生物分離工程第二章課件

1、第二章 細(xì)胞分離與破碎1總體學(xué)習(xí)目的和要求 通過本章學(xué)習(xí)，要求掌握細(xì)胞分離和目標(biāo)產(chǎn)物釋放的原理和方法，熟知各種方法的優(yōu)缺點(diǎn)和應(yīng)用范圍。 2收集含生化物質(zhì)的液相，分離除去固體懸浮物（細(xì)胞、菌體、細(xì)胞碎片、蛋白質(zhì)的沉淀物和它們的絮凝體等）。收集胞內(nèi)產(chǎn)物的細(xì)胞或菌體，分離除去液相。固液分離的目的32.1 細(xì)胞分離 重力沉降 離心沉降 過濾 4重力沉降 重力沉降是化工過程中常用的氣固、液固和液液分離手段，在生化分離過程中亦有一定程度的應(yīng)用。5 菌體和動(dòng)植物細(xì)胞的重力沉降雖然簡(jiǎn)便易行，但菌體細(xì)胞體積很小，沉降速度很慢。因此，實(shí)用上需使菌體細(xì)胞聚并成較大凝聚體顆粒后進(jìn)行沉降操作，提高沉降速度。 7提高重力

2、沉降的途徑加入中性鹽：雙電層排斥電位降低加入高分子絮凝劑：架橋作用形成大絮凝團(tuán)引入外力8應(yīng)用1878年 瑞典 牛奶奶油1896年 用于回收酵母離心分離技術(shù)在生工方面主要用于：分離DNA、大分子、菌體、動(dòng)植物細(xì)胞、胞內(nèi)產(chǎn)物。10離心沉降速度 離心設(shè)備的一個(gè)重要技術(shù)指標(biāo)是其所能達(dá)到的離心力與重力的比值，稱為分離因數(shù)。分離因數(shù)是衡量離心程度的參數(shù)，用Z表示 式中，r為離心半徑，即從旋轉(zhuǎn)軸心到沉降顆粒的距離，N為離心機(jī)的轉(zhuǎn)數(shù)(s-1) 。11離心沉降和重力沉降只是對(duì)沉降的作用力不同，因此，將式(1)中的g用Zg代替，可得離心沉降速度Vs為 或12提高離心沉降速度的主要措施d 顆粒直徑； S 固體顆粒密

3、度；L 液體介質(zhì)密度； L 液體介質(zhì)粘度； 旋轉(zhuǎn)角速度； r 轉(zhuǎn)軸中心到顆粒中心距離 增大dp增大S提高離心機(jī)轉(zhuǎn)數(shù)N提高離心半徑r降低液體粘度14離心分離法差速離心區(qū)帶離心 15 差速離心1718主要菌體和細(xì)胞的離心分離19區(qū)帶離心 區(qū)帶離心(Zonal centrifugation)是生化研究中的重要分離手段，根據(jù)離心操作條件不同，分為差速區(qū)帶離心(Rate zonal density gradient sedimentation)平衡區(qū)帶離心(Isopycnic density gradient sedimentation) 20 梯度 離心2122密度梯度離心（density gradi

4、ent） 生物大分子及顆粒的沉降不僅決定于它的大小，而且也取決于它的密度。顆粒在具有密度梯度的介質(zhì)中離心時(shí)，質(zhì)量和密度大的顆粒沉降的快，并且每種蛋白質(zhì)顆粒沉降到與自身密度相等的介質(zhì)密度梯度時(shí)，即停止不前，最后各自在離心管中被分離成獨(dú)立的區(qū)帶。分成區(qū)帶的樣品可以在管底刺一個(gè)小孔逐滴放出，分步收集。常用的介質(zhì)有蔗糖、氯化銫等。滴加樣品蔗糖濃度離心管蔗糖密度梯度24密度梯度沉降平衡法在核酸研究中的應(yīng)用1、核酸密度的測(cè)定 = o + 4.2 2(2- 02)10-102、測(cè)定DNA中G-C之含量 Rolfe-Meselson公式： = 0.100 xG-C + 1.6583、溶液中核酸構(gòu)象的研究 ：?jiǎn)?/p>

