《體外轉(zhuǎn)錄與翻譯》課件

1、體外轉(zhuǎn)錄與翻譯體外轉(zhuǎn)錄與翻譯 基因體外轉(zhuǎn)錄與翻譯 in vitro transcription/translation基因工程基因體外轉(zhuǎn)錄與翻譯一、基因體外轉(zhuǎn)錄與翻譯的意義二、基因體外轉(zhuǎn)錄原理與操作三、基因體外轉(zhuǎn)錄應(yīng)用四、基因體外翻譯的原理與操作五、基因體外翻譯的應(yīng)用 基因體外轉(zhuǎn)錄與翻譯基因工程基因體外轉(zhuǎn)錄 基因工程基因體外轉(zhuǎn)錄與翻譯一、基因體外轉(zhuǎn)錄與翻譯的意義 基因工程基因體外轉(zhuǎn)錄與翻譯一、基因體外 基因工程基因體外轉(zhuǎn)錄與翻譯一、基因體外轉(zhuǎn)錄與翻譯的意義費(fèi)事、費(fèi)力、工序煩瑣？體外操作體內(nèi)操作研究蛋白質(zhì)、RNA方便需要快速、方便獲得蛋白質(zhì)、RNA 基因工程基因體外轉(zhuǎn)錄與翻譯一、基因體外 基因工

2、程基因體外轉(zhuǎn)錄與翻譯二、基因體外轉(zhuǎn)錄原理與操作1、基因體內(nèi)轉(zhuǎn)錄的過(guò)程 需要的基本物質(zhì)：DNA模板 啟動(dòng)子、結(jié)構(gòu)基因 轉(zhuǎn)錄終止子RNA聚合酶四種核糖核酸轉(zhuǎn)錄因子 基因工程基因體外轉(zhuǎn)錄與翻譯二、基因體外 基因工程基因體外轉(zhuǎn)錄與翻譯二、基因體外轉(zhuǎn)錄原理與操作1、基因體內(nèi)轉(zhuǎn)錄的過(guò)程 真核基因轉(zhuǎn)錄原核基因轉(zhuǎn)錄 基因工程基因體外轉(zhuǎn)錄與翻譯二、基因體外 基因工程基因體外轉(zhuǎn)錄與翻譯二、基因體外轉(zhuǎn)錄原理與操作2、基因體外轉(zhuǎn)錄的原理 基本的工作原理是以DNA為模板，在轉(zhuǎn)錄體系中的一系列轉(zhuǎn)錄因子的作用下，經(jīng)RNA聚合酶合成RNA。 基因體外轉(zhuǎn)錄體系在1976年由PELHAM和JACKSON建立。體外轉(zhuǎn)錄體系逐漸成熟

3、。 基因工程基因體外轉(zhuǎn)錄與翻譯二、基因體外 基因工程基因體外轉(zhuǎn)錄與翻譯二、基因體外轉(zhuǎn)錄原理與操作3、基因體外轉(zhuǎn)錄的操作 （1）RNA聚合酶（RNA Polymerases ）常用的聚合酶為噬菌體來(lái)源的RNA聚合酶 T7 、SP6、T3特異識(shí)別模板啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄效率比大腸桿菌的聚合酶效率高酶的來(lái)源及質(zhì)量高 基因工程基因體外轉(zhuǎn)錄與翻譯二、基因體外 基因工程基因體外轉(zhuǎn)錄與翻譯二、基因體外轉(zhuǎn)錄原理與操作3、基因體外轉(zhuǎn)錄的操作 （1）RNA聚合酶（RNA Polymerases ） 基因工程基因體外轉(zhuǎn)錄與翻譯二、基因體外 基因工程基因體外轉(zhuǎn)錄與翻譯二、基因體外轉(zhuǎn)錄原理與操作3、基因體外轉(zhuǎn)錄的操作 （2）線形

4、的DNA模板（linear DNA template ）要求：有RNA聚合酶識(shí)別的雙鏈啟動(dòng)子，被轉(zhuǎn)錄基因。 質(zhì)粒（Plasmids ） 基因工程基因體外轉(zhuǎn)錄與翻譯二、基因體外 基因工程基因體外轉(zhuǎn)錄與翻譯二、基因體外轉(zhuǎn)錄原理與操作3、基因體外轉(zhuǎn)錄的操作 （2）線形的DNA模板（linear DNA template ） PCR產(chǎn)物（PCR Products） 基因工程基因體外轉(zhuǎn)錄與翻譯二、基因體外 基因工程基因體外轉(zhuǎn)錄與翻譯二、基因體外轉(zhuǎn)錄原理與操作3、基因體外轉(zhuǎn)錄的操作 （2）線形的DNA模板（linear DNA template ） 寡核苷酸（Oligonucleotides ） CDNA

