生理實(shí)驗(yàn)2課件

1、實(shí)驗(yàn)二 反射弧分析、刺激強(qiáng)度和刺激頻率與肌肉收縮反應(yīng)的關(guān)系，神經(jīng)干動(dòng)作電位和神經(jīng)傳導(dǎo)速度的測(cè)定反射弧模式圖反射弧分析基礎(chǔ)知識(shí)定義 反射是指在中樞神經(jīng)系統(tǒng)參與下，機(jī)體對(duì)內(nèi)， 外環(huán)境變化所作出的規(guī)律性應(yīng)答?；窘Y(jié)構(gòu) 反射的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和基本單位是反射弧 感受器 傳入神經(jīng) 反射弧 神經(jīng)中樞 傳出神經(jīng) 效應(yīng)器實(shí)驗(yàn)?zāi)康?通過制備脊蟾蜍的方法，引導(dǎo)出單純的脊髓反射，觀察這些反射，證實(shí)反射弧的完整性與反射活動(dòng)的關(guān)系。步驟和方法制備脊蟾蜍標(biāo)本，分離右側(cè)坐骨神經(jīng)。（探針搗毀腦部不要搗毀脊髓或采用斷頭法制備）分離右側(cè)大腿坐骨神經(jīng)干，并穿線備用肌夾夾住下頜，懸掛在鐵支架上。注意事項(xiàng)毀腦時(shí)不可傷及脊髓，以免破壞脊髓反射中

2、樞。分離坐骨神經(jīng)應(yīng)盡量向上，并盡量剪斷與其相連的分支。每次酸刺激后應(yīng)立即用清水洗凈腳趾，并用紗布揩干。剝脫腳趾皮膚要完全，若剩留少量皮膚會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。思考題反射弧有哪幾部分組成，各部分具有什么作用？ 刺激強(qiáng)度和刺激頻率與肌肉收縮反應(yīng)的關(guān)系，神經(jīng)干動(dòng)作電位和神經(jīng)傳導(dǎo)速度的測(cè)定 圖5-4 蛙脛骨肌肉背面觀1-腓腸肌、2-腓骨肌肉（Peroneus ）圖5-5 蛙脛骨肌肉腹面觀1-腓腸肌、2-脛骨深?。═ibialis posticus）3-Extensor cruris、4-Tibialis anticus longus 5-脛腓骨閾刺激閾下刺激閾上刺激有效刺激1.刺激強(qiáng)度與肌肉收縮反應(yīng)的關(guān)系閾

3、強(qiáng)度(threshold stimulus)能引起組織發(fā)生反應(yīng)的最小刺激強(qiáng)度，又稱為閾值。具有閾強(qiáng)度的刺激稱為閾刺激（threshold stimulus）。一條骨骼肌纖維“全或無(wú)” (all-or-none)達(dá)到閾值 肌纖維收縮超過閾值 收縮力不增加一塊骨骼肌一定范圍內(nèi)，肌肉收縮力的大小與刺激強(qiáng)度成正比閾下刺激 無(wú)肌肉興奮收縮刺激強(qiáng)度最適強(qiáng)度最適強(qiáng)度 收縮力不增加刺激強(qiáng)度達(dá)到一定的數(shù)值少數(shù)興奮性最高的肌纖維產(chǎn)生收縮肌纖維被興奮數(shù)肌肉收縮力所有的肌纖維均興奮肌肉收縮反應(yīng)最大由許多骨骼肌纖維組成的不同的肌纖維興奮性不同強(qiáng)直收縮(tetanus)骨骼肌受較高頻率連續(xù)刺激,新收縮過程與上次尚未結(jié)束的

