多種腫瘤標(biāo)志物課件

1、張 鵬 主任技師天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院腫瘤標(biāo)志物簡介及臨床應(yīng)用人體癌癥地圖在腫瘤發(fā)生和增殖過程中，由腫瘤細(xì)胞合 成、釋放、或者是宿主對腫瘤反應(yīng)產(chǎn)生的 一類生化物質(zhì)在血液、體液及組織中腫瘤標(biāo)志物的定量 或定性檢測可以作為腫瘤篩查（僅AFP與 PSA用于高危人群）、鑒別診斷、治療后 病情監(jiān)測及預(yù)后判斷的標(biāo)志與依據(jù)腫瘤標(biāo)志物 【tumor markers TM】腫瘤標(biāo)志物應(yīng)用的一般準(zhǔn)則是大分子物質(zhì)(多為糖蛋白或脂蛋白成分),其在外周血 和/或其他體液中的表達(dá)和濃度變化與惡 性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切在腫瘤細(xì)胞表面或腫瘤細(xì)胞內(nèi)合成，或通過其它細(xì)胞誘 導(dǎo)而成用于診斷的“理想標(biāo)志物”應(yīng)具備：僅在細(xì)胞 惡變后

2、才產(chǎn)生、分泌到血中，濃度可達(dá)被檢測 到；一經(jīng)檢測即可知腫瘤發(fā)生的部位目前臨床應(yīng)用腫瘤標(biāo)志物現(xiàn)狀理想形式特異性100%真陰性100%假陽性 0%健康人臨界值敏感性100%真陽性100%假陰性 0%腫瘤患者實(shí)際狀況假陰性假陽性臨界值敏感性100%特異性- 60%健康人腫瘤患者特異性100%敏感性- 50%敏感性上升特異性上升腫瘤標(biāo)志物參數(shù)在健康人和腫瘤患者兩組人群間的區(qū)別實(shí)際狀態(tài)：假陰性和假陽性在選擇臨界值中的作用：特異性越高，敏感性越低，反之亦然TM敏感性和特異性在診斷上的意義關(guān)鍵依賴于腫瘤分期和對照組的選擇，只有 腫瘤分期確定后，敏感性的數(shù)據(jù)才是可靠的只有對照組有明確限定特征，其特異性才有 意

3、義目前研究結(jié)果不僅是特異性和敏感性，還應(yīng) 指出群體研究中的個(gè)體結(jié)果以及普遍的分類TM的臨界值設(shè)定原則臨界值是指某一TM在正常人或良性疾病患者中 的假定上限值臨界值無固定數(shù)值，可隨試驗(yàn)的目的而改變；鑒 定盡可能多的腫瘤患者，降低臨界值以增加其敏 感性（假陽性，特異性）最大可能地指示出腫瘤發(fā)生，臨界值可設(shè)定得高 些，以增加其特異性（假陰性，敏感性）TM的診斷價(jià)值很大程度上取決于臨界值的選擇； 在相對于健康人和良性疾病患者特異性為95%的 臨界值水平上比較其數(shù)據(jù)，可提高此TM的敏感性臨床實(shí)驗(yàn)室選用腫瘤標(biāo)志物試驗(yàn)的要求可靠性和重復(fù)性批內(nèi)變異 5%批間變異10%寬分析范圍合理收費(fèi)和減輕工作人員負(fù)擔(dān)高特異

4、性95%高敏感性50%最佳陽性和陰性預(yù)期值（PV）與腫瘤大小的相關(guān)性本地區(qū)適合的試劑和批號敏感性（%）特異性（%）10080-60-40-20-0100 80 60 40 20 0標(biāo)志A標(biāo)志B兩條ROC（接受器工作特性）曲線，A在對照組和惡性腫瘤之間分布好，B不能進(jìn)行分布腫瘤胚胎性抗原 甲胎蛋白（AFP）、癌胚抗原（CEA）異位激素 絨毛膜促性腺激素（HCG）、促腎上腺皮質(zhì)激素 （ACTH）、降鈣素酶和同工酶 乳酸脫氫酶（LDH） 神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE） 前列腺酸性磷酸酶（PAP）血漿蛋白 2巨球蛋白（PsM）細(xì)胞代謝產(chǎn)物 脂質(zhì)相關(guān)涎酸腫瘤抗原 CAl99、CAl25癌基因和抑癌基因蛋

5、白產(chǎn)物 cmyc、ras、p53、Rb微量元素 砷、銅、鐵、硒、鋅腫瘤標(biāo)志物分類生化特性： 糖蛋白，4560%糖，電泳遷移率，6個(gè) 抗原決定基分子量： 180,000發(fā)生部位： 胚胎及胎兒腸黏膜參考值范圍：3ng/ml臨床應(yīng)用： 監(jiān)測結(jié)直腸癌、胃癌、乳腺癌和支氣管 癌病程及療效影響因素： 5%吸煙者檢測值可至2.55ng/ml， 1%至1020ng/ml；肝炎疾病可使CEA 水平短暫升高癌胚抗原 【CEA】99mTc(鍀）標(biāo)記抗癌胚抗原單抗C50片段Fab生化特性： 單鏈糖蛋白，前列腺分泌產(chǎn)物分子量： 36，000發(fā)生部位： 前列腺分泌腺管參考值范圍：3.7ng/ml臨床應(yīng)用： 監(jiān)測前列腺癌影

