生物技術(shù)制藥-第二章-基因工程制藥(201309-201401-2)課件

1、第二章 基因工程制藥用途：主要用于癌癥、人類免疫缺陷病毒性疾病、心血管疾病、糖尿病、貧血和許多遺傳疾病的治療。獲取方式：生化提取 基因工程表達 成本高產(chǎn)量低質(zhì)量難以保證成本低產(chǎn)量高活性強性質(zhì)優(yōu)實例：人生長激素（侏儒癥）50 具新鮮尸體腦下垂體中提取采用基因工程從 12 升細菌培養(yǎng)液中提取獲得=1982 年世界上第一個基因工程藥物 重組人胰島素獲準生產(chǎn)銷售，至今已有 100 多個生物技術(shù)藥物上市;促紅細胞生成素（EPO）以全球銷售額 38 億美元的業(yè)績，居全球最暢銷 10 種藥物的第6名；1989 年我國第一個擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的基因工程藥物 - 重組人干擾素（IFN1b）上市以來，目前，世界上銷

2、售額排前 10 位的生物技術(shù)藥物我國已能生產(chǎn) 8 種。國際生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展動態(tài)第一節(jié) 概 述生物技術(shù)的核心就是基因工程，20世紀70年代基因工程誕生,最先應(yīng)用在醫(yī)藥科學領(lǐng)域。傳統(tǒng)生物藥物由于來源及制備上的困難、價格等因素的影響，此外在制備過程可能受到的病毒、衣原體、支原體等的感染等問題（如：生長激素抑制素 1 mg 傳統(tǒng)法：10萬只羊的下丘腦，現(xiàn)：10 L大腸桿菌培養(yǎng)液，0.3美元/mg；尿激酶從男性尿中提??；胎盤丙種球蛋白從胎盤中提取。應(yīng)用基因工程技術(shù)可十分方便且有效地解決傳統(tǒng)生物制藥所遇到的問題如今，癌癥、病毒性疾病、心血管疾病以及內(nèi)分泌等方面的預(yù)防、治療和診斷藥物已可通過基因工程技術(shù)獲得

3、。（4）基因工程和蛋白質(zhì)工程進行改造和去除內(nèi)源性生理活性物質(zhì)的不足之處。（5）利用基因工程技術(shù)可獲得新型化合物，擴大藥物篩選來源。第二節(jié) 基因工程藥物生產(chǎn)的過程 基因工程技術(shù)是將所要重組對象的目的基因插入載體、拼接，轉(zhuǎn)入新的宿主細胞，構(gòu)建成工程菌(或細胞），實現(xiàn)遺傳物質(zhì)的重新組合，并使目的基因在工程菌(或細胞）內(nèi)進行復(fù)制和表達的技術(shù)。獲得目的基因組建重組質(zhì)粒培養(yǎng)工程菌構(gòu)建基因工程菌或細胞產(chǎn)物分離純化除菌過濾半成品檢定包裝成品檢定基因工程藥物制備的一般過程基因工程基本過程切接轉(zhuǎn)增檢工程菌（或細胞）構(gòu)建中重要的工具工具：酶限制性內(nèi)切酶連接酶逆轉(zhuǎn)錄酶Klenow 酶大片段（DNA聚合酶 I）核酸酶S

4、1逆轉(zhuǎn)錄法的步驟 1、mRNA的純化 2、cDNA第一鏈的合成 3、cDNA第二鏈的合成 4、cDNA克隆 5、將重組體導入宿主細胞 6、cDNA文庫的鑒定 7、目的cDNA克隆的分離和鑒定cDNA克隆示意圖mRNA逆轉(zhuǎn)錄酶ss-DNADNA聚合酶IKlenow片段ds-cDNAds-cDNA核酸酶S1 三、化學合成法較小的蛋白質(zhì)或多肽的編碼基因可以用化學合成法合成。必須知道目的基因的核苷酸順序或目的蛋白質(zhì)的氨基酸順序。人工化學合成的限制：一不能合成太長的基因，5060bp；二是人工合成時，遺傳密碼的簡并性可導致中性突變；三是費用較高。四、篩選基因的新方法五、對已發(fā)現(xiàn)基因進行改造第四節(jié) 基因表