5、鏈DNA雙鏈DNA 蛋白質(zhì) 雙鏈DNA RNA4、核酸的制備 氯化銫密度梯度超離心經(jīng)染料-氯化銫密度梯度超離心后，質(zhì)粒DNA及各種雜質(zhì)的分布超螺旋DNA閉環(huán)質(zhì)粒DNA開環(huán)質(zhì)及線型DNA蛋白質(zhì)石蠟油25離心分離設(shè)備離心機(jī)是生化實(shí)驗(yàn)室及生化工業(yè)廣泛使用的分離設(shè)備。實(shí)驗(yàn)室用離心機(jī)以離心管式轉(zhuǎn)子離心機(jī)為主，離心操作為間歇式。 工業(yè)離心分離設(shè)備中，較為常用的有管式和碟片式兩大類。 27管式離心機(jī)碟片式離心機(jī)各種轉(zhuǎn)子區(qū)帶轉(zhuǎn)子分析轉(zhuǎn)子28管式離心機(jī)碟片式離心機(jī)29離心機(jī)的選用原則顆粒的大小、形狀及硬度原料液的組成、密度及粘度產(chǎn)物熱敏性30過濾 過濾速度 過濾設(shè)備 31過 濾 過濾操作是借助于過濾介質(zhì)，在一定

6、的壓力差P作用下，使懸浮液中的液體通過介質(zhì)的孔道，而固體顆粒被截留在介質(zhì)上，從而實(shí)現(xiàn)固液分離的單元操作。 過濾介質(zhì) : 過濾采用的多孔物質(zhì)?？椢餇罱橘|(zhì)，棉花、石棉、蠶絲、麻、羊毛及各種人造纖維與金屬絲等 多孔陶瓷介質(zhì)，此為特殊的介質(zhì)，低溫?zé)?，具有大量微?xì)孔道的濾管或?yàn)V板（其他多孔材料，PE等） 膜分離介質(zhì)，微濾分離等32（1）過濾推動(dòng)力：懸浮液自身壓強(qiáng)差、重力懸浮液的外加壓力過濾介質(zhì)的抽真空離心力（2）過濾阻力：介質(zhì)阻力濾餅阻力大多情況下，過濾阻力主要取決于濾餅阻力。33（3）過濾速率Rm表示介質(zhì)的阻力；Rc表示濾餅的阻力；L為濾液的粘度 34（4）過濾速度的強(qiáng)化a降低濾餅阻力如絮凝劑、凝固

7、劑助濾劑等。b降低濾液黏度 黏度愈低，過濾阻力愈小。加熱、去雜蛋白、絮凝、調(diào)pH、選擇合適的放罐時(shí)間。c降低懸浮液中懸浮固體的濃度過濾速度與獲得濾餅體積成反比。因此應(yīng)盡可能降低培養(yǎng)基配料濃度（如玉米粉、豆餅粉的濃度）。d. 對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行預(yù)處理，改善濾液性質(zhì)。35過濾設(shè)備 內(nèi)裝微孔濾膜 進(jìn)液口出液口微孔濾膜濾器3637生化分離中，工業(yè)規(guī)模過濾設(shè)備主要有加壓葉濾機(jī)、板框過濾機(jī)、旋轉(zhuǎn)真空過濾機(jī)。38板框壓濾機(jī) plate and frame filter 板框壓濾機(jī)的過濾推動(dòng)力來自泵產(chǎn)生的液壓或進(jìn)料貯槽中的氣壓。 廣泛應(yīng)用于培養(yǎng)基制備的過濾及霉菌、放線菌、酵母菌和細(xì)菌等多種發(fā)酵液的固液分離。適合于固

8、體含量1-10%的懸浮液的分離。 392.2 細(xì)胞破碎理解：各種細(xì)胞破碎方法、原理、優(yōu)缺點(diǎn)及其適用范圍。 應(yīng)用：采用不同的細(xì)胞破碎方法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行不同程度的破碎。 40一、概述大多數(shù)情況下，抗生素，胞外酶，一些多糖，及氨基酸等目標(biāo)產(chǎn)物存在于發(fā)酵液中。有些目標(biāo)產(chǎn)物存在于生物體中。尤其是由基因工程菌產(chǎn)生的大多數(shù)蛋白質(zhì)是在細(xì)胞內(nèi)沉積。脂類物質(zhì)和一些有用酶包含在生物體中。41*細(xì)胞破碎（cell rupture）技術(shù)是指利用外力破壞細(xì)胞膜和細(xì)胞壁，使細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)包括目的產(chǎn)物成分釋放出來的技術(shù)。細(xì)胞破碎技術(shù)是分離純化細(xì)胞內(nèi)合成的非分泌型生化物質(zhì)（產(chǎn)品）的基礎(chǔ)。為了研究細(xì)胞破碎，提高其破碎率，有必要了解各種生