5、 基因工程基因體外轉(zhuǎn)錄與翻譯二、基因體外 基因工程基因體外轉(zhuǎn)錄與翻譯二、基因體外轉(zhuǎn)錄原理與操作3、基因體外轉(zhuǎn)錄的操作 （3）基本反應(yīng)體系 基因工程基因體外轉(zhuǎn)錄與翻譯二、基因體外 基因工程基因體外轉(zhuǎn)錄與翻譯二、基因體外轉(zhuǎn)錄原理與操作3、基因體外轉(zhuǎn)錄的操作 （）基本反應(yīng)分型 普通型（Conventional Synthesis ）在一個(gè)反應(yīng)體系內(nèi)得到的量較少，主要由于探針制備大規(guī)模型（Large Scale Synthesis ）在一個(gè)反應(yīng)體系內(nèi)得到的量，一般在體系內(nèi)得到，主要用于結(jié)構(gòu)與功能的研究 基因工程基因體外轉(zhuǎn)錄與翻譯二、基因體外 基因工程基因體外轉(zhuǎn)錄與翻譯三、基因體外轉(zhuǎn)錄應(yīng)用1、制備病毒R

6、NA片段 用于證明病毒的侵染性 利用長(zhǎng)鏈RT-PCR技術(shù)方法擴(kuò)增出病毒全長(zhǎng)cDNA，克隆入帶有T7 RNA聚合酶啟動(dòng)子質(zhì)粒，以此cDNA為模板作體外轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物轉(zhuǎn)染細(xì)胞后觀察到了典型的病毒病變。從而判定病毒的侵染性 基因工程基因體外轉(zhuǎn)錄與翻譯三、基因體外 基因工程基因體外轉(zhuǎn)錄與翻譯三、基因體外轉(zhuǎn)錄應(yīng)用2、獲得干擾用siRNA 基因工程基因體外轉(zhuǎn)錄與翻譯三、基因體外 基因工程基因體外轉(zhuǎn)錄與翻譯三、基因體外轉(zhuǎn)錄應(yīng)用3、獲得核酶（Ribozyme）核酶(Ribozyme)是一種具有核酸內(nèi)切酶活性的RNA分子，可特異性地切割靶RNA序列。 錘頭狀核酶 發(fā)夾狀核酶 基因工程基因體外轉(zhuǎn)錄與翻譯三、基因體

7、外 基因工程基因體外轉(zhuǎn)錄與翻譯三、基因體外轉(zhuǎn)錄應(yīng)用 4、獲得RNA探針 基因工程基因體外轉(zhuǎn)錄與翻譯三、基因體外 基因工程基因體外轉(zhuǎn)錄與翻譯 四、基因體外翻譯的原理與操作1、基因體內(nèi)翻譯的過(guò)程 基因工程基因體外轉(zhuǎn)錄與翻譯 四 基因工程基因體外轉(zhuǎn)錄與翻譯 四、基因體外翻譯的原理與操作2、基因體外翻譯的原理 無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)是一種以外源mRNA或DNA為模板,通過(guò)在細(xì)胞抽提物的酶系中補(bǔ)充底物和能源物質(zhì)來(lái)合成蛋白質(zhì)的體外系統(tǒng). 與傳統(tǒng)的體內(nèi)重組表達(dá)系統(tǒng)相比,體外無(wú)細(xì)胞合成系統(tǒng)具有多種優(yōu)點(diǎn),如可表達(dá)對(duì)細(xì)胞有毒害作用或含有非天然氨基酸(如D-氨基酸)的特殊蛋白質(zhì),能夠直接以PCR產(chǎn)物作為模板同時(shí)平行合

8、成多種蛋白質(zhì),開展高通量藥物篩選和蛋白質(zhì)組學(xué)的研究等. 基因工程基因體外轉(zhuǎn)錄與翻譯 四 基因工程基因體外轉(zhuǎn)錄與翻譯 四、基因體外翻譯的原理與操作3、基因體外翻譯系統(tǒng) （1）兔網(wǎng)織紅細(xì)胞系統(tǒng)Rabbit Reticulocyte Lysate 網(wǎng)織紅細(xì)胞由紅細(xì)胞分化而來(lái)，在體內(nèi)主要是負(fù)責(zé)合成大量血紅蛋白（90%以上），以及球蛋白。這種未成熟的紅細(xì)胞本身不帶細(xì)胞核，但卻保留了這種高效翻譯各種核酸信息的能力，可減少背景，即使在較低的豐度下也能比較高效地合成產(chǎn)物。 根據(jù)測(cè)定，體外合成外源蛋白的效率接近完整網(wǎng)織紅細(xì)胞自身合成內(nèi)源蛋白的效率。此外網(wǎng)織紅細(xì)胞體系內(nèi)源的核酸酶很少，有助于長(zhǎng)鏈RNA的穩(wěn)定（包括