4、收縮過程發(fā)生總和不完全強(qiáng)直收縮(incomplete tetanus)總和過程發(fā)生于前一次收縮過程的舒張期完全強(qiáng)直收縮(complete tetanus)總和過程發(fā)生于前一次收縮過程的收縮期在生理?xiàng)l件下,支配骨骼肌的傳出神經(jīng)總是發(fā)出連續(xù)的沖動(dòng),所以骨骼肌的收縮都是強(qiáng)直收縮;靜息狀態(tài)下,中樞神經(jīng)也經(jīng)常發(fā)放低頻率神經(jīng)沖動(dòng)至骨骼肌,產(chǎn)生一定程度的強(qiáng)直收縮,稱為肌緊張(muscle tone) 1933年美國(guó)科學(xué)家 Gasser和 Erlanger用示波器對(duì)外周神經(jīng)活動(dòng)進(jìn)行研究性總結(jié)，并發(fā)表了著名的論文Electric signals of Nervous Activity（1939年）。用示波器做蛙

5、坐骨神骨干動(dòng)作電位實(shí)驗(yàn)陰極射線示波器，1922年美國(guó)人發(fā)明。細(xì)胞外記錄（ Extracellular Recording）實(shí)驗(yàn)階段 劍橋大學(xué)Hodgkin和Huxley應(yīng)用金屬微電極 對(duì)烏賊巨神經(jīng)纖維電活動(dòng)進(jìn)行系統(tǒng)研究， Hodgkin和 Katz提出離子假說。 1949年，凌寧和Gerard 發(fā)明玻璃微電極。電壓鉗和膜片鉗將電生理研究推向分子水平。用玻璃微電極做細(xì)胞電生理實(shí)驗(yàn)尖端直徑0.5m的玻璃微電極細(xì)胞內(nèi)記錄（ intracellular Recording）實(shí)驗(yàn)階段動(dòng)作電位（Action potential, AP）概念：是指可興奮細(xì)胞受到刺激時(shí)，在靜息電位基礎(chǔ)上產(chǎn)生快速的可傳播的一過

6、性電位波動(dòng)。 單相動(dòng)作電位(Monophasic Action Potential)損傷區(qū)興奮區(qū)細(xì)胞外引導(dǎo)電極檢流計(jì)雙相動(dòng)作電位( Biphasic Action Potential)興奮區(qū)細(xì)胞外引導(dǎo)電極檢流計(jì)（引導(dǎo)電極距離小于動(dòng)作電位波長(zhǎng)） 動(dòng)作電位的傳導(dǎo) Conduction of AP 動(dòng)作電位以局部電流的形式傳導(dǎo) 局部電流利用朗飛氏結(jié)的跳躍傳導(dǎo)朗飛氏結(jié)動(dòng)作電位傳導(dǎo)速度的測(cè)定 (Measurement of Conduction Velocity of AP)+St傳導(dǎo)速度測(cè)定=SACt刺激器輸入通道R1- Rr1+ R2- R2+刺激偽跡(Stimulus artifact)刺激偽跡A

7、P刺激器放大器+地刺激電流i-i+R+R-地刺激偽跡是刺激電流通過導(dǎo)電介質(zhì)擴(kuò)散至兩引導(dǎo)電極而形成的電位差信號(hào)。影響神經(jīng)纖維興奮性的因素(Factors Affecting Nerve Fibers Excitability)神經(jīng)纖維的直徑有無(wú)髓鞘物種溫度藥物（如普魯卡因）、離子（K）等的影響 目的（objective）1掌握蟾蜍坐骨神經(jīng)腓腸肌標(biāo)本的制備方法2觀察不同刺激強(qiáng)度和頻率刺激對(duì)肌肉收縮的影響3.測(cè)定蟾蜍坐骨神經(jīng)干復(fù)合動(dòng)作電位（compound action potential,CAP） ，研究蟾蜍坐骨神經(jīng)干的特性、雙相動(dòng)作電位形成機(jī)制及神經(jīng)損傷對(duì)神經(jīng)興奮傳導(dǎo)的影響以及神經(jīng)干動(dòng)作電位的傳

