微生物與基因工程課件-2

1、第十章 微生物與基因工程第十章 微生物與基因工程 基因工程(genetic engineering)或重組DNA技術(shù)(combinant DNA technology) 是指對遺傳信息的分子操作和施工，即把分離到的或合成的基因經(jīng)過改造，插入載體中，導(dǎo)入宿主細(xì)胞內(nèi)，使其擴(kuò)增和表達(dá)，從而獲得大量基因產(chǎn)物，或者令生物表現(xiàn)出新的性狀?？寺?clone): 無性繁殖系的意思。 基因工程(genetic engineering一、基因工程的發(fā)展歷史 G.J.Mendel的豌豆雜交試驗(yàn)1944 O.T.Avery的肺炎球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn) 美國斯坦福大學(xué)的科學(xué)家構(gòu)建第一個(gè)重組DNA分子1977 美國南舊金山由博耶和

2、斯旺森建立世界上第一家遺傳 工程公司, 專門應(yīng)用重組DNA技術(shù)制造醫(yī)學(xué)上重要的藥物1980 開始建造第一家應(yīng)用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)胰島素的工廠1997 英國羅林研究所成功的克隆了多莉第一節(jié) 基因工程概述一、基因工程的發(fā)展歷史 G.J.Mendel的豌豆雜交試驗(yàn) 二、基因工程的基本過程 1.分離或合成基因； 2.通過體外重組將基因插入載體； 3.將重組DNA導(dǎo)入細(xì)胞； 4.擴(kuò)增克隆的基因； 5.篩選重組體克??； 6.對克隆的基因進(jìn)行鑒定或測序； 7.控制外源基因的表達(dá)； 8.得到基因產(chǎn)物或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、轉(zhuǎn)基因植物。 二、基因工程的基本過程 1.分離或合成基因； 1.將目的基因與運(yùn)載體DNA在體外進(jìn)行

3、重組目的基因載體DNA限制性核酸內(nèi)切酶DNA 重組體引入宿主細(xì)胞篩選含有重組體的細(xì)胞無性繁殖擴(kuò)增、基因表達(dá)、純化產(chǎn)物2.轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染3.篩選4.克?。╟loning）表達(dá)1.將目的基因與運(yùn)載體DNA在體外進(jìn)行重組目的基因載體DNA1、獲取 DNA重組基本過程1、獲取 DNA重組基本過程2、重組2、重組3、轉(zhuǎn)化3、轉(zhuǎn)化4、篩選4、篩選5、克隆5、克隆6、表達(dá)表達(dá)產(chǎn)物分離純化6、表達(dá)表達(dá)產(chǎn)物分離純化三、微生物學(xué)與基因工程的關(guān)系2.克隆載體主要是用病毒、噬菌體和質(zhì)粒改造而成；3.工具酶絕大多數(shù)是從微生物中分離純化的；4.微生物細(xì)胞是基因克隆的宿主；5.大多數(shù)基因產(chǎn)品都是通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)；1.微生物的

4、多樣性為基因工程提供了極其豐富而獨(dú)特的基因資源；6.有關(guān)基因結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和表達(dá)調(diào)控的理論主要來自對微生物的研究。 三、微生物學(xué)與基因工程的關(guān)系2.克隆載體主要是用病毒、噬菌體第二節(jié) 基因的分離、合成和定位誘變一. 從基因文庫或cDNA文庫中分離目的基因1.從基因文庫中分離目的基因 1）基因組文庫的構(gòu)建 基因組文庫就是指基因組DNA片段的全部克隆。即將整個(gè)基因組用合適的限制性酶切成合適長度的片段，并用一種載體將全部片段進(jìn)行克隆，文庫中每一個(gè)克隆只含基因組某一特定的DNA片段。第二節(jié) 基因的分離、合成和定位誘變一. 從基因文庫或cDN制備基因組DNA文庫分離、純化基因組DNA 條件：溫和，在EDTA