9、有帽子或者沒(méi)帽子結(jié)構(gòu)的RNA），因而可以合成較大的蛋白。網(wǎng)織紅細(xì)胞體系是最有希望做到微粒體糖基化的體系。 基因工程基因體外轉(zhuǎn)錄與翻譯 四 基因工程基因體外轉(zhuǎn)錄與翻譯 四、基因體外翻譯的原理與操作3、基因體外翻譯系統(tǒng) （1）兔網(wǎng)織紅細(xì)胞系統(tǒng) 兔網(wǎng)織紅細(xì)胞用新西蘭大白兔制備 ，通過(guò)純化除去兔網(wǎng)織紅細(xì)胞以外的污染細(xì)胞。 網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解后，提取物用微球菌核酸酶破壞內(nèi)源mRNA，最大限度降低翻譯背景。 裂解物包含蛋白質(zhì)臺(tái)成所必須的細(xì)胞內(nèi)組分(tRNA，核糖體，氨基酸，起始、延伸、終止因子)。 為使系統(tǒng)更適于mRNA 的翻譯，兔網(wǎng)織紅細(xì)胞中還添加了磷酸肌酸和磷酸肌酸激酶的能量生成系統(tǒng)，以及氯化高鐵血紅素防

10、止翻譯起始的抑制，此外還添加了tRNAs混合物用于擴(kuò)大mRNA翻譯的范圍，以及乙酸鉀和乙酸鎂等。 兔網(wǎng)織紅細(xì)胞具有一定的翻譯后加工活性，包括翻譯產(chǎn)物的乙?；?，異戊二烯化，蛋白酶水解和一些磷酸化活性。信號(hào)肽切除以及蛋白質(zhì)糖基化等翻譯后加工事件可以通過(guò)加入犬微粒體膜來(lái)實(shí)現(xiàn)。 基因工程基因體外轉(zhuǎn)錄與翻譯 四 基因工程基因體外轉(zhuǎn)錄與翻譯 四、基因體外翻譯的原理與操作3、基因體外翻譯系統(tǒng) （1）兔網(wǎng)織紅細(xì)胞系統(tǒng) 體外翻譯系統(tǒng)中兔網(wǎng)織紅細(xì)胞系統(tǒng)是真核體外翻譯系統(tǒng)中應(yīng)用最廣泛的一種，常用于較大的mRNA種類鑒定，基因產(chǎn)物性質(zhì)的分析，轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控的研究，以及共翻譯加工的研究等。 基因工程基因體外轉(zhuǎn)錄與翻譯

11、四 基因工程基因體外轉(zhuǎn)錄與翻譯 四、基因體外翻譯的原理與操作3、基因體外翻譯系統(tǒng) （2）麥芽提取物 Wheat Germ Extract 麥胚提取物的制備 通過(guò)碾磨麥胚，離心去除細(xì)胞殘?jiān)?，上清液通過(guò)層析將抑制翻譯的內(nèi)源氨基酸和植物色素等分離出去。 提取物用微球菌核酸酶處理 破壞內(nèi)源mRNA，是大限度降低翻譯背景。 提取物中添加磷酸肌酸和磷酸肌酸激酶的能量生成系統(tǒng)和增加鏈延伸效率的亞精胺，以及一定量的乙酸鎂。 麥胚提取物系統(tǒng)可穩(wěn)定地表達(dá)一些在兔網(wǎng)織紅細(xì)胞系統(tǒng)中翻譯受到抑制的DNA 基因工程基因體外轉(zhuǎn)錄與翻譯 四 基因工程基因體外轉(zhuǎn)錄與翻譯 四、基因體外翻譯的原理與操作3、基因體外翻譯系統(tǒng) （2）