8、導(dǎo)速度的測(cè)定。實(shí)驗(yàn)難點(diǎn)實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)1.材料和方法 (Materials and methods )1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物（laboratory animal) 蟾蜍（中華蟾蜍指名亞種，Zhuoshan Toad） 雄性蟾蜍皮膚光滑，前肢趾上有黑色婚墊，會(huì)鳴叫。雌性蟾蜍皮膚粗糙，無(wú)婚墊，不會(huì)鳴叫。1.材料和方法 (Materials and methods )1.2藥品(drug) 任氏液任氏液由無(wú)機(jī)鹽和蒸餾水配置而成，每升溶液含NaCl 6.5g、KCl 0.14g、CaCl2 0.12g,、NaHCO3 0.20g、NaH2PO4 0.01g。任氏液的理化特性與蛙的組織液近似。可用于蛙的組織、器

9、官潤(rùn)濕和營(yíng)養(yǎng)。1. 3器材( Experimental apparatus)BL420 E+/BL420 F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)BL420E+生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)可以同時(shí)采集、放大、顯示、記錄、分析四路生物信號(hào)及一路刺激輸出，12導(dǎo)聯(lián)心電圖輸入記錄，可用于人體和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。儀器參數(shù)全程控設(shè)置，有多種數(shù)據(jù)分析功能和數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換輸出功能。 神經(jīng)干標(biāo)本盒。 S+ S- E R1 - R1+ R2- R2+S+、S-刺激電極，E接地電極，r1- 、r1+和r2- 、r2+引導(dǎo)電極，蛙類手術(shù)器材一套（蛙板、蛙釘、粗剪刀、手術(shù)剪、鑷子、刺蛙針、玻璃分針；鋅銅弓；滴管、培養(yǎng)皿、500ml燒杯）張力傳感器1.4制備坐骨神經(jīng)

10、干（ preparation of sciatic nerve trunk ） 蟾蜍毀腦脊髓，去上肢和內(nèi)臟，下肢剝皮浸于任氏液中。 蟾蜍下肢背面向上置于蛙板上，剪去尾椎；標(biāo)本腹面向上，用玻璃分針分離脊柱兩側(cè)神經(jīng)叢，用線在近脊柱處結(jié)扎，剪斷神經(jīng)；將神經(jīng)干從腹面移向背面。標(biāo)本背面向上固定，從大腿至跟腱分離坐骨神經(jīng)。坐骨神經(jīng)標(biāo)本置任氏液中備用。正確持握找到枕骨大孔刺入搗毀腦及脊髓 (觀察反應(yīng))剪除上肢及內(nèi)臟剝皮 (剪去肛周一圈)任氏液 5 min; 洗手腹側(cè)朝上 穿線/結(jié)扎/剪斷/輕提剪分支背側(cè)朝上 肌間勾出游離至膝搭 刮 剪(可在后一步做)跟腱扎 剪制備坐骨神經(jīng)干（ preparation of

11、sciatic nerve trunk ）關(guān)鍵：游離坐骨神經(jīng)取一條腿放于蛙板上。將標(biāo)本背側(cè)向上放置，剪斷梨狀肌及其附近的結(jié)締組織，沿坐骨神經(jīng)溝(股二頭肌及半膜肌之間的裂縫處)，找出坐骨神經(jīng)之大腿部分，用玻璃針小心剝離，在神經(jīng)完全暴露后，用粗剪刀剪下與神經(jīng)相連的從脊柱，用鑷子提起小塊脊柱，用手術(shù)剪剪斷坐骨神經(jīng)的所有分支，并將神經(jīng)一直游離至膝關(guān)節(jié)處。坐骨神經(jīng)腓腸肌制作坐骨神經(jīng)小腿標(biāo)本 制作坐骨神經(jīng)腓腸肌標(biāo)本將游離干凈的坐骨神經(jīng)搭于腓腸肌上，在膝關(guān)節(jié)周圍剪掉全部大腿肌肉并用粗剪刀將股骨刮干凈，后在股骨中部剪去上段股骨，保留的部分為坐骨神經(jīng)小腿標(biāo)本。在跟腱處穿線結(jié)扎后剪斷跟腱。游離腓腸肌至膝關(guān)節(jié)處，然

