電驅(qū)動(dòng)與陽離子交換膜在脫氧核糖核酸捕獲濃縮中的應(yīng)用

1、電驅(qū)動(dòng)與陽離子交換膜在脫氧核糖核酸捕獲濃縮中的應(yīng)用摘要】基于電驅(qū)動(dòng)特性與離子交換膜的選擇透過性，構(gòu)建了新型、無損傷的脫氧核糖核酸dna捕獲濃縮裝置。以-dna為模型化合物，探究其在自組裝裝置中的富集特性，優(yōu)化了實(shí)驗(yàn)條件，對(duì)濃縮液進(jìn)展凝膠電泳實(shí)驗(yàn)以考察dna是否變性，并進(jìn)展聚合酶鏈反響，以證明本方法回收的dna可供進(jìn)一步的生物分析。結(jié)果說明：本裝置在低電壓條件下可以無損傷地捕獲dna，濃縮液可用于進(jìn)一步的生物分析，dna的富集倍數(shù)達(dá)62倍，回收率達(dá)46%。本方法操作簡(jiǎn)便，防止使用大量有機(jī)試劑，微型化可與生物芯片聯(lián)用，在dna萃娶純化與濃縮領(lǐng)域有較大的應(yīng)用空間。【關(guān)鍵詞】脫氧核糖核酸捕獲；電驅(qū)動(dòng)；

2、離子交換膜；濃縮appliatinfeletrialdrivenandatiniexhangeebranetaptureandenrihdexyribnuleiaidhuanghua-bin，zhuangzhi-xia*，zhangen-hua，hujia，yangha-yng，angxia-ru(llegefheistryandheialengineering，xiaenuniversity，xiaen361005)(firsteangraphyinstitutefstateeaniadinistratin，peplesrepublifhina，qingda266061)(xiaenhuax

3、iavatinalllege，xiaen361024)abstratbasedntheseletivepereabilityfatiniexhangeebraneandtheharateristifeletrialdriven，aneandnn-daageapparatusthatanbeusedtseparatepundsithdifferenteletriprpertyasbuilttaptureandenrihdna.-dna，asadelpund，asusedtstudytheharateristifapturingandenrihingdnainthisdevie.fatrsthat

4、ightaffettheeffiienysuhasvltageandflspeedereptiizedandgeleletrphresisasdnetstudyifdnaasdenaturatin，prasdnetprvethenentratinanbeusedtfurtherbianalysis.resultseregt：theapparatusuldusedtaptureandenrihdnasathelesslyunderthenditinfl-vltage，thenentrateultipleas62，andthereveryeffiienyasaessiblet47%，nentrat

5、inanbeusedfrthenextbianalysis.autati，easythandleandlittlerganireagentusingadeitbeadvantageus，ituldbeiniaturedtbineiththerbihips.thisethdhadalargeappliatinspaeinfieldfdnaextratin，purifiatinandnentratin.keyrdsdexyribnuleiaidapture；eletrialdriven；in-exhangeebrane；nentratin1引言核酸的提取和純化在生物樣品的基因分析實(shí)驗(yàn)中至關(guān)重要。傳

6、統(tǒng)的提取方法有酚-氯仿法，該方法設(shè)備要求較低，但有機(jī)溶劑毒性強(qiáng)，耗時(shí)且難以自動(dòng)化。其它的諸如超聲波法1，鹽熱法2，介電電泳法3等方法也由于各自的缺陷使其應(yīng)用受到限制。近年來，利用脫氧核糖核酸dna與二氧化硅微球的氫鍵作用吸附提取dna的技術(shù)成為研究熱點(diǎn)4，該方法克制了傳統(tǒng)方法溶劑毒性、耗時(shí)、難以自動(dòng)化的缺點(diǎn)，但微球的制備、灌注與芯片封裝等步驟的工藝技術(shù)要求較高47。目前，膜別離技術(shù)越來越受重視，應(yīng)用超濾和納濾膜的挑選特性對(duì)不同分子量的生物樣品進(jìn)展別離的方法有很多報(bào)道8，而離子交換膜的應(yīng)用主要在脫鹽工業(yè)上，利用其截留特性進(jìn)展生物樣品尤其是生物大分子別離的應(yīng)用報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合電場(chǎng)的定向驅(qū)動(dòng)特性

7、和陽離子交換膜對(duì)負(fù)電性物質(zhì)的截留，構(gòu)建了一個(gè)無損傷的dna捕獲濃縮裝置，考察了其富集特性，并優(yōu)化了實(shí)驗(yàn)條件。此方法在生物樣品的別離純化方面有較大的應(yīng)用空間。2實(shí)驗(yàn)局部2.1儀器和試劑hl-2恒流泵上海滬西分析儀器廠；穩(wěn)壓直流電源(上海力友電氣公司)；perpabasi凝膠電泳儀bi-rad公司；nd-1000全波長(zhǎng)紫外/可見光掃描分光光度計(jì)(ther公司)；凝膠成像系統(tǒng)kadak公司；pr儀bi-rad公司；鉑金電極，陽離子交換膜nafin1135，dupnt。-dna0.3gdna/l，bi；taqdna聚合酶prega；瓊脂糖lp0028a，英國xid公司；脫氧核糖核酸dntp，prega