5、或SDS等存在下 限制酶部分消化 用蛋白酶K消化細(xì)胞、酚抽提大小不同DNA酶切片段 片段分離：常用蔗糖梯度或電泳分離 分別與同樣RE消化的載體連接 常用噬菌體載體或質(zhì)粒載體 DNA連接酶連接。 導(dǎo)入細(xì)胞 進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)培養(yǎng)擴(kuò)增。 篩選鑒定 用分子雜交、凝膠電泳等方法鑒定。 制備基因組DNA文庫 理想的基因組文庫應(yīng)包含該生物基因組全部遺傳信息。 通?；蚪M越大需要的克隆數(shù)越多，要求庫容量也越大?；蚪M文庫的大小的估算：N=ln（1P）/ln（1 f）N：為基因組文庫必需的克隆數(shù)目。P：為文庫中含目的基因DNA片段的出現(xiàn)概率。f：是插入片段的大小與全基因組大小的比值。 理想的基因組文庫應(yīng)包含該生物

6、基因組全部遺傳信DNA 文 庫DNA 文 庫2.從cDNA文庫中分離目的基因 cDNA文庫是指生物mRNA的全部cDNA克隆。文庫中每個(gè)克隆只含一種mRNA信息制備cDNA文庫（1）由mRNA合成cDNA第一條鏈（2）合成cDNA第二條鏈（3）構(gòu)建cDNA文庫2.從cDNA文庫中分離目的基因 cDN 分離目的基因 的mRNA逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA單鏈 水解去除mRNA， 合成cDNA雙鏈 水解回折處單鏈得到平端雙鏈cDNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞克隆,構(gòu)建cDNA文庫 導(dǎo)入宿主細(xì)胞克隆,構(gòu)建cDNA文庫3 從基因文庫中篩選目的基因 根據(jù)目的基因序列，設(shè)計(jì)制備并標(biāo)記特異探針與DNA雜交或PCR方法，可從文庫中篩

7、選出目的基因。3 從基因文庫中篩選目的基因 根據(jù)目的基因序列，設(shè)計(jì) 用DNA測序儀測出某一基因的堿基序列，或根據(jù)某一蛋白質(zhì)的氨基酸組成反推核苷酸序列，再用DNA合成儀通過化學(xué)合成原理合成目的基因。 一般先合成短片斷DNA，然后再拼接成長片段。二、 基因的化學(xué)合成 用DNA測序儀測出某一基因的堿基序列，或根據(jù)某一蛋白三 PCR 擴(kuò)增基因PCR擴(kuò)增儀 1984，穆利斯（Mullis）發(fā)明了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)在體外快速擴(kuò)增特定DNA序列的新技術(shù)。三 PCR 擴(kuò)增基因PCR擴(kuò)增儀 1984，穆利微生物與基因工程課件_2 1. PCR擴(kuò)增原理 引

8、物與模板DNA相結(jié)合并沿模板DNA延伸，以擴(kuò)增靶DNA序列。 如果DNA片段兩端的序列是已知的，可采用PCR將此DNA片段擴(kuò)增出來。 PCR過程需要合成兩個(gè)寡聚核苷酸作引物，并各自與所要擴(kuò)增的靶DNA片段的末端互補(bǔ)。PCR擴(kuò)增分三步 1. PCR擴(kuò)增原理 引物與模板 (1)變性(denaturation) 加熱，模板DNA經(jīng)熱變性，雙鏈被解開，成為兩條單鏈。9296 (2)退火(annealing) 溫度下降，寡核苷酸引物與模板DNA中所要擴(kuò)增序列兩端的堿基配對。 4060 (3)延伸(extension) 在適宜條件下，引物3端向前延伸，合成與模板堿基序列完全互補(bǔ)的DNA鏈。6572 DNA