6、響因素： 具有組織特異性，但不是腫瘤所特異 的，注意：應(yīng)在直腸癌指診前取血， 前列腺癌患者多高于10ng/ml前列腺特異抗原 【 t-PSA】PCR及重疊延伸產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳 構(gòu)建抗前列腺特異抗原(PSA)單鏈抗體（scFv）/人羧肽酶A（hCPA） 融合 基因 總PSA（t-PSA）中80%以結(jié)合形式存在，稱復(fù)合PSA（c-PSA）；20%以游離形式存在，稱游離PSA（f-PSA）；t-PSA及f-PSA升高，而f-PSA/t-PSA比值降低，提示前列腺癌當(dāng)總PSA在3.010.0ng/ml時(shí)，f-PSA/t-PSA比值低于0.190.10時(shí)，前列腺癌的可能性較大生化特性： 糖蛋白，由兩

7、個(gè)單克隆抗體： 1.115D8抗乳脂膜及2.DF3抗乳腺癌 細(xì)胞系所證實(shí)分子量： 115D8： 400，000；DF3290，000發(fā)生部位： 乳腺癌細(xì)胞和某些上皮細(xì)胞參考值范圍：28U/ml臨床應(yīng)用： 監(jiān)測乳腺癌療效影響因素： 與CEA聯(lián)合檢測癌抗原15-3 【CA15-3】糖與多肽連接的兩種方式 ？是1984年由Kufer和Hilkens發(fā)現(xiàn)，是由鼠抗人乳腺癌肝細(xì)胞轉(zhuǎn)移株的膜的單克隆抗體DF3制備的生化特性： 糖蛋白,以卵巢癌細(xì)胞系免疫所獲 單克隆抗體所證實(shí)分子量： 200,000發(fā)生部位： 卵巢癌(膜結(jié)合物),胎兒和成人支氣 管正常上皮細(xì)胞參考值范圍：35U/ml (65U/ml)臨床應(yīng)

8、用： 監(jiān)測卵巢癌病程及療效，透明細(xì)胞癌，子宮內(nèi)膜癌、輸卵 管埃及未分化卵巢癌明顯升高影響因素： 來源于體腔上皮細(xì)胞衍生物的分化抗原(Mller管上皮),特 異性低；血清濃度輕微升高正常婦女，以及良性卵巢疾患， 懷孕前3個(gè)月、行經(jīng)期、肝硬化、子宮纖維變性、急性輸卵 管炎、胸膜炎和心包感染等也稍高。 糖類抗原125 【 CA125】1981年由Bast發(fā)現(xiàn)的由鼠抗人乳頭狀囊性卵巢上皮細(xì)胞系OC125制備而成生化特性： 烯醇化酶二聚體分子量： 87,000發(fā)生部位： 神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞,紅細(xì)胞,血小板參考值范圍：12.5ng/ml 臨床應(yīng)用： 神經(jīng)元特異性烯醇化酶是小細(xì)胞肺癌(SCLC

9、)和神經(jīng)母細(xì)胞瘤的腫瘤標(biāo)志物，可用于鑒別診斷、病情監(jiān)測、療效評價(jià)和復(fù)發(fā)預(yù)報(bào)。用神經(jīng)元特異性烯醇化酶監(jiān)測小細(xì)胞肺癌的復(fù)發(fā)，比臨床確定復(fù)發(fā)要早412周。神經(jīng)元特異性烯醇化酶還可用于神經(jīng)母細(xì)胞瘤和腎母細(xì)胞瘤的鑒別診斷，前者神經(jīng)元特異性烯醇化酶異常增高而后者增高不明顯。增高：見于小細(xì)胞肺癌（最敏感最特異的腫瘤標(biāo)志物之一） 、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞腫瘤（如嗜鉻細(xì)胞瘤、胰島細(xì)胞瘤、黑色素瘤）等影響因素： 不要將血放置太久，否則將出現(xiàn)假高值；一 小時(shí)內(nèi)離心；檢測SCLC時(shí)，與CEA聯(lián)合應(yīng)用神經(jīng)特異性烯醇化酶 【 NSE】生化特性： 糖蛋白激素，由兩個(gè)非共價(jià)結(jié)合的亞單 位組成，a ，分子量： a：14,