12、麥芽提取物 Wheat Germ Extract 麥芽提取物是不同于網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物的另一個(gè)無(wú)細(xì)胞體外合成體系。由于內(nèi)源的mRNA很少，這個(gè)系統(tǒng)可用于各種病毒、酵母、高等植物乃至哺乳動(dòng)物蛋白的合成。當(dāng)表達(dá)產(chǎn)物較難與球蛋白區(qū)分（1215kD）、或者表達(dá)產(chǎn)物正好可能是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中富含而植物中沒(méi)有的調(diào)控因子一類的蛋白時(shí)、或者是不明原因表達(dá)不出時(shí)，就不妨嘗試麥芽提取物體系。不過(guò)要記住，這個(gè)體系要求RNA有帽子結(jié)構(gòu)才能更好的翻譯。如果上述情況又無(wú)法給RNA加帽，就只好借助大腸桿菌體系了 。 基因工程基因體外轉(zhuǎn)錄與翻譯 四 基因工程基因體外轉(zhuǎn)錄與翻譯 四、基因體外翻譯的原理與操作3、基因體外翻譯系統(tǒng) （

13、3）細(xì)菌提取物 E. coli Cell-Free System 原核系統(tǒng)主要利用大腸桿菌的提取物進(jìn)行表達(dá)。利用大腸桿菌體系進(jìn)行體外表達(dá)，某些蛋白質(zhì)每小時(shí)每個(gè)反應(yīng)（50ul）產(chǎn)物量可高達(dá)數(shù)百微克，在優(yōu)化的批量系統(tǒng)中蛋白最終的產(chǎn)量達(dá)到1mg/ml也是可能達(dá)到的，這一產(chǎn)率還可以通過(guò)連續(xù)反應(yīng)器進(jìn)一步得到提高。 人們可以根據(jù)需要加入特殊添加劑如蛋白酶抑制劑，分子伴侶，代謝物，非天然氨基酸甚至是少量的變性劑，也可摻入特殊標(biāo)記的氨基酸獲得帶標(biāo)記蛋白質(zhì)。這樣這種體系的彈性就非常大，可以加入許多其它優(yōu)化成份以提高產(chǎn)率和提高溶解性。 大腸桿菌的材料來(lái)源成本最低，實(shí)用性高，表達(dá)效率也高 基因工程基因體外轉(zhuǎn)錄與翻譯

14、 四 基因工程基因體外轉(zhuǎn)錄與翻譯 四、基因體外翻譯的原理與操作3、基因體外翻譯系統(tǒng) （3）細(xì)菌提取物 E. coli Cell-Free System s30原核體外翻譯系統(tǒng)的Ecolis30提取物是由OmpT內(nèi)切蛋白酶和Lon蛋白酶缺陷的EcoliB菌株制備，所以在s30系統(tǒng)中表達(dá)基因可以增加產(chǎn)物的穩(wěn)定性，尤其適用于在體外表達(dá)時(shí)易被蛋白酶降解的蛋白質(zhì) 。s30體外翻譯系統(tǒng)也適臺(tái)表達(dá)那些在體內(nèi)表達(dá)時(shí)由于宿主編碼的抑制酶作用而表達(dá)水平低的蛋白質(zhì)，使其能高水平表達(dá) 。s30系統(tǒng)還可用于轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控的研究 此外，s30體外翻譯系統(tǒng)的應(yīng)用還包括臺(tái)成少量標(biāo)記蛋白質(zhì)用于蛋白純化中作為示蹤物質(zhì)以及在蛋白質(zhì)

15、中摻人非天然的氨基酸用于研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)功能 基因工程基因體外轉(zhuǎn)錄與翻譯 四 基因工程基因體外轉(zhuǎn)錄與翻譯 四、基因體外翻譯的原理與操作3、基因體外翻譯系統(tǒng) 基因工程基因體外轉(zhuǎn)錄與翻譯 四 基因工程基因體外轉(zhuǎn)錄與翻譯 四、基因體外翻譯的原理與操作3、基因體外翻譯系統(tǒng)（4）對(duì)mRNA 要求 用原核和真核細(xì)胞的mRNA轉(zhuǎn)錄本有明顯的區(qū)別。通常真核mRNA帶有轉(zhuǎn)錄后加工的5-7 methyl-GTP cap 和3poly(A)tail，有助于增加mRNA的穩(wěn)定性，防止降解。同時(shí)5帽子結(jié)構(gòu)有助于核糖體與mRNA的結(jié)合和AUG起始密碼的正確識(shí)別。對(duì)應(yīng)不同的體外表達(dá)系統(tǒng)，我們?cè)谠O(shè)計(jì)RNA模版的時(shí)候就要區(qū)別對(duì)