9、物細(xì)胞壁的組成和結(jié)構(gòu)。42二、常見細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)細(xì)菌酵母霉菌葡聚糖糖蛋白蛋白質(zhì)幾丁質(zhì)43三、細(xì)胞破碎技術(shù)壓縮/撞擊作用剪切作用撞擊法44機(jī)械破碎搗碎法研磨法勻漿法超聲法 物理破碎溫度差破碎法壓力差破碎法化學(xué)破碎有機(jī)溶劑表面活性劑酸堿酶促破碎自溶法外加酶制劑法通過機(jī)械運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的剪切力，使組織、細(xì)胞破碎。通過各種物理因素的作用，使組織、細(xì)胞的外層結(jié)構(gòu)破壞，而使細(xì)胞破碎。通過各種化學(xué)試劑對(duì)細(xì)胞膜的作用，而使細(xì)胞破碎通過細(xì)胞本身的酶系或外加酶制劑的催化作用，使細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)受到破壞，而達(dá)到細(xì)胞破碎四、細(xì)胞破碎方法及其原理45（一）機(jī)械法機(jī)械破碎法又可分為高壓勻漿破碎法（homogenization）高速珠

10、磨破碎法（bead grinding）超聲波破碎法（ultrasonication）461 高壓勻漿法高壓勻漿又稱高壓剪切破碎。高壓勻漿器的破碎原理是：細(xì)胞懸浮液在高壓作用下從閥座與閥桿之間的環(huán)隙高速(可達(dá)到450m/s)噴出后撞擊到碰撞環(huán)上，細(xì)胞在受到高速撞擊作用后，急劇釋放到低壓環(huán)境，從而在撞擊力和剪切力等綜合作用下破碎。高壓勻漿器的操作壓力通常為50-70MPa。 474849高壓勻漿法中影響細(xì)胞破碎的因素主要有壓力、循環(huán)操作次數(shù)和溫度。細(xì)胞破碎率S與操作壓力P和循環(huán)操作次數(shù)N之間的關(guān)系可表達(dá)為細(xì)胞破碎率用胞內(nèi)產(chǎn)物釋放率表示,是單位質(zhì)量細(xì)胞的產(chǎn)物釋放量，mg/cell 50式中：S 破碎

11、率，為N次循環(huán)后，蛋白質(zhì)的釋放量R與最大釋放量Rmax之比； k 與溫度有關(guān)的速度常數(shù)； P 操作壓力，MPa； 、b 與微生物種類和培養(yǎng)條件有關(guān)的常數(shù)。51高壓勻漿法適用于酵母和大多數(shù)細(xì)菌細(xì)胞的破碎，料液細(xì)胞濃度可達(dá)到20左右。團(tuán)狀和系狀菌易造成高壓勻漿器堵塞，一般不宜使用高壓勻漿法。高壓勻漿操作的溫度上升約2 310MPa，為保護(hù)目標(biāo)產(chǎn)物的生物活性，需對(duì)料液作冷卻處理，多級(jí)破碎操作中需在級(jí)間設(shè)置冷卻裝置。因?yàn)榱弦和ㄟ^勻漿器的時(shí)間很短，通過勻漿器后迅速冷卻，可有效防止溫度上升，保護(hù)產(chǎn)物活性。 522 珠磨法 bead mill珠磨是常用的方法細(xì)胞懸浮液與極細(xì)的玻璃小珠、石英砂、氧化鋁等研磨劑