10、000；：24,000發(fā)生部位： 胎盤合體滋養(yǎng)層,滋養(yǎng)層組織中的胚細(xì)胞 腫瘤,合體滋養(yǎng)層巨細(xì)胞(精原細(xì)胞來源 許多中空器官的上皮細(xì)胞成分)參考值范圍：男性:05mU/ml 臨床應(yīng)用： 非精原細(xì)胞瘤胚芽細(xì)胞瘤(4886%),睪 丸或胎盤絨毛膜腫瘤(100%),胞蟲囊狀 痣(97%),精原細(xì)胞瘤(合并腫瘤)(714%)人絨毛膜促性腺激素【HCG】RNA的甲醛變性膠電泳結(jié)果，可見清晰的18S、28S兩條帶及其距加樣孔的距離 PCR擴(kuò)增后進(jìn)行PAGE電泳及放射自顯影結(jié)果箭頭所示條帶T26只在絨癌中顯示，在正常絨毛中不顯示 生化特性： 增生性抗原,多肽，由B1、B2和C三個(gè)亞基組成，其 活性主要在B1分

11、子量： 17,00043,000發(fā)生部位： 卵黃囊,胚胎肝參考值范圍：80U/L臨床應(yīng)用： 膀胱癌？正常人陽性率4.7%。但有相當(dāng)一部分非惡性腫瘤患者血清中有TPA存在，其陽性率約為14%35%，以下呼吸道、肝及尿路感染者多見，故TPA亦非腫瘤所特有的標(biāo)志。但在惡性腫瘤者中，TPA的增高往往是持續(xù)性的，因此，若進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測，常常有利于惡性腫瘤與非惡性病變的鑒別 影響因素： 測定值80:膀胱、支氣管、卵巢、胃癌，可能為肝，腎，肺等疾??；特異性低組織多肽抗原【TPA】生化特性： 多肽（32個(gè)氨基酸）分子量： 3,500發(fā)生部位： C細(xì)胞，胸腺也有分泌降鈣素的機(jī)能 參考值范圍： 100pg/ml臨床

12、應(yīng)用： 甲狀腺髓樣癌：此種癌起源于甲狀腺濾泡旁細(xì)胞（C細(xì)胞），可產(chǎn)生多種生物活性物質(zhì)，其中以降鈣素為主?；颊哐褰碘}素水平高于正常數(shù)十到數(shù)百倍。如經(jīng)手術(shù)治療，則降鈣素水平恢復(fù)正常影響因素： 適用于危險(xiǎn)人群篩查和輔助診斷；肺小細(xì)胞癌可產(chǎn)生多種激素，其中包括降鈣素 降鈣素生化特性： 糖蛋白,即由兩個(gè)單克隆抗體所識別的 TAG72:1:CC49,2:B72-3分子量： 400,000發(fā)生部位： 上皮細(xì)胞參考值范圍： 3U/ml臨床應(yīng)用： 胃癌,卵巢粘液癌影響因素: 與CEA聯(lián)合檢測胃癌,卵巢癌的 第二選擇標(biāo)志物癌抗原72-4 【 CA72-4】1989年由Gero首先測定生化特性： 糖蛋白,腫瘤抗原

13、T4分子量： 48,000發(fā)生部位： 主要存在于子宮頸鱗狀細(xì)胞癌,正常 鱗狀上皮參考值范圍：2.5ng/ml臨床應(yīng)用： 監(jiān)測宮頸、耳、鼻、喉、肺和食管鱗 狀細(xì)胞癌病程及治療影響因素： 被皮膚或唾液污染后可導(dǎo)致假性高值鱗狀上皮細(xì)胞癌抗原 【 SCC】生化特性： 細(xì)胞角蛋白片段19分子量： 30,000發(fā)生部位： 存在于許多組織中，特別是肺中參考值范圍： 3.3ng/ml臨床應(yīng)用： 非小細(xì)胞肺癌影響因素： 被唾液污染后可導(dǎo)致假性高值細(xì)胞角蛋白組分19 【 CYFRA21-1】細(xì)胞角蛋白陽性細(xì)胞肺癌腦轉(zhuǎn)移糖類抗原242 【 CA242】CA242是一種唾液酸化的新型粘蛋白類糖類腫瘤抗原1993年P(guān)u

14、jol等采用遲緩銪鑭熒光分析技術(shù)測定102例NSCLC患者血清CA242濃度，CA242血清濃度閾值為20.0U/ml，結(jié)果其敏感性及特異性分別為28.5%和95.6%。肺鱗癌患者血清CA242水平顯著低于非鱗癌(腺癌和大細(xì)胞肺癌)患者，發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者的CA242濃度高于未轉(zhuǎn)移者，且期濃度逐漸增加。從整體角度看，CA242水平與生存不相關(guān)，但是，在不能手術(shù)切除的NSCLC患者中，CA242濃度升高患者的生存期較濃度低于20U/ml患者顯著短。由于CA242敏感性較低，對NSCLC的診斷無意義CA242可作為胰腺癌和結(jié)腸癌校好的腫瘤標(biāo)志物，其靈敏度與CA19-9相仿，但特異性、診斷效率則優(yōu)于CA

15、19-9參考值： 25U/mlCA549也是乳腺癌的標(biāo)志物，它是一種酸性 糖蛋白大部分健康女性11 UmL異常升高者比例并不高，可見于50%乳腺 癌、卵巢癌、40%前列腺癌、33%肺癌患 者。由此，作為乳腺癌的早期診斷，CA則 還較欠缺，應(yīng)聯(lián)合應(yīng)用其它TM糖類抗原594【CA549】血清堿性磷酸酶【ALP 或AKP 】是一組底物特異性較低，在堿性環(huán)境中能水解很多磷酸單酯化合物的酶AFP在器官組織的含量：肝腎胎盤小腸骨磷酸對硝基酚（底物）2-氨基-2-甲基-1-丙酮（受體）+ALP對硝基酚+堿性溶液405nm變黃色，連續(xù)監(jiān)測法參考值：女性：112歲500U/L；15歲，40150U/L 男性：1

16、12歲500U/L；1215歲，750U/L 15歲，40150U/LAFP活力測定常作為肝膽疾病和骨骼疾病的臨床輔助診斷指標(biāo)。升高：骨Paget病、膽道梗阻、惡性腫瘤骨轉(zhuǎn)移或肝轉(zhuǎn)移、佝僂病、骨軟化、成骨細(xì)胞瘤、甲狀旁腺功能亢進(jìn)及骨折愈合期降低：少見，呆小癥、磷酸酶過少癥、維生素C缺乏癥。甲功低下、惡性貧血臨床意義阻塞性黃疸、肝硬化、肝壞死，堿性磷酸酶明顯升高（肝細(xì)胞性黃疸則升高不明顯） 原發(fā)性和繼發(fā)性肝癌時(shí)堿性磷酸酶亦明顯升高，與癌組織中或癌腫周圍肝細(xì)胞合成堿性磷酸酶增加有關(guān)其他腫瘤如乳腺癌、肺癌、卵巢癌、骨細(xì)胞瘤、骨肉瘤等，堿性磷酸酶增高時(shí)，提示可能有肝臟轉(zhuǎn)移 變形性骨炎、成骨細(xì)胞癌、佝僂

17、病、骨軟化、甲狀腺及甲狀旁腺功能亢進(jìn)、腎小管性酸中毒、遺傳性磷酸酶過多癥 很多藥物可使堿性磷酸酶增高，如巴比妥類、抗生素（紅霉素、慶大霉素、氯霉素、卡那霉素、氨芐青霉素等 常見于重癥慢性腎炎、乳糜瀉、貧血、惡病質(zhì)、兒童甲狀腺功能不全或減退、維生素C缺乏癥壞血?。I養(yǎng)不良、呆小癥、遺傳性低磷酸酶血癥。 增 高減 低血清堿性磷酸酶【ALP 或AKP 】酸性磷酸酶測定【ACP】磷酸麝香草酚酞（YMP）ACP麝香草酚酞 + 無機(jī)磷堿液終止反應(yīng)麝香草酚酞 呈藍(lán)色595nm-磷酸萘胺 ACP 酸性條件-萘胺 + 磷酸固紅TR鹽重氮化合物總酸性磷酸酶活性非前列腺酸性磷酸酶活性=前列腺酸性磷酸酶活性酒石酸抑

18、制405nm參考值：成人總酶活性為09U/L，前列腺酸性磷酸酶活性為03U/LACP含量無性別差異，新生兒出生后1個(gè)月血清酶活性甚高，隨年齡增長而逐漸下降；青春期又可出現(xiàn)一活性峰值，至20歲降至成人水平ACP主要用于前列腺癌的輔助診斷及療效觀察指標(biāo)，特別是轉(zhuǎn)移時(shí)，血清ACP可明顯增高溶血性疾病、變形性骨炎、急性尿潴留及近期做過直腸檢查者，此酶也可增高臨床意義P53蛋白是一種由393個(gè)氨基酸組成的含磷蛋白，位于細(xì)胞核。研究發(fā)現(xiàn)在癌旁正常和鱗狀化生的支氣管上皮未見P53蛋白表達(dá)，在輕中重度不典型增生、原位癌、浸潤癌中，P53蛋白表達(dá)的陽性率逐漸升高，表明P53基因與肺癌發(fā)生有關(guān)對P53基因的不同類

19、型腫瘤中突變頻率檢測結(jié)果，鱗癌為63.6%，腺癌為65%，發(fā)現(xiàn)P53蛋白在不同分化程度肺癌組織之間無顯著性差異，但在肺鱗癌組織中隨分化程度降低P53表達(dá)卻增強(qiáng)，認(rèn)為P53蛋白與肺鱗癌的關(guān)系可能較肺腺癌更為密切。而且在肺鱗癌伴有和不伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病例中，P53表達(dá)無顯著性差異，而肺腺癌中伴有與不伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者P53表達(dá)具有顯著性差異，提示P53過度表達(dá)與肺腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)P53蛋白鱗癌P53細(xì)胞核陽性bcl-2蛋白是原癌基因bcl-2編碼的一種能調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡而不影響細(xì)胞增殖的蛋白質(zhì)，1993年P(guān)ezzella等研究bcl-2在NSCLC患者中的表達(dá)與預(yù)后之間的關(guān)系。該實(shí)驗(yàn)采用bcl-2特異性

20、單克隆抗體及免疫組化染色測定80例肺鱗癌及42例肺腺癌患者腫瘤組織中bcl-2蛋白。結(jié)果25%(20/80)的鱗癌患者及12%(5/42)的腺癌患者bcl-2蛋白陽性，在鄰近的正常呼吸道上皮中，bcl-2蛋白僅存在于基底細(xì)胞。bcl-2蛋白陽性患者的5年生存率高于陰性患者(P0.1)，年齡為60歲或60歲以上bcl-2蛋白陽性患者的預(yù)后最好(P0.02)。該研究表明，原癌基因bcl-2在肺癌患者中發(fā)生異常表達(dá)，其表達(dá)與預(yù)后有一定關(guān)系原癌基因bcl-2蛋白腫瘤標(biāo)志物的組合應(yīng)用-標(biāo)志 CEA ARP CA19-9 CA72-4 CA125 CA15-3 SCC HCG 腫瘤結(jié)腸 胰腺 胃 食道 肝

21、臟 膽囊 乳腺 卵巢 子宮頸 絨毛膜 腫瘤標(biāo)志物的組合應(yīng)用-標(biāo)志 CEA ARP NSE SCC CYFRA21-1 HCG PSA TPA Calcitonin HTG 腫瘤肺（SCLC） 肺（NSCLS） 胚胎細(xì)胞 前列腺 膀胱 甲狀腺 C-細(xì)胞 耳鼻咽喉 臨床檢測腫瘤標(biāo)志物試驗(yàn)方法進(jìn)展單相瓊脂擴(kuò)散法雙相瓊脂擴(kuò)散法血凝法對流電泳法火箭電泳法放射免疫法（RIA）免疫放射法（IRMA） ELISA法斑點(diǎn)法金標(biāo)法熒光免疫法化學(xué)發(fā)光法（CLIA）電化學(xué)發(fā)光法（ECLIA）分子生物學(xué)雙相瓊脂擴(kuò)散法單相瓊脂擴(kuò)散法抗體與凝膠混合后，裝于小玻璃管中，待凝固后加入抗原溶液，使其擴(kuò)散入凝膠與抗體反應(yīng)形成環(huán)狀乳

22、白色沉淀帶 一種抗原或抗體混合物成分的定性與定量的分析方法。通常采用凝膠作為支持介質(zhì)，讓抗原與抗體混合物在介質(zhì)中互相擴(kuò)散，相互反應(yīng)形成沉淀弧線或沉淀弧帶 血凝法細(xì)菌和紅細(xì)胞等顆粒性抗原，當(dāng)與相應(yīng)抗體特異結(jié)合后，在適量電解質(zhì)存在的條件下，可逐漸聚集，出現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象稱為凝集反應(yīng)。反應(yīng)中的抗原稱為凝集原（agglutinogen），抗體稱為凝集素（agglutinin）根據(jù)凝集反應(yīng)的原理，以后又發(fā)展建立了，各種間接凝集試驗(yàn)、間接凝集抑制試驗(yàn)以及固相免疫吸附血凝試驗(yàn)等新方法 膠乳微粒免疫檢測技術(shù)是在膠乳凝集定性試驗(yàn)基礎(chǔ)上發(fā)展建立的-種非放射性均相免疫測定法，可以對各種微量的抗原物質(zhì)和小分子半抗

23、原(加藥物、團(tuán)體激素等)進(jìn)行精確的定量測定。根據(jù)特異性抗體致敏的膠乳微粒(一般為直徑約1m的聚苯乙烯膠乳)，與待測標(biāo)本中的相應(yīng)抗原相遇時(shí)發(fā)生凝集反應(yīng)，膠乳凝集程度與被測物的濃度呈函數(shù)關(guān)系，由此可測出標(biāo)本中待測物的含量。測定方法主要有粒子計(jì)數(shù)法和濁度法兩種 對流免疫電泳(counter immunoelectrophoresis, CIEP) 是將雙向免疫擴(kuò)散與電泳相結(jié)合的一種技術(shù)。在pH8.6的緩沖液中，蛋白質(zhì)抗原帶負(fù)電荷向正極泳動(dòng)；而抗體大部分屬于Ig，由于分子量大，暴露的極性基團(tuán)較少，在離子瓊脂中泳動(dòng)緩慢，同時(shí)受電滲作用的影響向負(fù)極泳動(dòng) (電滲是指在電場中液體對于一個(gè)固定固體的相對移動(dòng)。瓊

24、脂是一種酸性物質(zhì)，在堿性溶液中帶負(fù)電荷，而與它接觸的溶液帶正電荷，因此液體向負(fù)極泳動(dòng)，產(chǎn)生電滲) 在抗原抗體相遇的最適比例處形成乳白色沉淀線。由于電場的作用，限制了抗原、抗體的自由擴(kuò)散，而使其定向泳動(dòng)，因而增加了試驗(yàn)的靈敏度，并縮短反應(yīng)時(shí)間。此法操作簡便，僅需3060分鐘，靈敏度比雙向擴(kuò)散高1015倍；但缺點(diǎn)是特異性不如雙向瓊脂擴(kuò)散高 火箭免疫電泳(rocketimmunoelectrophoresis，RIEP)是將單向免疫擴(kuò)散和電泳相結(jié)合的一種定量檢測技術(shù)。電泳時(shí)，含于瓊脂凝膠中的抗體不發(fā)生移動(dòng)，而在電場的作用下促使樣品中的抗原向正極泳動(dòng)。當(dāng)抗原與抗體分子達(dá)到適當(dāng)比例時(shí)，形成一個(gè)形狀如火箭

25、的不溶性免疫復(fù)合物沉淀峰，峰的高度與撿樣中的抗原濃度呈正相關(guān)。因此，當(dāng)瓊脂中抗體濃度固定時(shí)，以不同稀釋度標(biāo)準(zhǔn)抗原泳動(dòng)后形成的沉淀峰為縱坐標(biāo)，抗原濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣品的沉淀峰長度即可計(jì)算出待測抗原的含量；反之，當(dāng)瓊脂中抗原濃度固定時(shí)，便可測定待測抗體的含量(即反向火箭免疫電泳) 競爭法雙抗體夾心法間接法 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)1971年瑞典學(xué)者Engvail和Perlmannn,荷蘭學(xué)者Van Weerman和Schuurs分別報(bào)道將免疫技術(shù)發(fā)展為檢測體液中微量物質(zhì)的固相免疫測定方法，稱為酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn))。最初發(fā)展的免疫酶測定方法。是使酶與抗體或抗原結(jié)合，用以檢查組織中相應(yīng)的抗原或抗

26、體的存在。后來發(fā)展為將抗原或抗體吸附于固相載體，在載體上進(jìn)行免疫酶染色，底物顯色后用肉眼或分光光度計(jì)判定結(jié)果。這種技術(shù)就是目前應(yīng)用最廣的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，俗稱ELISA (enzyme linked immunosorbant assay) 免疫印跡技術(shù)免疫印跡(immunoblotting)又稱蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)，是一種借助特異性抗體鑒定抗原的有效方法。該法是在凝膠電泳和固相免疫測定技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新的免疫生化技術(shù)。將含有目標(biāo)蛋白(抗原)的樣品首先用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS)或非變性電泳(Native)等分離后，通過轉(zhuǎn)移電泳原位轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜

27、或其它膜的表面，然后將膜表面的蛋白質(zhì)再用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行特異性檢測 免疫微粒技術(shù)是利用高分子材料合成一定粒度大小的固相微粒作為載體，包被上具有特異性親和力的各種免疫活性物質(zhì)(抗原或抗體)，使其致敏為免疫微粒，用于免疫學(xué)及其他生物學(xué)檢測與分離的一項(xiàng)技術(shù)。作為載體的微粒通常是以某種高分子有機(jī)單體為原料，經(jīng)過乳液聚合、懸浮聚合及輻照聚合等高分子聚合方法制備而成。由于制備材料及工藝不同，微粒的種類繁多，現(xiàn)已制成惰性微粒如聚苯乙烯膠乳微粒、活性微粒如羧化聚苯乙烯微粒、磁性微粒及標(biāo)記微粒(用同位素、熒光素或酶標(biāo)記)等四大類微粒，數(shù)量多達(dá)幾十種。將制備好的微粒與抗原(或抗體)經(jīng)物理吸附、化學(xué)偶聯(lián)及生物素親合

28、親橋聯(lián)法等致敏方法形成免疫微粒。廣泛應(yīng)用于各種可溶性大分子物質(zhì)的檢測、分離與純化、細(xì)胞標(biāo)記與識別等。近年來，微粒技術(shù)在核酸分子雜交、DNA與RNA的分離及PCR等研究領(lǐng)域亦顯示出廣闊的應(yīng)用前景 免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)是采用熒光素標(biāo)記的已知抗體(或抗原)作為探針，檢測待測組織、細(xì)胞標(biāo)本中的靶抗原(或抗體)，形成的抗原抗體復(fù)合物帶有熒光素，在熒光顯微鏡下，由于受高壓汞燈光源的紫外光照射，熒光素發(fā)出明亮的熒光，這樣就可以分辨出抗原(或抗體)的所在位置及其性質(zhì)，并可利用熒光定量技術(shù)計(jì)算抗原的含量，以達(dá)到對抗原物質(zhì)定位、定性和定量測定的目的 免疫組織化學(xué)技術(shù)又稱免疫細(xì)胞化學(xué)，是指帶顯色劑標(biāo)記的特異性抗體在

29、組織細(xì)胞原位通過抗原抗體反應(yīng)和組織化學(xué)的呈色反應(yīng)，對相應(yīng)抗原進(jìn)行定性、定位、定量測定的一項(xiàng)新技術(shù)。把免疫反應(yīng)的特異性、組織化學(xué)的可見性巧妙地結(jié)合起來，借助顯微鏡(包括熒光顯微鏡、電子顯微鏡)的顯像和放大作用，在細(xì)胞、亞細(xì)胞水平檢測各種抗原物質(zhì)(如蛋白質(zhì)、多肽、酶、激素、病原體以及受體等) 。全過程包括：抗原的提取與純化； 免疫動(dòng)物或細(xì)胞融合，制備特異性抗體以及抗體的純化； 將顯色劑與抗體結(jié)合形成標(biāo)記抗體； 標(biāo)本的制備； 免疫細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)以及呈色反應(yīng)； 觀察結(jié)果 免疫電鏡技術(shù)(Immune electron microscopy，IEM)是將抗原抗體反應(yīng)的特異性與電子顯微鏡的高分辨力相結(jié)合，在亞

30、細(xì)胞和超微結(jié)構(gòu)水平上對抗原物質(zhì)進(jìn)行定位分析的一種高度精確、靈敏的方法。特異性抗體用電子致密物質(zhì)，如鐵蛋白、膠體金等標(biāo)記后，使之與組織超薄切片中的抗原結(jié)合，在電鏡下觀察到標(biāo)記物所在位置，即為抗原抗體反應(yīng)的部位。首創(chuàng)此項(xiàng)技術(shù)的是Singer (1959)，他最先使用鐵蛋白標(biāo)記抗體的方法 流式細(xì)胞儀(Flow cytometer，F(xiàn)CM)能快速、精確地測量通過檢測區(qū)液流中的各種粒子。這些粒子可以是細(xì)胞、大分子、乳膠滴或其他粒子。流式細(xì)胞術(shù)是對單細(xì)胞定量分析和分選的新技術(shù)。通常是應(yīng)用一個(gè)激光和有關(guān)的光學(xué)檢測系統(tǒng)來收集這些信號以供分析。其檢測速度之快，統(tǒng)計(jì)學(xué)精度之高，是其他方法無法比擬的。它可以研究一個(gè)

31、細(xì)胞從新生到死亡，從細(xì)胞膜到腦漿和核內(nèi)物質(zhì)及染色體，還可以探討不同物質(zhì)之間的關(guān)系。它在免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)、病理學(xué)、放射生物學(xué)等學(xué)科中已形成了獨(dú)立的學(xué)科分支 使用程序 免疫磁性微粒分離與純化技術(shù) 磁性微粒(magnetic microspheres, MMS) 是80年代初，用高分子材料和金屬離子為原料，聚合而成的一種以金屬離子為核心，外層均勻地包裹高分子聚合體的固相微粒。在液相中，受外加磁場的吸引作用，MMS可快速沉降而自行分離，無需進(jìn)行離心沉淀。因此，將MMS應(yīng)用于免疫檢測，可使操作過程大為簡化。經(jīng)過特異性抗體包被制成免疫M(jìn)MS，與檢樣中的抗原結(jié)合形成免疫M(jìn)MS-靶分子(或靶細(xì)胞)復(fù)

32、合體，通過外加磁場的作用即可與其他成分分離開來。再以適當(dāng)方式使復(fù)合體解離，在磁場吸引下除去游離的免疫M(jìn)MS，即可獲得純化的靶分子或細(xì)胞 放射免疫技術(shù) 是利用放射性核素可探測的靈敏度、精確度和抗原抗體反應(yīng)特異性相結(jié)合的一種免疫技術(shù)。靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、樣品及試劑用量小是其優(yōu)點(diǎn)；但核素的放射性，對工作人員和環(huán)境易造成危害和污染，是其缺點(diǎn)放射免疫分析【RIA】是標(biāo)記抗原（Ag*）和非標(biāo)記抗原（Ag）對有限量的特異性抗體競爭性結(jié)合反應(yīng)Ag*AgAb Ag*AbAg* AgAb第二Ab法聚乙二醇沉淀法PR法活性炭吸附法分離免疫放射分析【IRMA】是非競爭性免疫結(jié)合反應(yīng)，用過量的放射性核素標(biāo)記抗

33、體（Ab*）與待測抗原反應(yīng)，待充分反應(yīng)后，除去游離的Ab*，AgAb*Ab*結(jié)合物的放射性強(qiáng)度與待測抗原呈正比關(guān)系A(chǔ)gAb*=AgAb*Ab*Ag雙點(diǎn)位IRMA單點(diǎn)位IRMAAg固相抗原Ag放射免疫分析【RIA】模式放射免疫分析廣義還包括放射受體分析及放射配體結(jié)合分析放射免疫分析常用的放射性核素有125I、130I、3H、14C等化學(xué)發(fā)光免疫分析化學(xué)發(fā)光免疫分析包含兩個(gè)部分, 即免疫反應(yīng)系統(tǒng)和化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)?；瘜W(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)是利用化學(xué)發(fā)光物質(zhì)經(jīng)催化劑的催化和氧化劑的氧化, 形成一個(gè)激發(fā)態(tài)的中間體, 當(dāng)這種激發(fā)態(tài)中間體回到穩(wěn)定的基態(tài)時(shí), 同時(shí)發(fā)射出光子(hM) , 利用發(fā)光信號測量儀器測量光量

34、子產(chǎn)額。免疫反應(yīng)系統(tǒng)是將發(fā)光物質(zhì)(在反應(yīng)劑激發(fā)下生成激發(fā)態(tài)中間體) 直接標(biāo)記在抗原(化學(xué)發(fā)光免疫分析) 或抗體(免疫化學(xué)發(fā)光分析) 上, 或酶作用于發(fā)光底物 進(jìn)樣系統(tǒng)反應(yīng)池PMT放大器記錄儀負(fù)高壓 檢測系統(tǒng)化學(xué)發(fā)光分析法儀器方框圖PMT:光電倍增管 電化學(xué)發(fā)光技術(shù)用先進(jìn)的電化學(xué)發(fā)光技術(shù)(ECL),是一種在電極表面由電化學(xué)引發(fā)的特異性化學(xué)發(fā)光反應(yīng),實(shí)際上包括了電化學(xué)和化學(xué)發(fā)光兩個(gè)過程,由電啟動(dòng)發(fā)光反應(yīng),因此可對反應(yīng)進(jìn)行精確控制,其采用Ru(bpy)32+作為標(biāo)記物,結(jié)合了標(biāo)記物的生物分子與配體發(fā)生特異的結(jié)合反應(yīng)后進(jìn)入流動(dòng)測量室,此時(shí),電發(fā)光過程被啟動(dòng)?；具^程如下:含三丙胺(TPA)的緩沖液進(jìn)入

35、測量室,同時(shí)電極加電,化學(xué)發(fā)光劑基因芯片技術(shù)基因芯片（Gene Chip）通常指DNA芯片，其基本原理是將指大量寡核苷酸分子固定于支持物上，然后與標(biāo)記的樣品進(jìn)行雜交，通過檢測雜交信號的強(qiáng)弱進(jìn)而判斷樣品中靶分子的數(shù)量 蛋白芯片技術(shù)蛋白芯片是將大量蛋白質(zhì)分子按預(yù)先設(shè)置的排列固定于一種載體表面行成微陣列，根據(jù)蛋白質(zhì)分子間特異性結(jié)合的原理，構(gòu)建微流體生物化學(xué)分析系統(tǒng)，以實(shí)現(xiàn)對生物分子的準(zhǔn)確、快速、大信息量的檢測605040302010 0腫瘤患者 % 7.0 7.0 4.2 7.0 7.4臨界值 (ng/ml)5033282722在實(shí)體腫瘤患者中,CEA特異性為95%時(shí)的敏感性參考值范圍：3ng/ml

36、在實(shí)體腫瘤患者中CEA表達(dá)狀況100 80 60 40 20(%)959127142293900 15 15100 1001000 100010,000 10,000100,000原發(fā)性肝細(xì)胞癌肝轉(zhuǎn)移癌AFP(ng/ml) 原發(fā)性肝細(xì)胞癌和其他惡性腫瘤肝轉(zhuǎn)移癌中AFP表達(dá)狀況參考值范圍：15ng/ml巨型快多結(jié)節(jié)型介入原發(fā)性肝細(xì)胞癌和肝轉(zhuǎn)移癌AFP和CEA的表達(dá)100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 095992507213(%)AFP15ng/mlCEA3ng/mlCEA10ng/ml原發(fā)性肝細(xì)胞癌肝轉(zhuǎn)移癌參考值范圍：3ng/ml參考值范圍：15ng/ml肺癌中腫瘤標(biāo)志物的應(yīng)用CYFRA21-1CEANSE治療前治療后復(fù)查組織類型不明確腺癌鱗狀細(xì)胞癌小細(xì)胞肺癌大細(xì)胞肺癌胃癌單項(xiàng)或聯(lián)合測定CEA、CA19-9及CA72-4的敏感性80604020 0敏感性（%）272966406672CEA（10.1）CA19-9（96）CA72-4（2.4）CA19-9（