食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中肌醇的測(cè)定

1、 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中肌醇的測(cè)定范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中肌醇的測(cè)定方法。方法一適用于食品中肌醇的測(cè)定。方法二本標(biāo)準(zhǔn)的適用范圍擴(kuò)至調(diào)制乳品、飲料及以肌醇為功效的保健食品。第一法 微生物法原理利用葡萄汁酵母菌（Saccharomyces uvarum）對(duì)肌醇的特異性和靈敏性，定量測(cè)定試樣中待測(cè)物質(zhì)的含量。在含有除待測(cè)物質(zhì)以外所有營(yíng)養(yǎng)成分的培養(yǎng)基中，微生物的生長(zhǎng)與待測(cè)物質(zhì)含量呈線(xiàn)性關(guān)系，根據(jù)透光率與標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)進(jìn)行比較，即可計(jì)算出試樣中待測(cè)物質(zhì)的含量試劑和材料注：除非另有說(shuō)明，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T 6682規(guī)定的二級(jí)水。菌株：葡萄汁酵母菌（Saccharomyces uvarum）

2、，ATCC 9080。試劑3.2.1 氯化鈉（NaCl）3.1.2 氫氧化鈉（NaOH）3.1.3 鹽酸（HCL）。試劑配制3.3.1 氯化鈉溶液（9g/L）：稱(chēng)取9.0g氯化鈉溶解于1000 mL水中，分裝試管，每管10 mL。121滅菌15min。3.3.2 鹽酸溶液（1 mol/L）：量取82 mL鹽酸，冷卻后定容至1000 mL。3.3.3 鹽酸溶液（0.44 mol/L）：量取36.6 mL鹽酸，冷卻后定容至1000 mL。3.3.4 氫氧化鈉溶液（600g/L）：稱(chēng)取300 g氫氧化鈉溶解于水中，冷卻后定容至500 mL。3.3.5 氫氧化鈉溶液（1 mol/L）：稱(chēng)取40 g氫氧

3、化鈉溶解于水中，冷卻后定容至1000 mL標(biāo)準(zhǔn)品3.4.1 肌醇肌醇（myo-Inositol）標(biāo)準(zhǔn)品（C6H12O6）：純度99 %。肌醇標(biāo)準(zhǔn)溶液配制3.5.1 肌醇標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（0.2 mg/mL）：肌醇標(biāo)準(zhǔn)品置于五氧化二磷的干燥器中干燥24 h以上，稱(chēng)取50 mg肌醇標(biāo)準(zhǔn)品（3.4.1）（精確到0.1 mg），用水充分溶解，定容至250 mL棕色容量瓶中，貯存在冰箱中。3.5.2 肌醇標(biāo)準(zhǔn)中間液（10g/mL）：吸取5.00 mL 肌醇標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（3.5.1），用水定容到100mL棕色容量瓶中，貯存在冰箱中。3.5.3 肌醇標(biāo)準(zhǔn)工作液（1 g/mL和2 g/mL）：吸取10 mL肌醇標(biāo)準(zhǔn)中

4、間液（3.5.2）兩次，分別用水定容到100 mL容量瓶和50mL容量瓶中。該工作液需每次臨用前配制。培養(yǎng)基3.6.1 麥芽浸粉瓊脂培養(yǎng)基（Malt Extract Agar）：可按附錄A配制。3.6.2 肌醇測(cè)定培養(yǎng)基：可按附錄A配制。注：一些商品化合成培養(yǎng)基效果良好，商品化合成培養(yǎng)基按標(biāo)簽說(shuō)明進(jìn)行配制。干燥劑：五氧化二磷（P2O5）。玻璃珠：直徑約5 mm。儀器和設(shè)備除微生物常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：天平：感量為 0.1 mg。pH計(jì)：精度0.01。分光光度計(jì)。渦旋振蕩器。離心機(jī)：轉(zhuǎn)速2000 r/min。恒溫培養(yǎng)箱：30 1 。振蕩培養(yǎng)箱：30 1 ，震蕩速度140次/m

5、in160次/min。冰箱：25。無(wú)菌吸管：10 mL（具0.1 mL 刻度）或微量移液器或吸頭。瓶口分液器：0 mL10 mL。錐形瓶：200 mL容量瓶（A類(lèi)）：100 mL，250 mL，500 mL。單刻度移液管（A類(lèi)）：容量5 mL。漏斗：直徑90 mm。定量濾紙：直徑90 mm。試管：18 mm 18 mm注：玻璃儀器使用前，用活性劑（月桂磺酸鈉或家用洗滌劑加入到洗滌用水中即可）對(duì)硬玻璃測(cè)定管及其他必要的玻璃器皿進(jìn)行清洗，清洗之后200干熱 2h。分析步驟接種菌懸液的制備5.1.1 菌種復(fù)蘇將菌株（3.1）活化后接種到麥芽浸粉瓊脂斜面培養(yǎng)基上（3.6.1）上，30 1 培養(yǎng)16 h