5、達 基因表達：是指結(jié)構(gòu)基因在生物體中的轉(zhuǎn)錄、翻譯以及所有加工過程。 基因高效表達：將外源基因片段拼接到另一個基因表達體系中，使既獲得原生物活性又可高產(chǎn)的表達產(chǎn)物。 最佳的基因表達體系：生物活性高、表達產(chǎn)量高、表達產(chǎn)物穩(wěn)定、表達產(chǎn)物容易分離純化。一、宿主細胞的選擇好培養(yǎng)，快速長，少危害，易重組，高量率，簡提純。 宿主細胞常用兩大類： 原核細胞：常用有大腸桿菌、枯草芽胞桿菌、鏈霉菌等； 真核細胞：常用有酵母、絲狀真菌、哺乳動物細胞等。原核細胞 大腸桿菌：基因工程研究中采用最多的原核表達體系。 優(yōu)點：生長快速、代謝簡單、遺傳體系清楚、容易操作、細胞破碎容易。 缺點： 不存在導向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的信號序列，分泌

6、能力不足，產(chǎn)品多為胞內(nèi)產(chǎn)物，提取困難； 蛋白表達后不能修飾加工（糖基化等）； 產(chǎn)物蛋白質(zhì)N端多余一個蛋氨酸殘基，能引起免疫反應(yīng)； 內(nèi)毒素存留。 真核細胞 酵母 是研究基因表達最有效的單細胞真核微生物。其基因組小，世代時間短，有單倍體雙倍體兩種形式，繁殖迅速，無毒性。能外分泌，產(chǎn)物可糖基化。已有不少真核基因成功表達。 絲狀真菌 優(yōu)點：分泌能力強，能正確進行翻譯后加工（肽剪切、糖基化）有成熟的發(fā)酵和后處理工藝。 哺乳動物細胞 優(yōu)點：表達產(chǎn)物可由重組轉(zhuǎn)化細胞分泌到培養(yǎng)液中，純化容易。產(chǎn)物是糖基化的接近天然物。 缺點：生長慢，生產(chǎn)率低，培養(yǎng)條件苛刻，費用高，培養(yǎng)液濃度稀。（4）應(yīng)具有阻遏子，使啟動子受

7、到控制，只有當誘導時才進行轉(zhuǎn)錄。（5）應(yīng)具有很強的終止子，以便使RNA聚合酶集中力量轉(zhuǎn)錄克隆的外源基因.（6）所產(chǎn)生的mRNA必須具有翻譯的起始信號，即起始密碼AUG和SD序列,以便轉(zhuǎn)錄后能順利翻譯。常用表達載體 pBV220系統(tǒng)啟動子多克隆位點終止子阻遏子P23復(fù)制起始位點 它已成功地表達了人白細胞介素2，干擾素和腫瘤壞死因子等外源基因。 氨芐青霉素抗性基因 限制性內(nèi)切酶 SD序列 pBG-2是由pBV220系統(tǒng)衍生的便于產(chǎn)物純化的融合表達載體。 該質(zhì)粒在PRPL啟動子下游插入G蛋白中與IgG Fc段結(jié)合的結(jié)構(gòu)域基因片段180個核苷酸，下游是多克隆位點，引入了剪切融合蛋白的切點，具有與IgG

8、結(jié)合的活性，可用親和層析。簡化下游工藝。pBG-2（二）影響目的基因在大腸桿菌中表達的因素外源基因的劑量 外源基因拷貝到高拷貝數(shù)的表達質(zhì)粒上，總體表達水平提高 外源基因的表達效率 與啟動子強弱，核糖體結(jié)合位點的有效性，SD序列與起始密碼的間距，密碼子的組成等都影響其表達效率 表達產(chǎn)物的穩(wěn)定性細胞代謝負荷宿主細胞的生長與重組質(zhì)粒的復(fù)制分開細胞的生長和外源基因的表達分成兩個階段工程菌的培養(yǎng)條件優(yōu)化工程菌培養(yǎng)條件，提高基因表達水平（三）真核基因在大腸桿菌中的表達形式 以融合蛋白的形式表達藥物基因 以原核多肽和真核蛋白結(jié)合在一起稱融合蛋白。 優(yōu)點：操作簡便，表達蛋白在菌體內(nèi)穩(wěn)定，易實現(xiàn)高效表達； 缺點