12、（直徑小于1mm）一起快速攪拌或研磨，研磨劑、珠子與細(xì)胞之間的互相剪切、碰撞，使細(xì)胞破碎，釋放出內(nèi)含物。在工業(yè)規(guī)模的破碎中，常采用高速珠磨機(jī)WSK臥式高效全能珠磨機(jī)53（1）高速珠磨機(jī)工作原理磨室內(nèi)放置玻璃小珠，裝在同心軸上的圓盤攪拌器高速旋轉(zhuǎn)，使細(xì)胞懸浮液和玻璃小珠相互攪動(dòng)；細(xì)胞破碎是由剪切力層之間的碰撞和磨料滾動(dòng)引起在出口處，旋轉(zhuǎn)圓盤和出口平板之間的狹縫很小，可阻擋玻璃小珠，使不被料液帶出。由于操作過程中會(huì)產(chǎn)生熱量，故磨室還裝有冷卻夾套，以冷卻細(xì)胞懸浮液和玻璃小珠。54 珠磨法破碎操作時(shí)，產(chǎn)生大量的熱能。但有效能量利用率僅為1左右。 在設(shè)計(jì)操作時(shí)應(yīng)充分考慮換熱能力問題。 珠磨法適用于絕大多

13、數(shù)微生物細(xì)胞的破碎，但與高壓均質(zhì)法相比，影響破碎率的操作參數(shù)很多，操作過程的優(yōu)化設(shè)計(jì)較復(fù)雜。55珠磨法(Bead milling)破碎細(xì)胞可采用間歇或連續(xù)操作。兩種情況下細(xì)胞的破碎動(dòng)力學(xué)均可近似表示 其中k為破碎速率常數(shù) t在間歇操作時(shí)為破碎操作時(shí)間，連續(xù)操作時(shí)為細(xì)胞懸浮液在破碎室內(nèi)的平均停留時(shí)間 56式中：S 破碎率；k破碎速率常數(shù)；k與攪拌轉(zhuǎn)速、細(xì)胞懸浮液濃度和循環(huán)速度、玻璃小珠裝量和珠體直徑，以及溫度等相關(guān)。57 噴霧撞擊法 細(xì)胞是彈性體，比一般的剛性固體例子難于破碎。將細(xì)胞冷凍使其成為剛性球體，降低破碎的難度。噴霧撞擊破碎正是基于這樣的原理。 如下圖，細(xì)胞懸浮液以噴霧狀高速凍結(jié)（凍結(jié)速

14、度為每分鐘數(shù)千 ），形成粒徑小于50微米的微粒子。高速載氣(如N2，流速為300m/s)將凍結(jié)的微粒子送入破碎室，高速撞擊撞擊板，使凍結(jié)的細(xì)胞發(fā)生破碎。噴霧撞擊破碎的結(jié)構(gòu)58 與珠磨法和高壓均質(zhì)法相比， 本方法中，細(xì)胞破碎僅發(fā)生在與撞擊板撞擊的瞬間，細(xì)胞破碎程度均勻，可避免細(xì)胞反復(fù)受力發(fā)生過度破碎的現(xiàn)象 細(xì)胞破碎程度可通過無級(jí)調(diào)節(jié)載氣壓力（流速）控制，避免細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的破壞，適用于細(xì)胞器（線粒體、葉綠體等）的回收。 噴霧撞擊破碎適用于大多數(shù)微生物細(xì)胞和植物細(xì)胞的破碎，通常處理細(xì)胞懸浮液質(zhì)量濃度為100200g/L。實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的撞擊破碎器間歇處理能力約50500mL，而工業(yè)規(guī)模的連續(xù)處理能力在1

15、0L/h以上。59 針對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物的性質(zhì)（如相對(duì)分子質(zhì)量、 分子形態(tài)、穩(wěn)定性等），選擇合適的細(xì)胞破碎法，并確定適宜的破碎操作條件是非常重要的。 如核酸相對(duì)分子質(zhì)量很大，破碎中易受剪切損傷。 利用高壓均質(zhì)、珠磨、超聲波和噴霧破碎等數(shù)種機(jī)械破碎器破碎大腸桿菌，提取質(zhì)粒DNA的研究表明，只有珠磨法的完整質(zhì)粒收率在90以上，而其他方法的收率低于50。 60超聲波破碎 超聲波破碎法(Ultrasonication)利用發(fā)射1525kHz的超聲波探頭處理細(xì)胞懸浮液。超聲波破碎的機(jī)理是：在超聲波作用下液體發(fā)生空化作用(cavitation)，空穴的形成、增大和閉合產(chǎn)生極大的沖擊波和剪切力，使細(xì)胞破碎。超聲波的