12、后沿膝關(guān)節(jié)將小腿其余部分全部剪掉，制得個(gè)具有附著在股骨上的腓腸肌并帶有支配腓腸肌的坐骨神經(jīng)的標(biāo)本。殘留股骨坐骨神經(jīng)脊柱片用鋅銅弓檢查標(biāo)本腓腸肌肌腱上的結(jié)扎線與張力換能器另一端相連張力換能器一端與BL420生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)相連接坐骨神經(jīng)腓腸肌標(biāo)本的股骨頭固定在肌槽的股骨固定孔內(nèi)earth刺激電極記錄電極1.5 儀器連接標(biāo)本的放置與固定1.6 記錄動(dòng)作電位( Record action potential) 神經(jīng)干標(biāo)本置于標(biāo)本盒的電極上，神經(jīng)與電極接觸良好，調(diào)節(jié)刺激電壓，記錄動(dòng)作電位。神經(jīng)干標(biāo)本肌肉神經(jīng)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目設(shè)置刺激強(qiáng)度與反應(yīng)關(guān)系實(shí)驗(yàn)參數(shù)子菜單設(shè)置刺激頻率與反應(yīng)關(guān)系實(shí)驗(yàn)參數(shù)子菜單觀察刺激強(qiáng)度與收

13、縮反應(yīng)的關(guān)系 觀察刺激頻率與收縮波形的關(guān)系實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目菜單項(xiàng)2.1刺激強(qiáng)度與肌肉收縮反應(yīng)的關(guān)系2.2 刺激頻率與收縮反應(yīng)的關(guān)系2. 觀察（observations)連接實(shí)驗(yàn)裝置：實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目模塊選擇 刺激器參數(shù)設(shè)置：波寬.ms 刺激強(qiáng)度從零開始漸增； 刺激頻率改變可從1Hz漸增為25Hz。實(shí)驗(yàn)觀察： 單收縮的分析 復(fù)合收縮實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)： 1實(shí)驗(yàn)過程中要經(jīng)常用任氏液濕潤(rùn)標(biāo)本，每次刺激后應(yīng)使肌肉休息30秒，連續(xù)刺激不可超過10秒。 2不要用手握住或接觸神經(jīng)。2.3 測(cè)定中樞端引導(dǎo)的雙相動(dòng)作電位（biphasic action potential, BAP) 用1.0V電壓，波寬0.1ms的單個(gè)方波激刺激神

14、經(jīng)干末梢端，測(cè)定中樞端BAP正、負(fù)向振幅(amplitude，A)和時(shí)程(duration，D） + - R1-R1 +R2-R2 +中樞端引導(dǎo)的動(dòng)作電位Central endPeripheral endAc1Dc1Ac2Dc22.4 測(cè)定末梢端引導(dǎo)的雙相動(dòng)作電位 用1.0V電壓，波寬0.1ms的單個(gè)方波激刺激神經(jīng)干中樞端，測(cè)定末梢端BAP正、負(fù)相振幅和時(shí)程。Dp1Dp2Ap1Ap2Ap1Ap2+ - R1-R1 +R2-R2 +Peripheral endCentral end2.5興奮傳導(dǎo)速度的測(cè)定 用1.0V電壓，波寬0.1ms的單個(gè)方波激刺激神經(jīng)干中樞端，測(cè)定第1和第2對(duì)引導(dǎo)電極引導(dǎo)C

15、AP起點(diǎn)的時(shí)間差t ，根據(jù) S R1- R2- / t 計(jì)算出AP的傳導(dǎo)速度。S R1- R2- t=S R1- R2-t+ - R1-R1 +R2-R2 +Peripheral endCentral end2.6 觀察刺激強(qiáng)度（U）與動(dòng)作電位振幅的關(guān)系 刺激波寬0.1ms，刺激電壓從0.1V開始， 按步長(zhǎng)0.05V增加，刺激電壓每增加一次刺激神經(jīng)干一次，并記錄刺激電壓和MAP振幅。 圖 刺激強(qiáng)度與動(dòng)作電位振幅的關(guān)系A(chǔ)（mV)U(V)Maximal stimulusThreshold stimulus要求：測(cè)定閾強(qiáng)度和最大刺激強(qiáng)度，刺激強(qiáng)度與動(dòng)作電位振幅的關(guān)系曲線神經(jīng)干引導(dǎo)所獲得復(fù)合動(dòng)作電位（