16、待。 原核生物中，核糖體受一段富含嘌呤的SD序列引導(dǎo)從而識(shí)別AUG起始密碼。這段位于AUG上游的序列和30S核糖體亞基的16s rRNA一段序列互補(bǔ)，保守區(qū)5-UAAGGAGGUGA-3，核糖體結(jié)合位點(diǎn)RBS和起始密碼AUG之間的距離以及堿基的組成對(duì)翻譯的效率有顯著影響，在設(shè)計(jì)的時(shí)候要注意。 真核生物的那段保守序列成為Kozak序列（5-GCCACCAUGG-3），要高效翻譯，+1G和-3A就很重要。不過(guò)如果mRNA沒(méi)有這段Kozak序列而有一段適當(dāng)長(zhǎng)度5UTR也能夠有效地在無(wú)細(xì)胞體系中得到翻譯。 基因工程基因體外轉(zhuǎn)錄與翻譯 四 基因工程基因體外轉(zhuǎn)錄與翻譯 四、基因體外翻譯的原理與操作3、基因

17、體外翻譯系統(tǒng)（5）體外翻譯與轉(zhuǎn)錄的連接 基因工程基因體外轉(zhuǎn)錄與翻譯 四 基因工程基因體外轉(zhuǎn)錄與翻譯 五、基因體外翻譯的應(yīng)用1、基因產(chǎn)物的檢測(cè) 目前應(yīng)用的最普遍的可能就是這個(gè)用途，在獲得一段DNA序列后，通過(guò)啟始密碼子ATG（少數(shù)情況是GTG）和終止密碼子（TAA、TAG或者TGA）初步判斷為開放讀碼框（ORF）。利用快捷的體外表達(dá)可迅速確定此序列是否有表達(dá)產(chǎn)物、表達(dá)產(chǎn)物的特性等第一手信息。對(duì)于一次檢測(cè)多個(gè)ORF產(chǎn)物，這個(gè)方法尤為方便。 基因工程基因體外轉(zhuǎn)錄與翻譯 五 基因工程基因體外轉(zhuǎn)錄與翻譯 五、基因體外翻譯的應(yīng)用2 預(yù)合成 高通量蛋白表達(dá)和純化 在進(jìn)行體內(nèi)表達(dá)前往往先進(jìn)行體外表達(dá)，因?yàn)轶w外

18、表達(dá)可以表達(dá)一些毒性強(qiáng)、對(duì)水解敏感或者不穩(wěn)定的蛋白。另外，體外表達(dá)另一個(gè)優(yōu)勢(shì)就是可以合成時(shí)插入帶有光敏性、熒光或者生物素殘基等標(biāo)記，方便對(duì)蛋白進(jìn)行定位。一個(gè)典型的體外表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)量大約是50l，現(xiàn)在隨著技術(shù)的改進(jìn)許多公司的產(chǎn)品表達(dá)量也可以達(dá)到毫克級(jí)。 基因工程基因體外轉(zhuǎn)錄與翻譯 五 基因工程基因體外轉(zhuǎn)錄與翻譯 五、基因體外翻譯的應(yīng)用 3 高通量篩選篩選病毒特異翻譯抑制復(fù)合物篩選分子伴侶抑制藥物* 確定新型的孤受體（orphan receptor） 基因工程基因體外轉(zhuǎn)錄與翻譯 五 基因工程基因體外轉(zhuǎn)錄與翻譯 五、基因體外翻譯的應(yīng)用 4 分子結(jié)構(gòu)和定位分析* 膜蛋白研究 曾經(jīng)有實(shí)驗(yàn)證明在體外表達(dá)系統(tǒng)

19、中加入犬類的微粒體膜可以讓跨膜蛋白G蛋白偶連受體正確折疊。* 加入非天然氨基酸進(jìn)行標(biāo)記 有實(shí)驗(yàn)表明經(jīng)過(guò)修飾的帶賴氨酸反密碼子的tRNA可以將非天然的氨基酸插入到體外表達(dá)合成的多肽中。* 蛋白折疊和分子伴侶相互作用研究* 實(shí)時(shí)翻譯/折疊實(shí)驗(yàn)* 高分子組裝 基因工程基因體外轉(zhuǎn)錄與翻譯 五 基因工程基因體外轉(zhuǎn)錄與翻譯 五、基因體外翻譯的應(yīng)用 5 分子診斷* 蛋白截短實(shí)驗(yàn)（Protein truncation test ，PTT） 這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)發(fā)明1993年，可快速檢測(cè)出基因突變。 基因工程基因體外轉(zhuǎn)錄與翻譯 五 基因工程基因體外轉(zhuǎn)錄與翻譯 五、基因體外翻譯的應(yīng)用 6 功能基因組學(xué)體外表達(dá)克隆* 核糖體展示技術(shù) Ribosomal Display，RD 基因工程基因體外轉(zhuǎn)錄與翻譯 五 基因工程基因體外轉(zhuǎn)錄與翻譯 五、基因體外翻