9、：只能作抗原用。 以非融合蛋白的形式表達藥物基因 非融合蛋白指在大腸桿菌中表達的蛋白質(zhì)以真核蛋白的mRNA的AUG為起始，在其氨基端不含細菌多肽序列。 優(yōu)點：保持原有蛋白活性； 缺點：易被蛋白酶破壞。 分泌型表達蛋白藥物基因 優(yōu)點：在周質(zhì)中穩(wěn)定，有活性，不含 蛋氨酸殘基； 缺點：產(chǎn)量不高， 信號肽不被切割。三、酵母中的基因表達（一）表達載體 酵母載體是可以攜帶外源基因在酵母細胞內(nèi)保存和復(fù)制，并隨酵母分裂傳遞到子代細胞的DNA或RNA單位。1.載體的復(fù)制序列 酵母附加體質(zhì)粒（yeast episomal plasmid， Yep類） 酵母復(fù)制型質(zhì)粒（yeast replication plasm

10、id， Ypp類）酵母著絲粒質(zhì)粒（yeast centromeric plasmid， YCp類）酵母整合型質(zhì)粒（yeast inteegrative plasmid， YIp類） 2. 克隆載體 酵母質(zhì)粒的加工和制備大部分是通過大腸桿菌進行的，只有在最后階段才轉(zhuǎn)入酵母中，這就要求酵母載體也同時具有在大腸桿菌中復(fù)制和增殖的能力。 3. 表達載體 將酵母菌的啟動子和終止子等有關(guān)控制序列引入上述載體的適當位點后，就構(gòu)成了酵母菌的表達載體。又分為普通表達載體和精確表達載體 普通表達載體，只能方便地引入外源基因并進行表達，對表達產(chǎn)物的組成，特別是對其N末端氨基酸是否增減并無嚴格要求。 精確表達載體，要

11、求在啟動子或信號肽編碼序列的適當部位有內(nèi)切酶點，以利于接入外源基因，并使他在表達加工后N末端氨基酸序列與天然產(chǎn)物相同，既無多余的氨基酸，也無缺失的氨基酸。（二）影響目的基因在酵母菌中表達的因素 外源基因的劑量 外源基因的表達效率 外源蛋白的糖基化宿主菌株的影響(5)培養(yǎng)條件四、動物細胞中的基因表達優(yōu)點：產(chǎn)物類似于天然產(chǎn)物，容易分離純化缺點：動物細胞生長慢，培養(yǎng)條件苛刻，費用高培養(yǎng)液濃度較小。主要基因工程表達體系比較表達體系 產(chǎn) 物 產(chǎn)生部位 培養(yǎng)方式 提 純 產(chǎn)物活性 潛在危性大腸桿菌 多肽蛋白質(zhì) 菌體內(nèi) 容易 一般 對原核好 不大 融合蛋白質(zhì) 部分高產(chǎn) 對真核差 酵 母 多肽蛋白質(zhì) 菌體內(nèi)

12、容易 菌體內(nèi) 真核的接近 不大 糖基化蛋白 外分泌 可高產(chǎn) 稍復(fù)雜 天然產(chǎn)物 哺乳動物 完 整 外分泌 較難成本高 簡單 可達天然 需注意 糖基化蛋白 可高產(chǎn) 產(chǎn)物 致癌1、mRNA的純化真核細胞 mRNA 3-polyA （20250)采用Oligo dT-纖維素，以親和層析法將mRNA從細胞總RNA中分離出來。2、cDNA第一鏈的合成 可用寡聚dT作為引物，在逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下，開始cDNA鏈的合成。3、cDNA第二鏈的合成除去cDNA-mRNA雜交鏈中的mRNA鏈(堿解或RNaseH酶解)然后以cDNA第一鏈為模板合成第二鏈。由于第一鏈cDNA鏈3-末端往往形成一個發(fā)夾形結(jié)構(gòu)，所以，可以從

