藥物毒性的代謝組學研究-中國藥理學會毒理學研討會課件

1、藥物毒性的代謝組學研究彭雙清軍事醫(yī)學科學院毒物藥物研究所國家北京藥物安全評價研究中心劑量藥物毒物藥物發(fā)現(xiàn)與發(fā)展新化學實體(NCEs) 新生物實體(NBEs)有效性 安全性藥效學 毒理學 管理規(guī)范 ICH (International Conference on Harmonization)100,000 NCEs臨床前研究100 人體研究(0.1%)10-20個新藥投入市場(0.01-0.02%)藥物發(fā)現(xiàn)發(fā)展過程中候選新藥的淘汰率2個新藥利益回報(0.002%)早期發(fā)現(xiàn)臨床前 臨 床 試 驗投放市場 市場后 IV IIIIIICSFHDRSToxicology6-15 Ys 通過給予一定數(shù)量的

2、實驗動物大劑量的待測化合物，觀察其毒性效應特征，然后將其實驗結果外推到接受小劑量相同化合物的大量人群。 藥物安全性評價 存在問題 種屬外推 劑量外推 實驗周期 費用昂貴 發(fā)展方向 靈敏度高 特異性強 周期短 代謝組學(Metabonomics)定量研究機體對病理生理刺激或遺傳變異的，與時間相關的多參數(shù)代謝應答(Nicholson,etal, Xenobiotica, 1999, 29, 1181-1189).通過分析機體生物組織液體中代謝產物譜的變化，研究機體整體生物學狀況和功能調節(jié)。利用核磁共振和模式識別方法對生物體液進行系統(tǒng)研究，了解由外源性物質(藥物)的作用而引起的內源性代謝產物的變化，

3、并將這種變化與核磁共振譜圖的模式對應起來，從而找出作用的靶器官和作用位點，進而確定與之相關的生物標志物?；驹?藥物毒性破壞正常細胞的結構功能，改變細胞代謝途徑中內源性代謝物的穩(wěn)態(tài)。體內某種生物分子或代謝物的動態(tài)變化可以作為毒性損傷的評價指標。血漿或尿液代謝物的“整體模式”比單一靶標具有更好的一致性和預見性。 關鍵技術 NMR與模式識別是實現(xiàn)代謝組學的關鍵技術手段。 肝、腎毒性的代謝組學檢測JK.Nicholson et al. Nature Rev. Drug Discov. 1, 153, 2002 大鼠尿液功能性NMR圖譜 大鼠尿樣的600兆NMR氫譜, 圖中標示的為各種病理生理條件下

4、的生物標志物, 一張譜圖可包含數(shù)百種有關疾病和中毒過程的信息 。(JK.Nicholson et al. Nature Rev. Drug Discov. 1, 153, 2002)異煙肼和利福平聯(lián)合用藥致肝毒性增加的代謝組學 近十年來，結核病發(fā)病率在全球范圍內出現(xiàn)嚴重反彈。異煙肼(isoniazid，INH)和利福平(rifampin，RFP) 是WHO推薦的標準抗結核化療方案中不可替代的一線抗結核藥。兩藥聯(lián)合對殺滅結核桿菌有協(xié)同效果，可延緩耐藥性的產生。但聯(lián)合用藥可明顯增加肝毒性，甚至可發(fā)生嚴重的藥物性肝炎，出現(xiàn)致命的急性肝壞死并肝功能衰竭。關于RFP與INH合用肝毒性增加的機制研究已有3

5、0多年，但目前在很多方面，還未得到公認和肯定。實驗設計劑量設計：Group 1: control; Group 2: INH 400mg/kg; Group 3: RFP 100mg/kg; Group 4: INH+PFP 400+100mg/kg實驗動物：Wistar 大鼠 給藥時間 : 14dINH與RFP聯(lián)合用藥對大鼠體重和肝指數(shù)的影響分組體重(15d)(g)肝指數(shù)(mg/g) Con249.5414.67 4.1380.05INH193.3020.98*4.4160.04* RFP215.927.36* 4.3940.03* INH+RFP187.9416.40*4.7840.15*

6、 N=5; *P0.05, compared with Group 1; P0.05, compared with Group 4. INH與RFP聯(lián)合用藥對大鼠血漿生化指標的影響分組ALT (U/L)ALP (U/L)TG (U/L)TBILI(U/L)Con15.803.83274.0051.440.130.084.720.73INH32.602.70*335.6052.63*0.670.27*5.660.61*RFP26.205.53 *276.2031.160.210.064.420.51INH+RFP38.204.82*348.0043.86*0.260.1113.020.52*P0

7、.05, compared with Group 1; P0.05, compared with Group 4. INH和RFP單獨及聯(lián)合用藥對大鼠肝勻漿MDA、總巰基、非蛋白巰基和蛋白巰基含量的影響 *P0.05, compared with Group 1; P0.05, compared with Group 4. INH和RFP單獨及聯(lián)合用藥對大鼠微粒體細胞色素P450含量及P4502E1活性的影響 *P0.05, compared with Group 1; P0.05, compared with Group 4. INH和RFP單獨及聯(lián)合用藥組尿液600 MHz1H核磁共振譜