9、片斷呈2的指數(shù)增長，12h重復(fù)2030次循環(huán)，DNA擴(kuò)增至106107。 (1)變性(denaturation) PCR循環(huán)-變性PCR循環(huán)-變性PCR循環(huán)-變性PCR循環(huán)-變性PCR循環(huán)-變性PCR循環(huán)-變性PCR循環(huán)退火PCR循環(huán)退火PCR循環(huán)延伸PCR循環(huán)延伸PCR循環(huán)延伸PCR循環(huán)延伸PCR循環(huán)延伸PCR循環(huán)延伸PCR循環(huán)延伸PCR循環(huán)延伸 2. 來自微生物的耐高溫DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶：1988，從水生棲熱菌(Thermus aquaticus) 中分離， 在95溫度下保持穩(wěn)定，在高溫下以單鏈DNA為模板合成互補(bǔ)鏈，一次加酶可滿足PCR全過程需求。缺乏校正功能。 PfuD

10、NA聚合酶和Vent DNA聚合酶：是一類既耐熱又具校正功能的酶，提供了PCR產(chǎn)物的特異性。Pfu是從火球菌（Pyrococcus Furiosus）中分離的。 VentDNA聚合酶從極端耐熱菌中分離的。 Tth DNA聚合酶：同時(shí)具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性?？墒筊T-PCR在同一體系中進(jìn)行，先將RNA逆轉(zhuǎn)錄成DNA，作為PCR的模板，再進(jìn)行PCR。從嗜熱菌中分離 2. 來自微生物的耐高溫DNA聚合酶 Taq 3. PCR技術(shù)的應(yīng)用 （1）可用于DNA的擴(kuò)增和克?。褐苽鋯捂溁螂p鏈DNA探針；基因拼接、定位誘變和DNA測序；轉(zhuǎn)基因動(dòng)、植物。 （2）在臨床醫(yī)學(xué)上可用于檢測病原體，診斷遺傳病，以及對癌基因的分

11、析確定。 （3）用于法醫(yī)，以鑒別個(gè)體和判定親緣關(guān)系。 （4）動(dòng)、植物檢疫。 3. PCR技術(shù)的應(yīng)用 （1）可用四. 基因的定位誘變（site-directed mutagenesis） 使已克隆基因或DNA片段中的任何一個(gè)特定堿基發(fā)生取代、插入或缺失變化的過程叫作基因的定點(diǎn)誘變，是基因工程和蛋白質(zhì)工程的重要手段。 1)寡核苷酸指導(dǎo)的定位誘變 應(yīng)用化學(xué)合成的含有突變堿基的寡核苷酸短片段做引物，進(jìn)行DNA復(fù)制，使寡核苷酸引物成為新合成的DNA子鏈的一個(gè)部分。 祥見p272四. 基因的定位誘變（site-directed mutag微生物與基因工程課件_22)盒式誘變(cassette mutage

12、nesis)2)盒式誘變(cassette mutagenesis)3）PCR定點(diǎn)誘變3）PCR定點(diǎn)誘變一、限制性核酸內(nèi)切酶(restriction endonuclease)第三節(jié)微生物與基因工程工具酶 簡稱限制性酶(restriction enzyme)是指能識別雙鏈DNA分子的特定序列，并在識別位點(diǎn)或其附近切割DNA的一類內(nèi)切酶。 在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)限制性酶與DNA甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制-修飾系統(tǒng)。 限制酶分為、III三種類型，通常所說的限制性核酸內(nèi)切酶，即指型限制酶。一、限制性核酸內(nèi)切酶(restriction endonuc 1.命名 EcoRI E：大腸桿菌屬名第一個(gè)字母； co：種