6、24 h后，在轉(zhuǎn)接2代3代來(lái)增強(qiáng)活力，制成貯備菌種，貯于冰箱（4.8）中，保存期不要超過(guò)2周。臨用前接種到新的麥芽浸粉瓊脂斜面培養(yǎng)基上。5.1.2 接種菌懸液的制備在使用的前一天將貯備菌種轉(zhuǎn)接到新配制的麥芽浸粉瓊脂斜面培養(yǎng)基上，于30 1 培養(yǎng)20h24 h。用接種環(huán)刮取菌苔到一直滅菌氯化鈉溶液（3.3.1）試管中。以2000轉(zhuǎn)/分鐘離心2min3min，如此清洗3次4次。吸取一定量的該菌液移入裝有10 mL氯化鈉溶液（3.3.1）的試管中，制成接種菌懸液。用分光光度計(jì)，以氯化鈉溶液（3.3.1）作空白，550 nm波長(zhǎng)下測(cè)定該接種菌懸液的透光率，調(diào)整加入的菌液量或者加入一定量的氯化鈉溶液使該

7、菌懸液透光率在60%80%。試樣制備谷物類(lèi)、乳粉等試樣需粉碎、研磨、過(guò)篩（篩板孔徑0.3 mm0.5 mm）；肉及肉制品等用打碎機(jī)制成食糜；果蔬等試樣需勻漿混勻；液體試樣用前振搖混合。4冰箱保存，1周內(nèi)測(cè)定。試樣提取5.3.1 谷物類(lèi)、果蔬、肉及肉制品等天然食品：稱(chēng)取約含肌醇0.5 mg2.0 mg的試樣（精確至0.1 mg）于250 mL三角瓶中，加入40 mL水，混勻。加入100 mg蛋白酶和100 mg淀粉酶溶液置于361恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，暗處溫育酶解1 h（其間不時(shí)震蕩）。加入40mL鹽酸（3.3.3），在滅菌釜中121水解15min。取出，冷卻至室溫，加入2mL氫氧化鈉溶液（3.3.4）

8、，冷卻。用氫氧化鈉溶液（3.3.5）或鹽酸溶液（3.3.2）調(diào)pH至5.2，轉(zhuǎn)入250 mL容量瓶中，定容至刻度。混勻，過(guò)濾，收集濾液，該濾液為待測(cè)液。調(diào)整稀釋度，使待測(cè)液肌醇的濃度在1 g/mL10 g/mL范圍內(nèi)。5.3.2 嬰幼兒配方食品、乳品、強(qiáng)化肌醇的飲料等強(qiáng)化食品：稱(chēng)取約含肌醇0.5 mg2.0 mg的試樣（精確至0.1 mg）于250 mL三角瓶中，對(duì)于干粉試樣加入80 mL（3.3.3），對(duì)于液體試樣加入100 mL鹽酸（3.3.3），混勻，使干粉試樣溶解。將三角瓶以鋁箔紙覆蓋，在滅菌釜中125水解1 h。取出，冷卻至室溫，加入約2 mL氫氧化鈉溶液（3.3.4），冷卻。用氫氧

9、化鈉溶液（3.3.5）或鹽酸溶液（3.3.2）調(diào)pH至5.2，轉(zhuǎn)入250 mL容量瓶中，定容至刻度?；靹?，過(guò)濾，收集濾液，該濾液為待測(cè)液。調(diào)整稀釋度，使待測(cè)液肌醇的濃度在1 g/mL10 g/mL范圍內(nèi)。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作 按表1順序加入蒸餾水、肌醇標(biāo)準(zhǔn)工作液（3.5.3）和肌醇測(cè)定培養(yǎng)基（3.6.2）于培養(yǎng)管中，一式三份。表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作試管號(hào)（No.）S1S2S3S4S5S6S7S8S9S10蒸餾水（mL） 5543210210肌醇標(biāo)準(zhǔn)工作液1 ug/mL 0012345000肌醇標(biāo)準(zhǔn)工作液2 ug/mL0000000345培養(yǎng)基（ml）5555555555待測(cè)液的制作按表2加入蒸餾水、待