16、 compound action potential (CAP）與單神經(jīng)纖維引導(dǎo)的動(dòng)作電位的性質(zhì)有所不同。AmDm條件：刺激電壓1V, 刺激波寬0.1ms2.7 測(cè)定單相動(dòng)作電位（monophasic action potential，MAP） 用鑷子夾傷對(duì)1對(duì)引導(dǎo)電極間的神經(jīng)干，然后用1.0V電壓，波寬0.1ms的單個(gè)方波激刺激神經(jīng)干中樞端，測(cè)定末梢端MAP振幅和時(shí)程。+ - R1-R1 +R2-R2 +Peripheral endCentral end2. 觀察項(xiàng)目（observations)2.1 刺激強(qiáng)度與肌肉收縮反應(yīng)的關(guān)系2.2 刺激頻率與收縮反應(yīng)的關(guān)系2.3 測(cè)定中樞端引導(dǎo)的雙相動(dòng)

17、作電位（biphasic action potential, BAP)。用1.0V電壓，波寬0.1ms的單個(gè)方波激刺激神經(jīng)干末梢端，觀察中樞端BAP正、負(fù)向振幅(amplitude，A)和時(shí)程(duration，D） 2.4 測(cè)定末梢端引導(dǎo)的雙相動(dòng)作電位。用1.0V電壓，波寬0.1ms的單個(gè)方波激刺激神經(jīng)干中樞端，測(cè)定末梢端BAP正、負(fù)相振幅和時(shí)程。2.5 興奮傳導(dǎo)速度的測(cè)定。用1.0V電壓，波寬0.1ms的單個(gè)方波激刺激神經(jīng)干中樞端，測(cè)定第1和第2對(duì)引導(dǎo)電極引導(dǎo)CAP起點(diǎn)的時(shí)間差t ，根據(jù) S R1- R2- / t 計(jì)算出AP的傳導(dǎo)速度。2.6 觀察刺激強(qiáng)度（U）與動(dòng)作電位振幅的關(guān)系 刺激

18、波寬0.1ms，刺激電壓從0.1V開始， 按步長(zhǎng)0.05V增加，刺激電壓每增加一次刺激神經(jīng)干一次，并記錄刺激電壓和MAP振幅。2.7 測(cè)定單相動(dòng)作電位（monophasic action potential，MAP）。用鑷子夾傷對(duì)1對(duì)引導(dǎo)電極間的神經(jīng)干，然后用1.2V電壓，波寬0.1ms的單個(gè)方波激刺激神經(jīng)干中樞端，測(cè)定末梢端MAP振幅和時(shí)程。3.1 刺激強(qiáng)度與肌肉收縮反應(yīng)的關(guān)系閾強(qiáng)度閾刺激閾上刺激最適強(qiáng)度分析閾強(qiáng)度和最適刺激強(qiáng)度？3.結(jié)果 （results）3.2 刺激頻率與收縮反應(yīng)的關(guān)系單收縮不完全強(qiáng)直收縮完全強(qiáng)直收縮骨骼肌單收縮分析分析三個(gè)時(shí)期？臨界融合刺激頻率？3.3 刺激波寬？時(shí)，閾