13、名頭兩個(gè)字母； R：株名； I：該菌中第一個(gè)被分離出來的酶。 副溶血嗜血桿菌的酶表示為Hph I (Haemophilus parahaemolyticus) 副流感嗜血桿菌的酶表示為Hpa I (Haemophilus parainfluenzae) 屬名相同，種名頭四個(gè)字母相同，第三個(gè)字母用種名后的另一個(gè)字母代替。 1.命名 EcoRI 副溶血嗜血桿菌的酶 2.限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性 識別序列通常由48個(gè)堿基對組成，具有二重旋轉(zhuǎn)對稱軸，呈回文結(jié)構(gòu)。 回文結(jié)構(gòu)是指雙鏈DNA中含有二個(gè)結(jié)構(gòu)相同、方向相反的序列也稱為反向重復(fù)序列。 例如： 5-GGTACC-3 3-CCATGG-5 2.限制

14、性核酸內(nèi)切酶的基本特性 賞花歸去馬如飛， 去馬如飛酒力微； 酒力微醒時(shí)已暮， 醒時(shí)已暮賞花歸。 暮 已賞 時(shí)花 醒歸 微去 力馬 酒如 飛回文詩賞花歸去馬如飛， 所有限制酶切割DNA后，均產(chǎn)生含5磷酸基和3羥基的末端。(1)形成粘性末端（2）形成平末端 所有限制酶切割DNA后，均產(chǎn)生含5磷酸基和3羥基平端切口粘端切口平端切口粘端切口基因組不同長度的酶切片段可用凝膠電泳區(qū)分開基因組不同長度的酶切片段可用凝膠電泳區(qū)分開 二、DNA連接酶 催化兩個(gè)雙鏈DNA片段相鄰的5磷酸與3羥基之間形成磷酸二酯鍵。 T4DNA連接酶：通常催化粘性末端間的連接效率要比催化平末端連接效率為高。 大腸桿菌DNA連接酶：

15、不能催化DNA分子的平端連接。 二、DNA連接酶 催化兩個(gè)雙鏈DNA片段相鄰的5第四節(jié) 微生物與克隆載體 克隆載體的基本要求： 能夠進(jìn)行獨(dú)立自主地復(fù)制； 含有多克隆位點(diǎn)，即具有若干限制酶的單一切點(diǎn)，便于外源基因的插入； 具有可供選擇的遺傳標(biāo)記。 克隆載體(cloning vector)：負(fù)責(zé)將外源基因送入宿主細(xì)胞并進(jìn)行復(fù)制與 擴(kuò)增的運(yùn)載工具。 具有一定的安全性，在胞內(nèi)不發(fā)生重組和轉(zhuǎn)移，在胞外不自由擴(kuò)散。第四節(jié) 微生物與克隆載體 克隆載體的基本要求：一、質(zhì)粒載體（1）環(huán)狀雙鏈的DNA分子，由4361bp組成；（2）可插入小于5kb左右的外源DNA；（3）是松弛型質(zhì)粒，在細(xì)胞中有較高的拷貝數(shù)； p

16、BR322是基因工程中最常用和最具代表性的質(zhì)粒載體。（4）具有四環(huán)素(Tetr)和氨芐青霉素 (Ampr)兩種抗性基因；（5）有24種限制酶的單一切點(diǎn)，其中7種位于四環(huán)素抗性基因之內(nèi)，3種位于氨卡青霉素抗性基因之內(nèi)。一、質(zhì)粒載體（1）環(huán)狀雙鏈的DNA分子，由4361bp組成；氨芐青霉素抗性基因四環(huán)素抗性基因氨芐青霉素抗性基因四環(huán)素抗性基因 二、噬菌體載體 （1） 噬菌體載體優(yōu)點(diǎn) 寄主大腸桿菌；線狀雙鏈DNA ，大小約50kb DNA兩端有12個(gè)核苷酸互補(bǔ)，形成粘性末端（cos位點(diǎn)），進(jìn)入寄主后形成環(huán)狀雙鏈DNA。 分子遺傳學(xué)背景十分清楚； 容量較大，能容納大約23kb的外源DNA片段； 具有較