10、測(cè)液（5.3）和肌醇測(cè)定培養(yǎng)基（3.6.2）于培養(yǎng)管中，一式三份。表2待測(cè)液的制作試管號(hào)（No.）1234蒸餾水（ml）4321樣品（ml）1234培養(yǎng)基（ml）5555滅菌每支試管內(nèi)加入一粒玻璃珠，蓋上試管帽，121 滅菌5 min。（商品培養(yǎng)基按標(biāo)簽說(shuō)明進(jìn)行滅菌）。接種將試管固定在振蕩培養(yǎng)箱內(nèi)，用約140次/min160次/min的震蕩速度，在301振蕩培養(yǎng)22h24h。測(cè)定對(duì)每支試管進(jìn)行視覺(jué)檢查，接種空白試管S1內(nèi)培養(yǎng)液應(yīng)是澄清的，如果出現(xiàn)渾濁，則結(jié)果無(wú)效。5.8.1 從振蕩培養(yǎng)箱內(nèi)取出試管，放入滅菌釜內(nèi)，100保持5min，使微生物停止生長(zhǎng)。5.8.2 用接種空白試管S1（5.4）作空

11、白，將分光光度計(jì)通光率調(diào)到100%（或吸光度A為0），讀出接種空白試管S2（5.4）的讀數(shù)。再以接種空白試管S2位空白，調(diào)節(jié)透光率為100%（或A為0），依次讀出其他每支試管的透光率（或吸光度A）。5.8.3 用渦旋振蕩器充分混合每一只試管（也可以加一滴消泡劑）后，立即將培養(yǎng)液移入比色皿內(nèi)進(jìn)行測(cè)定，波長(zhǎng)為540 nm660 nm，待讀數(shù)穩(wěn)定30 s后，讀出透光率，每支試管穩(wěn)定時(shí)間要相同。以肌醇的標(biāo)準(zhǔn)品的含量為橫坐標(biāo)，透光率為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。5.8.4 根據(jù)待測(cè)液的透光率，從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)中差的該待測(cè)液中肌醇的濃度，再根據(jù)稀釋因子和稱(chēng)樣量計(jì)算出試樣中肌醇的含量。透光略超出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)管S3S10范圍的試

12、樣管要舍去。5.8.5 對(duì)每個(gè)編號(hào)的待測(cè)液的試管，用每支試管的透光率計(jì)算每毫升該編號(hào)待測(cè)液肌醇的濃度，并計(jì)算該編號(hào)待測(cè)液的肌醇濃度平均值，每支試管測(cè)得的改濃度不得超過(guò)該平均值的15%，超過(guò)者要舍去。如果符合該要求的管數(shù)少于所有的四個(gè)編號(hào)的待測(cè)液的總管數(shù)的2/3，用于計(jì)算試樣含量的數(shù)據(jù)是不充分的，需要重新檢驗(yàn)。如果符合要求的管數(shù)超過(guò)原來(lái)管數(shù)的2/3，重新計(jì)算每一編號(hào)的有效試樣管中每毫升測(cè)定液肌醇含量的平均值，以此平均值計(jì)算全部編號(hào)試樣管的總平均值Cx，用于計(jì)算試樣中的肌醇含量。注：繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，既可讀取透光率（T %），也可讀取吸光度（A）分析結(jié)果表述試樣中肌醇的含量按式（1）計(jì)算： （1）式中

13、：x 試樣中肌醇的含量，單位為毫克每百克（mg/100g）；cx 5.8.5中計(jì)算所得的總平均值，單位為微克（g）；m 樣品質(zhì)量，單位為克（g）；f 樣液稀釋倍數(shù)； 以重復(fù)性條件下獲得兩次獨(dú)立測(cè)XX果的算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留三位有效數(shù)字。精密度天然食品：在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)XX果的絕對(duì)差值不得超過(guò)算術(shù)平均值的15 %。強(qiáng)化食品：在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)XX果的絕對(duì)差值不得超過(guò)算術(shù)平均值的8 %。第二法 氣相色譜法原理試樣中的肌醇用水和乙醇提取后，與硅烷化試劑衍生，正己烷提取，經(jīng)氣相色譜分離，外標(biāo)法定量。試劑和材料除非另有說(shuō)明，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T 6682規(guī)

14、定的一級(jí)水。試劑9.1.1 無(wú)水乙醇（C2H6O）。9.1.2 正己烷（C6H14）。9.1.3 95 %乙醇。9.1.4 三甲基氯硅烷（C3H9ClSi）。9.1.5 六甲基二硅胺烷（C6H19NSi2）。9.1.6 N，N-二甲基甲酰胺（C3H7NO）。9.1.7 肌醇標(biāo)準(zhǔn)品：純度99 %，CAS號(hào)：87-89-8。試劑配制9.2.1 硅烷化試劑。分別吸取體積比為1：2的三甲基氯硅烷和六甲基二硅胺烷，超聲混勻現(xiàn)用現(xiàn)配。9.2.2 肌醇標(biāo)準(zhǔn)溶液：0.010 mg/mL。稱(chēng)取100 mg（精確到0.1 mg）經(jīng)過(guò)105 1 烘干2 h的肌醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)于100 mL容量瓶中，用25 mL水溶解完全