19、刺激Uth為？；最大刺激Umaxs V，刺激電壓1.0V時(shí)，動(dòng)作電位的傳導(dǎo)速度為 s （m/s)見表1。nUth (v)Umax (V) (m/s)123xs表1 蟾蜍坐骨神經(jīng)干閾刺激、最大刺激和傳導(dǎo)速度3.4 刺激電壓1.0V，刺激波寬0.1ms時(shí)，中樞端引導(dǎo)的動(dòng)作電位正相和負(fù)相振幅分別為Ac1s mV和Ac2s mV; 末梢端引導(dǎo)的動(dòng)作電位正相振幅Ap1s mV大于負(fù)相振幅Ap2s mV， 兩者有（或無(wú)）顯著性差異（p0.05)；見圖1。 3.5 用1.0V電壓，波寬0.1ms的單個(gè)方波激刺激神經(jīng)干中樞端，測(cè)定第1和第2對(duì)引導(dǎo)電極引導(dǎo)CAP起點(diǎn)的時(shí)間差t ，根據(jù) S R1- R2- / t

20、 計(jì)算出AP的傳導(dǎo)速度。3.6 刺激電壓1.0V時(shí)，單相動(dòng)作電位振幅Ams mV大（小)于雙相動(dòng)作電位正相振幅Ap1s mV，兩者有（或無(wú)）顯著性差異（p0.05)；單相動(dòng)作時(shí)程Dms ms顯著長(zhǎng)于雙相動(dòng)作電位正相Dp1s ms，兩者有（或無(wú)）顯著性差異（p0.05)，見圖1、圖2。Ap1Ap2Dp1Dp1t圖1 蟾蜍坐骨神經(jīng)干雙相動(dòng)作電位圖2 蟾蜍坐骨神經(jīng)干單相動(dòng)作電位AmDm3.7在刺激電壓低于Uthreshold時(shí)，測(cè)不到動(dòng)作電位；刺激電壓從Uthreshold增加至Umaximal，動(dòng)作電位振幅呈曲線增長(zhǎng)，刺激電壓高于Umaximal動(dòng)作電位振幅不再增長(zhǎng)，見圖3。A（mV)圖3 刺激強(qiáng)

21、度與動(dòng)作電位振幅的關(guān)系U(V)0.51.01.52464. 討論(discussion)4.4 在兩引導(dǎo)電極間夾傷神經(jīng)，神經(jīng)沖動(dòng)傳導(dǎo)被阻斷，雙相動(dòng)作電位負(fù)相波消失，形成一相正波，于此可見，雙相動(dòng)作電位是神經(jīng)沖動(dòng)先后通過兩個(gè)引導(dǎo)電極形成的，沖動(dòng)通過第1個(gè)電極，形成動(dòng)作電位的正相波，沖動(dòng)通過第2個(gè)電極，形成動(dòng)作電位的負(fù)相波。4.1 刺激電壓從Uth增加至Umax，神經(jīng)干動(dòng)作電位振幅隨刺激電壓增加而增高。神經(jīng)干動(dòng)作電位不具有“全或無(wú)”性質(zhì)。坐骨神經(jīng)干為不同類型的神經(jīng)纖維組成，各個(gè)類型纖維的興奮性水平不同1，在一個(gè)有限的范圍內(nèi)神經(jīng)干動(dòng)作電位的大小與刺激的強(qiáng)度成比例2 。4.2 蛙神經(jīng)沖動(dòng)的傳導(dǎo)速度在20時(shí)約為每秒30米 3 ，本實(shí)驗(yàn)所測(cè)得的蟾蜍坐骨神經(jīng)干動(dòng)作電位的傳導(dǎo)速度為.4.3 刺激蟾蜍坐骨神經(jīng)干中樞端，可在其末梢端引導(dǎo)出動(dòng)作電位，反之也然，由此可以證明離體蟾蜍坐骨神經(jīng)具有雙向傳導(dǎo)興奮的能力。4.5 刺激神經(jīng)干中樞端在其末梢端引導(dǎo)所得BAP和刺激神經(jīng)干末梢端在其中樞端引導(dǎo)所得BAP，正相振幅均大于等于負(fù)相振幅，正相時(shí)程均小于負(fù)相時(shí)程，由此表明在蟾蜍坐骨神經(jīng)干AP引導(dǎo)時(shí)，兩引導(dǎo)電極處神經(jīng)纖維的多寡不是形成BAP正相振幅大于負(fù)相振幅和正相時(shí)程小于負(fù)相時(shí)程的主要原