17、高的感染效率，幾乎可達(dá)100%（質(zhì)粒轉(zhuǎn)化率只有0.1%）。 二、噬菌體載體 （1） 噬菌體載體優(yōu)點(diǎn) 插入外源DNA的長度受到一定限制，因?yàn)槭删w頭部容納DNA的量是一定的，否則不能正常裝配。 （2） 噬菌體載體缺點(diǎn) 插入外源DNA的長度受到一定限制，因?yàn)槭删w頭部容 具有克隆大片段外源DNA的能力。 柯斯質(zhì)粒本身一般只有57kb左右，而它克隆外源DNA片段可達(dá)35-45kb。常用于構(gòu)建基因文庫。優(yōu)點(diǎn)： 具有噬菌體的高效感染力，在進(jìn)入宿主細(xì)胞后不形成子代噬菌體，僅以質(zhì)粒形式存在；三、柯斯質(zhì)粒載體(cosmid vector) 即黏粒載體，由噬菌體的粘性末端cos位點(diǎn)和質(zhì)粒構(gòu)建而成。 具有克隆大片

18、段外源DNA的能力。 柯斯質(zhì)粒本 四、M13噬菌體載體 突出優(yōu)點(diǎn)是用于制備測序用的單鏈DNA、單鏈DNA探針、定位誘變模板，也可用于噬菌體展示。 1. M13是大腸桿菌絲狀噬菌體，其基因組為環(huán)狀ssDNA，大小為6407bp，只感染雄性大腸桿菌（F+或Hfr），通過性纖毛進(jìn)入宿主細(xì)胞成為復(fù)制型dsDNA，滾環(huán)復(fù)制產(chǎn)生ssDNA； 2. M13載體克隆外源DNA的能力較小，一般只適于克隆300400bp的外源DNA片段； 四、M13噬菌體載體 突出優(yōu)點(diǎn)是用于制備測序用的單 五、噬菌粒載體 噬菌粒(phagemid)是由M13噬菌體和質(zhì)粒DNA融合而成,含有M13的復(fù)制起點(diǎn)和質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)、選擇標(biāo)

19、記和多克隆位點(diǎn)。 優(yōu)點(diǎn)： 載體本身分子小，約為3kb，便于分離和操作； 可克隆l0kb外源DNA片段，克隆能力比M13大； 可用于制備單鏈或雙鏈DNA，克隆和表達(dá)外源基因。 五、噬菌粒載體 噬菌粒(phagemid)是由M1微生物與基因工程課件_2 六、真核生物的克隆載體 1.酵母質(zhì)粒載體 酵母質(zhì)粒載體都是利用酵母的2m質(zhì)粒與細(xì)菌質(zhì)粒pBR322構(gòu)建而成的。能分別在細(xì)菌和酵母菌中復(fù)制屬于穿梭質(zhì)粒。 六、真核生物的克隆載體 1.酵母質(zhì)粒載體2.Ti 質(zhì)粒載體 Ti質(zhì)粒是植物基因工程的理想載體，根癌農(nóng)桿菌含有的Ti質(zhì)粒，大小約200kb。當(dāng)它感染植物時(shí)，Ti質(zhì)粒中的T-DNA 區(qū)段可轉(zhuǎn)移并整合到植

20、物細(xì)胞的基因組DNA中。 3.真核生物病毒載體 哺乳動(dòng)物病毒（SV40、腺病毒、牛痘病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒），昆蟲，植物病毒， 經(jīng)改造后都可作為基因載體。2.Ti 質(zhì)粒載體 Ti質(zhì)粒是植物基因工程的理想載體， 七、人工染色體 1.酵母人工染色體（ yeast artificial chromosome, YAC ） 為了研究真核生物基因組的結(jié)構(gòu)，需要克隆較大的DNA 片段，一般的質(zhì)粒和病毒載體不能達(dá)到要求，利用染色體DNA 的結(jié)構(gòu)構(gòu)建了人工染色體，可攜帶較大DNA片段。 七、人工染色體 1.酵母人工染色體（ yea 酵母人工染色體是目前能容納最大外源 DNA 片段的人工構(gòu)建載體。YAC含有構(gòu)成酵母染