15、。用95 %的乙醇（3.1.3）定容至刻度，混勻。取1 mL此溶液于100 mL容量瓶中，用70 %的乙醇定容至刻度，混勻。儀器和設(shè)備分析天平：感量為0.1 mg。氣相色譜儀：帶FID檢測(cè)器。離心機(jī)：轉(zhuǎn)速5000轉(zhuǎn)/分鐘。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。超聲波儀。恒溫?zé)崴〔?。帶有螺紋蓋的25ml試管。分析步驟試樣處理與衍生。12.1.1 試樣處理：固態(tài)和粉狀試樣研磨混合均勻后稱(chēng)取1 g（精確到0.1 mg），于50 mL容量瓶中，加入12 mL約40 溫水溶解試樣；液態(tài)試樣直接稱(chēng)取12 g（精確到0.1 mg）于50 mL容量瓶中。上述試樣超聲提取約10 min，用95 乙醇（9.1.3）定容至刻度，混勻。靜止

16、約20 min后，取10 mL于15 mL離心管中，以不低于4000 轉(zhuǎn)/分鐘離心約5min。取上清液5 mL于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮瓶中。12.1.2 干燥與衍生：向濃縮瓶中加入10 mL無(wú)水乙醇（9.1.1），在80 2 下旋轉(zhuǎn)濃縮至近干時(shí)再加入5mL無(wú)水乙醇（9.1.1）繼續(xù)濃縮至徹底干燥（有水將使下步硅烷化不徹底）。加入10.0 mLN，N-二甲基甲酰胺（C3H7NO），超聲溶解5 min并轉(zhuǎn)移至25 mL有螺紋蓋的離心管中，加入硅烷化試劑（9.2.1）3.0 mL并放于80 2 水浴中衍生反應(yīng)約75 min。其間每隔約20 min取出震蕩一次，然后取出冷卻至室溫。加入5 mL正己烷（9.1.

17、2），振蕩混合后靜止分層。取上層液3 mL于預(yù)先加少許無(wú)水硫酸鈉的帶螺紋蓋離心管中，振蕩后以不低于4000轉(zhuǎn)/分鐘離心，此為試樣測(cè)定液。試標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定液的制備分別吸取0.0 mL，2.0 mL，4.0 mL，6.0 mL，8.0 mL，10.0 mL肌醇標(biāo)準(zhǔn)溶液（3.2.2）于濃縮瓶中，按（11.1.2）步驟操作。測(cè)定11.3.1 參考色譜條件：色譜柱：填料為50 %氰丙基-甲基聚硅氧烷的毛細(xì)管柱，柱長(zhǎng)60 m， 內(nèi)徑0.25 mm，膜厚0.25 m；或同等性能的色譜柱；進(jìn)樣口溫度: 280 ； 檢測(cè)器溫度: 300 ；分流比：10：1；進(jìn)樣量：1.0 L；程序升溫見(jiàn)表3：表3 程序升溫升溫速率（

18、/ min）目標(biāo)溫度（ ）保持時(shí)間（ min）初始溫度1200101905010220311.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制作分別將標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定液（11.2）注入到氣相色譜儀中（色譜圖見(jiàn)附錄B），以測(cè)得的峰面積（或峰高）為縱坐標(biāo)，以肌醇標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定液中肌醇的含量（mg）為橫坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。試樣溶液的測(cè)定：11.3.3 試樣溶液的測(cè)定：分別將試樣測(cè)定液（11.1.2）注入到氣相色譜儀中得到峰面積（或峰高），從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)中獲得試樣測(cè)定液中肌醇的含量（mg）。分析結(jié)果表述試樣中肌醇含量按式（2）計(jì)算：（2）式中:X試樣中肌醇含量，單位為毫克每百克（mg/100 g）；Cs從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)中獲得試樣測(cè)定液肌醇的含量，單位為毫克（mg）。mi試樣的質(zhì)量，單位為克（g）。fi試樣測(cè)定液所含肌醇換算成試樣中所含肌醇的系數(shù)為10。以?xún)纱为?dú)立測(cè)XX果的算術(shù)平均值表示。計(jì)算結(jié)果要求表示到小數(shù)點(diǎn)后一位。精密度在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)XX果的絕對(duì)差值不得超過(guò)算術(shù)平均值的10%。其他固體或粉末樣品檢出限為1.0mg/100g，液體樣品檢出限為0.2mg/100g。附錄A培養(yǎng)