13、這一點開始合成cDNA第二鏈(常用Klenow酶或DNA聚合酶I)切除發(fā)夾結(jié)構(gòu)（核酸酶S1，專一性切除單鏈DNA）4、cDNA克隆用于cDNA克隆的載體有三類： 細菌質(zhì)粒（如pBR322、 pUC等）插入片段10kb 動植物病毒 根據(jù)重組后插入的cDNA能否經(jīng)轉(zhuǎn)錄和翻譯合成蛋白質(zhì) 非表達型載體（pBR322及gt10 ） 表達型載體（pUC及gt11 ）有利于目的基因的篩選 5、將重組體導入宿主細胞1、轉(zhuǎn)化：指質(zhì)粒DNA 或以它為載體構(gòu)建的重組DNA 導入細菌的過程。 2、轉(zhuǎn)染：指病毒或以它為載體構(gòu)建的重組子導入真核細胞的過程。 脂質(zhì)體介導： 原生質(zhì)體融合： 電穿孔： 顯微注射： 基因槍： 病

14、毒介導： 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)染：6、cDNA文庫的鑒定1、表型改變： 抗生素抗性（抗性基因失活和菌落或噬菌斑顏色改變） a互補： 報告基因： 缺陷恢復(fù)：2、結(jié)構(gòu)特征： DNA大?。?酶切圖譜： 雜交（核酸、蛋白）： PCR檢測： DNA序列分析3、免疫化學檢測：表達產(chǎn)物分析7、目的cDNA克隆的分離和鑒定從cDNA文庫中分離特異的cDNA克隆，主要采用：（1）核酸探針雜交法。 根據(jù)目的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，人工合成相應(yīng)的單鏈寡核苷酸作為探針，從cDNA文庫中分離特異cDNA克隆。（2）免疫反應(yīng)鑒定法。 用表達型載體構(gòu)建的cDNA文庫，可用免疫學方法分組逐一鑒定各cDNA的表達產(chǎn)物，即以某種蛋白質(zhì)的抗體尋找

15、相應(yīng)的特異cDNA克隆。外源基因在大腸桿菌中高效表達的原理 啟動子 終止子 核糖體結(jié)合位點 密碼子 轉(zhuǎn)錄翻譯 啟動子和終止子的強弱； 大腸桿菌高效表達需要強的啟動子和終止子。 外源基因在強啟動子的控制下表達，容易發(fā)生轉(zhuǎn)錄過頭現(xiàn)象，即 RNA 聚合酶滑過終止子結(jié)構(gòu)繼續(xù)轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒上鄰近的 DNA 序列，形成長短不一的 mRNA 混合物過長轉(zhuǎn)錄物的產(chǎn)生在很大程度上會影響外源基因的表達。 對于一些終止作用較弱的終止子，通常可以采用二聚體終止子串聯(lián)的特殊結(jié)構(gòu)，以增強其轉(zhuǎn)錄終止作用。 外源基因在大腸桿菌細胞中的高效表達不僅取決于轉(zhuǎn)錄啟動的頻率，而且在很大程度上還與 mRNA 的翻譯起始效率密切相關(guān)。 mRNA 翻譯的起始效率主要由其 5 端的結(jié)構(gòu)序列（消除二級結(jié)構(gòu)）所決定，稱為核糖體結(jié)合位點（RBS）。 核糖體結(jié)合位點的有效性 SD 序列與翻譯起始密碼子之間的距離 SD序列與起始密碼子AUG之間的精確距離保證了mRNA在核糖體上定位后，翻譯起始密碼子 AUG 正好處于核糖體復(fù)合