21、色體的3個(gè)必要單元： 著絲粒（ centromere, CEN ），保證染色體在細(xì)胞分裂過程中正確分配到子代細(xì)胞； 端粒（ telomere, TEL ），位于染色體兩個(gè)末端， 防止染色體 DNA 復(fù)制過程中兩端序列的丟失，保證DNA正常復(fù)制； 酵母自主復(fù)制序列（ autonomously replicating sequence, ARS ）其功能與酵母細(xì)胞復(fù)制有關(guān)此外還有限制酶切位點(diǎn)和選擇標(biāo)記基因。 酵母人工染色體是目前能容納最大外源 DNA YAC 克隆外源 DNA 能力非常大，一個(gè) YAC 可插入長達(dá) 106 堿基以上 DNA 片段。因此 YAC 既保證所插入外源基因結(jié)構(gòu)的完整性，又大

22、大減少基因庫所要求克隆的數(shù)目。目前 YAC 已成為構(gòu)建高等真核生物基因庫的重要載體，并在人類基因組的研究中起著重要作用。 YAC 克隆外源 DNA 能力非常大，一能攜帶約300kb大片段DNA。 2. 細(xì)菌人工染色體（ BAC ） 以F因子為基本骨架構(gòu)建。主要用于基因組文庫構(gòu)建、大基因簇研究和各類基因組計(jì)劃中。 能攜帶約300kb大片段DNA。2. 細(xì)菌人工染色體（ BA八、外源基因與載體體外連接（主要有以下4種連接方式） 1) 黏性末端連接效率高 2）人工接頭法 3）均聚物加尾法 4） 平頭末端連接八、外源基因與載體體外連接（主要有以下4種連接方式）一、克隆宿主的基本要求能夠高效吸收外源DN

23、A；不具有限制修飾系統(tǒng)，故不會使導(dǎo)入宿主細(xì)胞內(nèi)未經(jīng)修飾的外源DNA發(fā)生降解；一般為重組缺陷型(RecA-)菌株，使克隆載體DNA與宿主染色體DNA之間不發(fā)生同源重組；具有使外源DNA進(jìn)行高效復(fù)制的酶系統(tǒng)便于進(jìn)行基因操作和篩選；具有安全性:宿主細(xì)胞應(yīng)該對人、畜、農(nóng)作物無害或無致病性等。第五節(jié) 外源基因?qū)爰闹骷?xì)胞一、克隆宿主的基本要求能夠高效吸收外源DNA；第五節(jié) 外大腸桿菌作為宿主的優(yōu)缺點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn)：生長迅速、極易培養(yǎng)、能在廉價(jià)培養(yǎng)基中生長，其遺傳學(xué)及分子生物學(xué)背景十分清楚等。 缺點(diǎn)：條件致病菌和產(chǎn)生內(nèi)毒素。 一些誘變的大腸桿菌已解決了以上大部分問題。 1.原核生物宿主 大腸桿菌和枯草芽孢桿菌 2

24、.真核生物宿主 釀酒酵母、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞。大腸桿菌作為宿主的優(yōu)缺點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn)：生長迅速、極易培養(yǎng)、能1、外源基因?qū)朐思?xì)胞1.轉(zhuǎn)化： 在原核生物中，通過將外源DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞，從而獲得新的遺傳物質(zhì)的方法。如氯化鈣法。二 外源基因?qū)爰闹骷?xì)胞的方式1、外源基因?qū)朐思?xì)胞1.轉(zhuǎn)化： 在原核生物中，通過將外源2.轉(zhuǎn)導(dǎo): 以溫和噬菌體為媒介，將供體細(xì)胞的DNA片段攜帶到受體細(xì)胞中，通過交換與整合，從而使后者獲得前者部分遺傳性狀.2.轉(zhuǎn)導(dǎo): 1）酵母 (1) 原生質(zhì)體法 (2) 離子溶液法 (3) 電穿孔法 (4) PEG1000法2.外源DNA導(dǎo)入真核細(xì)胞1）酵母2.外源DNA導(dǎo)入真核細(xì)胞