16、細(xì)胞破碎效率與細(xì)胞種類、濃度和超聲波的聲頻、聲能有關(guān)。 61JY92-II D超聲波細(xì)胞破碎機(jī)62超聲波破碎的適用范圍超聲波破碎適用于多數(shù)微生物的破碎。一般桿菌比球菌易破碎，G-細(xì)菌比G+細(xì)菌易破碎，對(duì)酵母菌的效果較差。但超聲波產(chǎn)生的化學(xué)自由基團(tuán)能使某些敏感性活性物質(zhì)失活。超聲波破碎的有效能量利用率極低。由于對(duì)冷卻的要求相當(dāng)苛刻，所以不易放大，但在實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模細(xì)胞破碎中常用。63不同機(jī)械破碎方法的比較64（二）化學(xué)和生物化學(xué)滲透酸、堿處理 化學(xué)試劑處理 酶溶 651、酸堿處理 蛋白質(zhì)為兩性電解質(zhì)，改變pH可改變其荷電性質(zhì)，使蛋白質(zhì)之間或蛋白質(zhì)與其他物質(zhì)之間的相互作用力降低而易于溶解。因此，利用

17、酸堿調(diào)節(jié)pH值，可提高目標(biāo)產(chǎn)物溶解度 。662、化學(xué)試劑處理 用表面活性劑(如十二烷基硫酸鈉，Triton X100等)、螯合劑(如乙二胺四乙酸，簡(jiǎn)稱EDTA)、鹽(改變離子強(qiáng)度)或有機(jī)溶劑(苯、甲苯等)處理細(xì)胞，可增大細(xì)胞壁通透性。脲(urea)和鹽酸胍(guanidine HCl)等變性劑(chaotropic agent)能破壞氫鍵作用，降低胞內(nèi)產(chǎn)物之間的相互作用，使之容易釋放。 673、酶溶 酶溶法(Enzymatic lysis)利用溶解細(xì)胞壁的酶處理菌體細(xì)胞，使細(xì)胞壁受到部分或完全破壞后，再利用滲透壓沖擊等方法破壞細(xì)胞膜，進(jìn)一步增大胞內(nèi)產(chǎn)物的通透性。 68 外加酶法常用的溶酶溶菌酶

18、蝸牛酶葡聚糖酶蛋白酶纖維素酶糖苷酶肽鍵內(nèi)切酶殼多糖酶69酶解法的優(yōu)缺點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn)：發(fā)生酶解的條件溫和。能選擇性地釋放產(chǎn)物。胞內(nèi)核酸等泄出量少，細(xì)胞外形較完整。與機(jī)械法結(jié)合大大提高破碎率。缺點(diǎn)：溶解酶價(jià)格高。溶酶法通用性差（不同菌種需選擇不同的酶)。 70溶菌酶(lysozyme)適用于革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞壁的分解，應(yīng)用于革蘭氏陰性菌時(shí)，需輔以EDTA使之更有效地作用于細(xì)胞壁；酵母細(xì)胞的酶溶需用Zymolyase(幾種細(xì)菌酶的混合物)、-1,6葡聚糖酶(-1，6-dextranase)或甘露糖酶(mannanase)；破壞植物細(xì)胞壁需用纖維素酶(cellulase)。 71化學(xué)滲透法比機(jī)械破碎速度低，效率差，并且化學(xué)或生化試劑的添加形成新的污染，給進(jìn)一步的分離純化增添麻煩。但是，化學(xué)滲透法比機(jī)械破碎的選擇性高，胞內(nèi)產(chǎn)物的總釋放率低，特別是可有效地抑制核酸的釋放，料液粘度小，有利于后處理過程。 72（三）物理滲透法 滲透壓沖擊法凍結(jié)融化法73（1）滲透壓沖擊法 滲透壓沖擊是較溫和的一種破碎方法通過滲透壓的改變，引起細(xì)胞快速膨脹而破裂。 僅適用于細(xì)胞壁較脆弱的細(xì)胞或細(xì)胞壁預(yù)先用酶處理或在培養(yǎng)過程中加入某些抑制劑（如抗生素等），使細(xì)胞壁有缺陷，強(qiáng)度減弱。74 （2）凍結(jié)融化法 將細(xì)胞放在低溫下冷凍（約-15）