8、公司；溴化乙錠sangn生物公司，其它試劑均為分析純。超純水由illi-q制得r=18.2。陰極緩沖液：te緩沖液(10l/ltris-hl，1l/ledta-2na，ph8.0)；陽極緩沖液(1l/lkh2p4+3.5l/lk2hp4+1l/lna2s4，ph9.0)。-dna擴(kuò)增片段包括101bp，正引物5-taagagaatagagaaga-3，反引物5-aagtttgaaaggtatt-3prega公司。2.2裝置與原理本簡(jiǎn)易裝置綜合利用流路死體積，電驅(qū)動(dòng)特點(diǎn)和離子交換膜的截留特性。如圖1，裝置主要部件由玻璃拉制而成，膜借助卡套固定，恒流泵所用管路和接口為硅膠管，其它管路為聚四氟乙烯管

9、，兩電極之間的間隔 約5。dna緩沖體系借助恒流泵從1處流入，流經(jīng)捕獲界面支管口時(shí)，負(fù)電性的dna分子在電場(chǎng)中向陽極方向遷移而進(jìn)入豎直支管，到達(dá)陽離子交換膜時(shí)由于膜的截留特性，dna在膜附近堆積并防止了陽極的氧化作用。圖1dna捕獲濃縮裝置示意圖略fig.1generalskethfdevieusedtapturedna實(shí)驗(yàn)時(shí)，翻開止水夾，向其中注入緩沖液，使膜上區(qū)域充滿陰極緩沖液至支管口，確保支管中無氣泡，關(guān)閉止水夾。注入陽極緩沖液并充滿陽極區(qū)域，液面高于膜以確保膜附近無氣泡。翻開恒流泵，待液體流至陰極，開啟穩(wěn)壓電源。待溶液全部流過支管口，關(guān)閉穩(wěn)壓電源，翻開止水夾，搜集濃縮液150l。實(shí)驗(yàn)完

10、畢用陰極緩沖液清洗管路。由于通電時(shí)間的延長(zhǎng)，陽極緩沖溶液中陽離子濃度降低，需及時(shí)更新。實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)ph8.0時(shí)更換。膜使用前用陽極緩沖液浸泡。2.3實(shí)驗(yàn)方法2.3.1濃縮液的獲取與測(cè)定以te為空白，用nandrp測(cè)定-dna在260n處的吸收值，并按照=50a260求算出dna濃度為297g/l，取20l-dna用陰極緩沖液te稀釋至20l，濃度約為0.3g/l。按照裝置與原理中的操作進(jìn)展dna的捕獲濃縮，泵流速為0.2l/in，工作電壓200v。搜集150l濃縮液，用nandrp測(cè)定a260，求算dna濃度。2.3.2濃縮液的凝膠電泳與聚合酶鏈反響pr配制30l0.8%瓊脂糖凝膠，溴化乙錠eb

11、為染色劑，以19.0g/l標(biāo)準(zhǔn)-dna(未經(jīng)濃縮裝置)為參照物，進(jìn)展凝膠電泳1tae電泳緩沖液，上樣量10l，電壓60v，時(shí)間50in，凝膠成像系統(tǒng)拍攝電泳圖譜。為證明濃縮液可用于進(jìn)一步的分析，對(duì)濃縮液進(jìn)展pr實(shí)驗(yàn)。模板分別為空白te、19.0g/l標(biāo)準(zhǔn)-dna和250v條件下搜集的濃縮液進(jìn)展pr實(shí)驗(yàn)。熱循環(huán)參數(shù)為：94預(yù)變性3in；然后以94變性30s，56退火30s，72延伸30s，擴(kuò)增20個(gè)循環(huán)；最后72延伸5in使反響完全。反響完成后，取反響產(chǎn)物10l在3.0%瓊脂糖凝膠上進(jìn)展電泳1tae電泳緩沖液，電壓70v，40in，凝膠成像系統(tǒng)拍攝電泳圖譜。25lpr反響體系中含有正反引物各0.