25、2）外源基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞：磷酸鈣共沉淀法DEAE-葡聚糖法電穿孔法脂質(zhì)體法動(dòng)物病毒法顯微注射法 2）外源基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞：3）外源基因?qū)胫参锛?xì)胞 農(nóng)桿菌法：Ti質(zhì)粒即tumor-inducing plasmid3）外源基因?qū)胫参锛?xì)胞基因槍法：使用高能微粒子轟擊將DNA導(dǎo)入細(xì)胞或活的組織內(nèi)。亞微粒的鎢和金能自發(fā)地吸附DNA，將這些微彈加速到很高的速度轟擊細(xì)胞 基因槍法：使用高能微粒子轟擊將DNA導(dǎo)入細(xì)胞或活的組織內(nèi)。 基因槍 基因槍電轉(zhuǎn)儀電轉(zhuǎn)化電轉(zhuǎn)儀電轉(zhuǎn)化 三、目的克隆的篩選和鑒定1.載體上選擇標(biāo)記的鑒定 從眾多克隆中篩選和鑒定含有目的基因的重組體克隆，通常有3類鑒定方法：1）抗生素平板法

26、因?yàn)樽陨憝h(huán)化的載體和為被酶解的載體的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，在抗生素平板上也能生長，所以假陽性率較高。 外源基因插入載體的位點(diǎn)位于載體抗生素抗性基因之外，將轉(zhuǎn)化后的重組體細(xì)胞置于含有抗生素的平板上，仍可長出菌落。 三、目的克隆的篩選和鑒定1.載體上選擇標(biāo)記的鑒抗Amp宿主細(xì)菌含Amp培養(yǎng)基抗Amp宿主細(xì)菌含Amp培養(yǎng)基 外源DNA插入位點(diǎn)位于載體的抗生素抗性基因之內(nèi)，轉(zhuǎn)化后的重組體在含該抗生素的平板上不能夠生長。2） 插入失活法 含有不帶外源基因的質(zhì)粒的宿主細(xì)胞，可以在含有四環(huán)素或氨芐青霉素平板上生長， 外源DNA插入位點(diǎn)位于載體的抗生素抗性基因之內(nèi)3）-半乳糖苷酶顯色反應(yīng)法-互補(bǔ)(藍(lán)白篩選) 某些載體，如

27、M13噬菌體、pUC和pGEM等質(zhì)粒，攜帶lacZ 基因的一段序列編碼-半乳糖苷酶的肽，而受體細(xì)胞為lacZ 基因突變株，無-半乳糖苷酶活性，但遇肽，可發(fā)生互補(bǔ)作用，產(chǎn)生具有活性的酶，使培養(yǎng)基中的無色物質(zhì)X-gal 分解成半乳糖和藍(lán)色的5-溴-4氯靛藍(lán)，使菌落呈藍(lán)色；外源基因插入位點(diǎn)在載體的lacZ 基因內(nèi)，失去互補(bǔ)作用，結(jié)果帶有外源基因的菌落呈白色。3）-半乳糖苷酶顯色反應(yīng)法-互補(bǔ)(藍(lán)白篩選) 大腸桿菌能利用乳糖作為碳源，但利用乳糖的酶只有當(dāng)乳糖成為惟一的碳源時(shí)才會合成。大腸桿菌乳糖操縱子包括3個(gè)結(jié)構(gòu)基因:Z、Y和A。它們被同一個(gè)轉(zhuǎn)錄單元lacZYA編碼，共有一個(gè)啟動(dòng)子。lacZ 編碼-半乳糖苷酶，將乳糖水解為半乳糖和葡萄糖。lacY 編碼半乳糖苷通透酶，將乳糖運(yùn)送透過細(xì)菌的細(xì)胞壁。lacA 編碼硫代半乳糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶。