紫杉醇耐藥的卵巢癌細(xì)胞中PKC

1、紫杉醇耐藥的卵巢癌細(xì)胞中PKC【關(guān)鍵詞】卵巢癌,紫杉醇耐藥,PExpressinsfPKandPgpinTaxlresistantvariananerelllineA2780/Taxl【Abstrat】AI:TdetettheexpressinsfPglyprtEinPgpandprteinkinase(PK)isfrinTaxlresistantvariananerelllineA2780/Taxl.ETHDS:IunhistheialSPethdanddublelabelediunflureseneereusedtdeterinetheexpressinsfPgpandPKinA2780/

2、TaxlandA2780.esternBltaseplyedfrassessPgpexpressinafterA2780/Taxlasulturedithphrblyristateaetate(PA)rstaursprine(SP).RESULTS:ThereasaexpressinfPgpandPKinA2780/Taxl,butPgpasntexpressedinA2780.AndtheexpressinlevelfPgpinA2780/TaxlasntaffetedbythepresenefPAandSP.NLUSIN:PgpandPKplayiprtantrlesintheresist

3、anefvariananerellA2780ttaxl.【Keyrds】varianneplass;Taxlresistane,Pglyprtein;prteinkinase【摘要】目的：討論P(yáng)K與Pgp在紫杉醇誘導(dǎo)的卵巢癌耐藥細(xì)胞系A(chǔ)2780/Taxl中的表達(dá).方法：免疫細(xì)胞化學(xué)SP法及免疫熒光雙標(biāo)檢測PK與Pgp在耐藥細(xì)胞A2780/Taxl及其親本細(xì)胞中的表達(dá)；esternBlt檢測并半定量分析PK沖動劑佛波脂(PA)和抑制劑十字孢堿(SP)作用后Pgp在兩種細(xì)胞上的表達(dá)程度.結(jié)果：免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果說明在A2780/Taxl中，Pgp與PK表達(dá)均呈陽性，而在親本細(xì)胞中，Pgp不表達(dá)，PK

4、呈陽性表達(dá).在A2780/Taxl中PK與Pgp有共表達(dá).SP及PA作用后，A2780/Taxl細(xì)胞Pgp表達(dá)無明顯差異.結(jié)論：卵巢癌對紫杉醇耐藥的產(chǎn)生與PK和Pgp有關(guān).【關(guān)鍵詞】卵巢癌，紫杉醇耐藥，P糖蛋白，蛋白激酶0引言紫杉醇在卵巢癌化療中占有重要地位，而耐藥是影響療效的重要因素.多藥耐藥基因(dr1)編碼的P糖蛋白(Pglyprtein,Pgp)的過表達(dá)是紫杉醇耐藥機(jī)制之一，而Pgp是由蛋白激酶(prteinkinase,PK)磷酸化而發(fā)揮功能的，在PK眾多同功酶中又以同功酶(PK)與多藥耐藥(ultidrugresistene,DR)關(guān)系最為親密.因此我們培養(yǎng)紫杉醇誘導(dǎo)的卵巢癌耐藥細(xì)

5、胞，研究其Pgp及PK的表達(dá)，為逆轉(zhuǎn)耐藥提供根據(jù).1材料和方法1.1材料卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)2780及其紫杉醇耐藥孕系(A2780/Taxl)由王澤華教授惠贈，培養(yǎng)于含有100L/L小牛血清的DE完全培養(yǎng)基，置于37，50L/L2，相對濕度90%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；試劑DE購于Gib公司，鼠抗人DR1Ab及兔抗人PKpAb購于Bster公司，SP免疫組化試劑盒，羅丹明標(biāo)記的羊抗兔IgG及FIT標(biāo)記的羊抗鼠IgG購于北京中山金橋生物技術(shù)公司，十字孢堿(SP)和佛波脂(PA)購于Siga公司.1.2方法1.2.1細(xì)胞爬片A2780和A2780/Taxl細(xì)胞按2106個/L濃度接種于裝有防脫處理的蓋玻片的6孔

6、板中培養(yǎng)24h，取出爬片，10l/LPBS沖洗2次，950L/L乙醇固定10in，中性樹膠黏于載玻片上.1.2.2免疫組化SP染色取上述細(xì)胞爬片，封閉后分別滴加鼠抗人DR1Ab(150)和兔抗人PKpAb(1100),DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水透明，中性樹膠封片.1.2.3免疫熒光雙染細(xì)胞爬片同上，滴加DR1Ab(150)和兔抗人PKpAb(1100)，4冰箱孵育過夜，滴加FIT標(biāo)記的羊抗鼠IgG和羅丹明標(biāo)記的羊抗兔IgG，PBS振洗，甘油封片.同時設(shè)PBS代替一抗的陰性對照.1.2.4esternBlt實(shí)驗(yàn)分組1組：A2780細(xì)胞陰性對照組，2組：A2780/Taxl細(xì)胞組；3組：A278

7、0/Taxl細(xì)胞+PA組：培養(yǎng)A2780/Taxl細(xì)胞，PA濃度200nl/L與細(xì)胞共同孵育40in后搜集細(xì)胞；4組A2780/Taxl細(xì)胞+SP組：培養(yǎng)A2780/Taxl細(xì)胞，SP濃度100nl/L與細(xì)胞共同孵育2h后搜集細(xì)胞.按文獻(xiàn)1提取總蛋白，Lry法定量，取20g蛋白樣品進(jìn)展SDSPAGE電泳，別離膠濃度7.5%，濃縮膠濃度5%，并電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用含10l/LBSA的TBST4冰箱封閉過夜，參加兔抗人PgppAb1500，室溫輕搖60in，參加羊抗兔APIgG,顯色液避光顯色2in，同時，以atin作內(nèi)參.esternBlt結(jié)果以Iage軟件做圖像弧度掃描，半定量采用與at

8、in的灰度比計(jì)算.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：以SPSS統(tǒng)計(jì)軟件對結(jié)果進(jìn)展統(tǒng)計(jì)分析，采用多樣本snkq檢驗(yàn).2結(jié)果2.1Pgp在A2780/Taxl細(xì)胞中的表達(dá)免疫細(xì)胞化學(xué)SP染色結(jié)果說明Pgp在A2780/Taxl細(xì)胞中表達(dá)為陽性圖1，在A2780細(xì)胞中不表達(dá)；PK在兩種細(xì)胞中均表達(dá)，在A2780/Taxl細(xì)胞中表達(dá)呈強(qiáng)陽性(圖2)；免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果示Pgp與PK在A2780/Taxl細(xì)胞中有共表達(dá)現(xiàn)象，在A2780細(xì)胞中僅有紅色熒光，即僅有PK的表達(dá)圖3.圖1圖3略2.2SP和PA作用后Pgp在A2780/Taxl細(xì)胞中的表達(dá)A2780/Taxl組在r為170103位置有明顯條帶.esternBlt半定量

9、結(jié)果顯示：A2780/Taxl組，A2780/Taxl+PA,A2780/Taxl+SP組Pgp與atin的灰度掃描值分別是28.93%，29.34%,28.57%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)，說明3,4組，與2組相比Pgp表達(dá)量并無明顯增加或減少圖4.圖4略3討論紫杉醇耐藥的機(jī)制很多，目前比擬確定的有Pgp表達(dá)的升高，微管亞基的改變，微管亞基的改變及凋亡途徑改變.DR1基因編碼的Pgp是一種跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，具有ATP酶活性，能將化療藥物從細(xì)胞內(nèi)泵出，降低細(xì)胞內(nèi)的有效藥物濃度而致多藥耐藥2.PK是一種普遍存在的磷脂依賴性酶，與細(xì)胞增殖，分化，凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)息息相關(guān),也參與了多DR形成過程的調(diào)

10、控3.Gttesan等4在早期的研究中證明Pgp是由PK磷酸化的，磷酸化后的Pgp活化而具有跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能，并且這種磷酸化過程可以被verapail抑制，而被PK激活劑增強(qiáng)5，PA就與PK具有高親和力,可以激活PK.而現(xiàn)已證實(shí)PK存在至少11種不同亞型，它們都是由不同基因編碼的功能相似的同功酶，廣泛分布在各器官組織和細(xì)胞，它們在構(gòu)造，生化性質(zhì)，組織分布，亞細(xì)胞定位和底物特異性方面都有差異6.韓英等7檢測了PK,在胃癌及其長春新堿耐藥株中的表達(dá)，結(jié)果說明胃癌細(xì)胞SG7901/VR的耐藥機(jī)制可能與PK有關(guān),而與PK無明顯相關(guān)性，相關(guān)實(shí)驗(yàn)還說明PK可能通過調(diào)節(jié)Pgp的功能與表達(dá)而參與胃癌細(xì)胞多藥耐藥的

11、形成.這說明在PK的眾多亞型中，尤以亞型與Pgp磷酸化關(guān)系最為親密8.本實(shí)驗(yàn)我們采用esternBlt檢測Pgp的表達(dá)，結(jié)果顯示A2780細(xì)胞表達(dá)呈陰性，而A2780/Taxl細(xì)胞中Pgp的表達(dá)呈陽性，說明卵巢癌細(xì)胞對紫杉醇的耐藥性產(chǎn)生與Pgp過表達(dá)有關(guān).該實(shí)驗(yàn)還通過免疫組化檢測到在A2780/Taxl細(xì)胞中PK表達(dá)強(qiáng)于其在A2780細(xì)胞中的表達(dá)，這個結(jié)果說明Pgp通過PK活化而發(fā)揮功能，與上述理論相符，因此在免疫熒光雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)中可以很明晰地看到Pgp與PK的共表達(dá).本試驗(yàn)我們還使用PK沖動劑PA和抑制劑SP分別作用于A2780/Taxl細(xì)胞，通過esternBlt檢測和半定量分析并未發(fā)現(xiàn)個組間

12、Pgp表達(dá)有差異，這說明PK活性的增強(qiáng)或減弱在短時間作用后并不能使Pgp表達(dá)量增加.然而，不同亞型同功酶在卵巢癌對紫杉醇耐藥中起什么樣的作用，對Pgp的表達(dá)和功能有什么影響，以及SP和PA長時間作用后能否影響Pgp的表達(dá)量，還有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn).這些研究將對卵巢癌患者的化療具有重要意義.【參考文獻(xiàn)】1SabiukJ,FritshEF,aniatisT分子克隆金冬雁，黎盂楓.譯2版北京：科學(xué)出版社1996:889-890.2AualiN,EddabraL,aadrJ,etal.IunsuppressrsandreversinfultidrugresistaneJ.ritRevnalHeaat,202

13、2,56(1):61-70.3KitazakiT,ka,NakauraY,etal.Gefitinib,anEGFRtyrsinekinaseinhibitr,diretlyinhibitsthefuntinfPglyprtEininultidrugresistantanerellsJ.Lunganer,2022,49(3):337-343.4Gttesan,LingV.Theleularbasisfultidrugresistaneinaner:TheearlyyearsfPglyprteinresearhJ.FEBSLett,2022,580(4):998-1009.5inkT,BatrakvaEV,Lis,etal.PlurniblkplyersalterappttisignaltransdutinfdxrubiinindrugresistantanerellsJ.JntrlRelease,2022,105(3):269-278.6VaraV,AshkrajY,DeyS,etal.Pglyprteininhibitrsandtheirsreening:AperspetivefrbiavailabilityenhaneentJ.PharalRe