12、01l，dntp5l，2.5l緩沖液(10)，0.25ltaqdna聚合酶及3.0l模板。3結(jié)果與討論3.1dna溶液濃縮結(jié)果濃縮前的稀釋液濃度為0.3g/l，低于nandrp的檢出限2g/l，而濃縮液在a260的吸收值為0.372，換算濃度為18.6g/l，a260/a280為1.70。可見，本裝置成功地實(shí)現(xiàn)dna分子的濃縮。富集倍數(shù)到達(dá)62倍，回收率為47%。圖2為nandrp測(cè)定的稀釋液與濃縮液的吸收光譜。購置的dna的a260/a280為1.79，濃縮液的比值略微下降，推測(cè)其原因?yàn)闈饪s過程中緩沖體系中的陰離子向陽極區(qū)域遷移導(dǎo)致濃縮液的離子濃度較高，從而影響dna的檢測(cè)。圖2nandrp

13、測(cè)定的稀釋液與濃縮液的吸收光譜略fig.2absrptinspetrafdiluentandnentratebynandrp3.2實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化流速越大，dna分子受到流體的力越大，在捕獲界面停留的時(shí)間越短，進(jìn)入支管的幾率就越校因此，可以通過降低恒流泵的流速進(jìn)步富集效率?？疾炝肆魉僭?.1，0.2，0.4和0.8l/in下dna的回收率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：流速越大，dna回收率越?？紤]到實(shí)驗(yàn)時(shí)間，流速選擇為0.2l/in。工作電壓越大，dna在電場(chǎng)中向陽極遷移的幾率越大?？疾炝嗽?00，250和150v電壓下的回收率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：電壓越高，濃縮液的a260越大回收率越高。但凝膠電泳的實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，當(dāng)工作電

14、壓高于400v后，不能得到電泳條帶，推測(cè)其原因?yàn)殡妷哼^高導(dǎo)致dna的變性。因此，為防止?jié)饪s過程中dna變性，實(shí)驗(yàn)選擇250v為工作電壓。3.3無損傷檢測(cè)為研究實(shí)驗(yàn)過程中的dna是否發(fā)生斷裂，進(jìn)展了濃縮液的凝膠電泳實(shí)驗(yàn)。如圖3所示，1為te空白，2為與濃縮液相近濃度的標(biāo)準(zhǔn)dna的電泳條帶。3，4，5分別為工作電壓為400，250，150v時(shí)的濃縮液條帶，由圖中條帶2與4亮度相近且無雜帶可判斷濃縮過程中的dna無斷裂發(fā)生；條帶4比5亮是因?yàn)?的dna濃度較高，而3無條帶，主要原因是在較高電壓條件下，濃縮液中的陰離子濃度增大，而高離子濃度溶液與高電壓條件下產(chǎn)生的熱效應(yīng)都易使得dna變性，詳細(xì)的變性機(jī)

15、理還有待進(jìn)一步的研究。本實(shí)驗(yàn)通過調(diào)節(jié)工作電壓，實(shí)現(xiàn)了無損傷捕獲濃縮dna分子。為進(jìn)一步證明濃縮液可用于生物分析，考察了濃縮液的pr反響，產(chǎn)物的凝膠電泳如圖4。結(jié)果說明，濃縮液可成功地?cái)U(kuò)增出目的片段101bp，可見本實(shí)驗(yàn)的濃縮液可用于進(jìn)一步的生物分析。圖3濃縮液的凝膠電泳圖譜略fig.30.8%agarsegeleletrphresisfdna1.blank；2.-dna(19.0g/l)；3.nentrate(400v)；4.nentrate(250v)；5.nentrate(150v).圖4pr產(chǎn)物的凝膠電泳圖譜略fig.43%agarsegeleletrphresisfprprdutinf

16、dna1.50bparker；2.blank(tebuffer)；3.-dna(19.0g/l)；4.nentrate(250v)4結(jié)論本實(shí)驗(yàn)成功地實(shí)現(xiàn)了dna無損傷的捕獲濃縮，dna濃縮倍數(shù)62倍，富集效率50%，回收率約46%，濃縮液可用于進(jìn)一步的生物分析。本方法較常規(guī)的方法操作簡(jiǎn)便自動(dòng)，無須使用大量的有機(jī)試劑，進(jìn)一步微型化可與生物芯片聯(lián)用或集成于生物芯片，有望用于實(shí)際樣品中的dna的提取或純化。本裝置也可用于一般無機(jī)離子或小分子極性有機(jī)物的預(yù)富集，降低痕量檢測(cè)時(shí)對(duì)儀器檢出限的要求【參考文獻(xiàn)】1akleyt，hakesjj，sbanskia，usins，spenglerj.ultrasni

17、s，2000，38)：6386412belgraderp，benett，hadleyd，rihardsj，strattnp，ariellarjr，ilanvihf.siene，1999，284)：4494503hengj，sheldnel，ul，hellerj，nnelljp.anal.he.，1998，70)：232123264hrsank，bienvenuej，blasierkr，landersjp.j.frensi.si.，2022，52)：7847995tianh，hherafr，landersjp.anal.bihe.，2000，283(2)：1751916breadre，lfeka，aribalig