8、對照組(N)與給藥組(I=INH400mg/kg/d, R=RFP100mg/kg/d, P= INH+RFP 400+100mg/kg/d)共14天(0=0d,1=1d,14=14d)尿樣的PCA分析結果INH和RFP單獨及聯(lián)合用藥組不同時間點尿液代謝組變化主成分分析散點分布圖（給藥14d）RFP組主成分分析的時間變化軌跡圖（連續(xù)給藥14d） Ncontrol, R=RFP; 0=0d,1=1d,14=14dINH和RFP聯(lián)合用藥主成分分析時間變化軌跡圖（連續(xù)給藥14天） Ncontrol, P=INH+RFP; 0=0d,1=1d,14=14dloading 圖INH組尿液代謝產物主成分分

9、析載荷分布圖 RFP組尿液代謝產物主成分分析載荷分布圖 loading 圖INH和RFP聯(lián)合用藥組尿液代謝產物主成分分析載荷分布圖 loading 圖INH 組RFP組INH和RFP組1H譜的化學位移() 代謝產物PCA 結果1H譜的化學位移()代謝產物PCA 結果1H譜的化學位移()代謝產物PCA 結果2.54citrate2.462-OG2.42succinate2.66citrate2.54citrate2.462-OG2.7citrate2.7citrate2.54citrate3.26taurine3.022-OG2.66citrate3.42taurine2.7citrate3.6

10、6glucose3.022-OG3.26taurine：與對照比較，代謝產物濃度增加； ：與對照比較，代謝產物濃度降低 2OG：2oxoglutarate表3 1H NMR檢測INH和RFP單獨及聯(lián)合用藥組化學位移變化的PCA結果結果表明：對NMR譜圖進行主成分分析（PCA）發(fā)現(xiàn)， INH和RFP單獨及聯(lián)合用藥組與對照組在分值散點圖中呈聚類型分布，各組間未見重疊，可明顯分離；代謝產物譜與血液生化、肝臟脂質過氧化、肝臟微粒體酶活性及組織病理學具有良好的相關性； 盡管使用傳統(tǒng)生物分析方法較容易檢測到一些代謝物，但是藥物處理組尿液的NMR譜圖卻可以提供毒物所誘發(fā)生化紊亂的顯著特征性信息和時效模式。通

11、過600MHz 1H NMR檢測INH 與RFP單獨及聯(lián)合用藥組尿液的生化組成的顯著變化。 INH- :?；撬? )*, 檸檬酸( ), 葡萄糖( ) RFP-: 2-酮戊二酸( ), 檸檬酸鹽( )INH+RFP: ?；撬? ) * , 琥珀酸鹽( ), 2-酮戊二酸 ( ), 檸檬酸鹽( )*尿液中?；撬釢舛鹊脑黾颖还J為是肝中毒的標志。關木通的腎毒性關木通馬兜鈴科馬兜鈴屬植物東北馬兜鈴的干燥藤莖含馬兜鈴酸（aristolochic acid）、B、D，馬兜鈴甙（aristoloside），青木香酸（debilic acid）“中草藥腎病” “馬兜鈴酸腎病”含有馬兜鈴酸的中草藥（廣防己、關

12、木通等）引起的腎功能損害：貧血、腎性糖尿腎間質纖維化、腎小管破壞腎小管性蛋白尿國內外反應：許多國家禁止進口和銷售含馬兜鈴酸的中藥國家藥品監(jiān)管局取消關木通藥用標準“龍膽瀉肝丸”換方10/11/2022實驗設計劑量設計：36 g/kg；32 g/kg； 28 g/kg；control實驗動物：Wistar 大鼠 給藥時間 : 6dRats treated with drug for 6 days. *P0.01, compared with control.關木通對大鼠血漿生化指標的影響 BUN(mM/L) Crea(mol/L)CON 7.382.91 54.724.94 36g/kg 40.9

13、18.59 * 414.4779.13 *32g/kg 41.301.33 * 423.7683.37 * 28g/kg 39.9917.80 * 402.44148.47 *Groups關木通致腎臟組織病理學變化雄性Wistar大鼠連續(xù)給藥6天（ 36g/kg)后的腎臟組織學光鏡觀察, HEABCD(A)雄性Wistar大鼠對照和（B）連續(xù)給藥6天（ 36g/kg）后的大鼠的尿樣的600兆NMR氫譜關木通致大鼠尿液代謝產物譜的改變10/11/2022雄性Wistar大鼠ig連續(xù)給藥 (36g/kg）6天，其尿樣的600兆NMR氫譜歲時間的變化。10/11/2022PCA分析結果對照組(B)與給藥組(A)（28g/kg/d）第6天的尿樣的PCA分析結果10/11/2022PCA分析結果loading 圖10/11/2022PCA分析結果對照組(B)與給藥組(A)（36g/kg/d）第8天的尿樣的PCA分析結果10/11/2022PCA分析結果loading 圖10/11/2022結果表明：對NMR譜圖進行主成分分析（PCA）發(fā)現(xiàn)，關木通給藥組與對照組未見重疊，可明顯分離；給藥組NMR譜圖中一些譜峰的強度，如乙酸，檸檬酸，肌酐，氧化三甲胺等發(fā)生顯著變化；代謝產物譜與血液生化及組織病理學具有良好的相關性。結 論 基于NMR的代謝組學技術具有快速簡便、無傷害性