第61頁，共81頁，2022年，5月20日，8點19分，星期四蛋白質(zhì)檢測芯片包括:抗體芯片抗原芯片配體芯片等第62頁，共81頁，2022年，5月20日，8點19分，星期四 目前比較和鑒定蛋白質(zhì)表達譜

23、更多采用雙向電泳（two-dimensional electrophoresis, 簡稱2-D電泳）結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)。 原理: 根據(jù)蛋白質(zhì)分子的兩個屬性等電點和分子質(zhì)量將蛋白質(zhì)混合物進行分離。電泳結(jié)果經(jīng)染色后，即可對不同樣品中蛋白質(zhì)的表達譜進行比較；還可從凝膠中將特定的蛋白質(zhì)點切下，經(jīng)胰蛋白酶消化后得到短肽片段，利用質(zhì)譜（mass spectrum）技術(shù)進行定性分析，對差異表達的蛋白質(zhì)進行鑒定。 可同時分離數(shù)成百上千的蛋白質(zhì)。（六）雙向電泳結(jié)合質(zhì)譜普遍用于蛋白質(zhì)表達譜的分析和鑒定第63頁，共81頁，2022年，5月20日，8點19分，星期四 雙 向 電 泳 技 術(shù)Two-dimemsional g

24、el electrophoresis, 2DE技術(shù)構(gòu)成：第一相：IEF 采用丙烯酰胺與不同PH的兩性 電介質(zhì)形成的固定的PH梯度 IEF- PAGE第二相：分子篩凝膠 SDS- PAGE特點：1. 一次分離細胞中幾乎所有的蛋白質(zhì)（以spot形式出現(xiàn)）2. 高靈敏度和高分辨率 用銀染條件下，可達10-1510-18 mol水平3. 便于計算機分析處理 電泳分離圖譜經(jīng)掃描輸入計算機，可以進行蛋白質(zhì)定位, 等電點,分子量定量不同條件下的圖譜進行比較,建立蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫第64頁，共81頁，2022年，5月20日，8點19分，星期四第65頁，共81頁，2022年，5月20日，8點19分，星期四第66頁，

25、共81頁，2022年，5月20日，8點19分，星期四第67頁，共81頁，2022年，5月20日，8點19分，星期四第68頁，共81頁，2022年，5月20日，8點19分，星期四質(zhì) 譜 技 術(shù) 質(zhì)譜儀 進樣系統(tǒng) 離子源 質(zhì)量分析器 離子探測器系統(tǒng)第69頁，共81頁，2022年，5月20日，8點19分，星期四在蛋白質(zhì)組學研究中常用的質(zhì)譜儀電噴霧離子化質(zhì)譜儀（ESI-MS）基質(zhì)輔助的激光解吸離子化飛行時間質(zhì)譜儀（MALDI-TOF-MS）四極桿-TOF質(zhì)譜儀（Q-TOF）第70頁，共81頁，2022年，5月20日，8點19分，星期四質(zhì)譜技術(shù)在蛋白質(zhì)組研究中的作用1. 肽質(zhì)譜和肽的序列分析2. 翻譯后修篩的蛋白質(zhì)鑒定 N端封閉，磷酸化，糖基化3. 其它：蛋白質(zhì)二硫鍵的定量和定位蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用的分析蛋白質(zhì)其它分子相互作用的分析蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的分析比較不同條件（正常細胞與異常細胞，不同發(fā)育階段從中獲得單個有價值的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能第71頁，共81頁，2022年，5月20日，8點19分，星期四標簽融合蛋白沉淀實驗流程示意圖第72頁，共81頁，2022年，5月20日，8點19分，星期四 白質(zhì)相互作用研究領(lǐng)域里得到極大的推廣。GST融合蛋白在經(jīng)過固定有GST(glutathione)的