重組DNA1技術(shù)1課件

1、重組DNA技術(shù)(1)DNA Recombination technology (1)楊 敏 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院臨床生物化學(xué)教研室臨床分子診斷學(xué)-技術(shù)篇2課前復(fù)習(xí)1.核酸分離純化的原則是什么？2. 核酸分離純化的基本步驟？核酸的分離與純化核酸分離、純化原則 保持核酸分子一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性 保證純度分離提取核酸的主要步驟 核酸的釋放：細(xì)胞的破碎 核蛋白的解聚、變性，蛋白質(zhì)的去除 核酸的濃縮、沉淀和洗滌 核酸的濃度測(cè)定 核酸的保存DNA知識(shí)回顧DNA and RNA are large macromolecules with several levels of complexityNucleotides fo

2、rm the repeating unitsPhosphodiester bonds link nucleotides to form a strand Two strands interact to form a double helixThe double helix interacts withproteins resulting in 3-D structuresin the form of chromatin NUCLEIC ACID STRUCTURE3D structureBase + sugar nucleoside ExampleAdenine + ribose = Aden

3、osineAdenine + deoxyribose = DeoxyadenosineBase + sugar + phosphate(s) nucleotideExample Adenosine monophosphate (AMP)Adenosine diphosphate (ADP)Adenosine triphosphate (ATP)Combining all the partsThe structure of nucleotides found in (a) DNA and (b) RNAA, G, C or TA, G, C or UdNMPNMPNucleotide Polym

4、erization Reaction: Phosphodiester Bond FormationCopyright The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or displayWrite the strand complementary to: 5 ACTAGCCTAAGTCG 3Answer3 TGATCGGATTCAGC 55 CGACTTAGGCTAGT 33 GCTGAATCCGATCA 5Rotation要求掌握重組DNA技術(shù)、限制性內(nèi)切酶、載體的概念，分子克隆的基本步驟。熟悉常用的D

5、NA連接酶、DNA聚合酶等工具酶，常用載體的特點(diǎn)。了解重組 DNA技術(shù)的應(yīng)用。DigestionFragment recoveryLigationTransformationSelectionAmplificationPlasmid preparation Protein expression 重組DNA技術(shù)：Recombinant DNA technology是指用酶學(xué)的方法將目的DNA在體外重組于自我復(fù)制的載體DNA分子上，然后將重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增和繁殖，以獲得大量的目的DNA片段，或以此為基礎(chǔ)，通過基因的誘導(dǎo)表達(dá)，得到大量相應(yīng)蛋白質(zhì)產(chǎn)物的過程。常稱作分子克隆（molecul

6、ar cloning）技術(shù)或基因工程(gene engineering)技術(shù)。DNA克隆克隆（clone）： 細(xì)胞通過無性繁殖后產(chǎn)生的與親代細(xì)胞完全相同的子代群體，來自同一始祖的相同副本或拷貝的集合?？寺』╟loning）： 獲取同一拷貝的過程，即無性繁殖。分子克?。―NA克?。┘?xì)胞克隆個(gè)體克?。▌?dòng)物或植物）工具酶限制性核酸內(nèi)切酶DNA連接酶DNA聚合酶I逆轉(zhuǎn)錄酶Taq DNA聚合酶堿性磷酸酶T4多核苷酸激酶末端轉(zhuǎn)移酶S1核酸酶限制性核酸內(nèi)切酶（restriction endonuclease）所有工具酶中最為重要，是一類識(shí)別雙鏈DNA分子中某特定的核苷酸序列，并在識(shí)別序列內(nèi)或附近切割DNA

7、雙鏈結(jié)構(gòu)的核酸內(nèi)切酶，是細(xì)菌內(nèi)存在的保護(hù)性酶。與對(duì)應(yīng)的甲基化酶共同組成了細(xì)菌內(nèi)的限制修飾系統(tǒng)。Restriction Endonucleases: Type IIEnzymeIsolated fromRecognition sequenceEco RIE. coli, strain R, 1st enzymeGAATTCEco RVE. coli, strain R, 5th enzymeGATATCHind IIIH. Influenzae（流感嗜血桿菌）, strain d, 3rd enzymeAAGCTTThere are hundreds of Hydrolyze 3,5-phosp

8、hodiester bond Recognition site, cutting style & end type of EcoRICut DNA in the interior雙軸對(duì)稱回文結(jié)構(gòu)palindrome 5533GAATTCGAATTCNNNN5-overhang5-overhangEnzymeSequenceCut FrequencySau3AIEcoRINotI5-GATC-35-GAATTC-35-GCGGCCGC-30.25kb4kb65kbFrequency=(1/4)n , where n=the number of bps in the recognition seq

9、uenceP76改錯(cuò)BamH1 GGATCCCCTAGGHaeIIIGGCCCCGGCohesive Ends(5 Overhang)Cohesive Ends(3 Overhang)KpnI GGTACCCCATGGBlunt Ends(No Overhang)Restriction EnzymesGATCCTAGDpnI(Requires methylation)Methylation-sensitive EnzymesGGCCCCGGHaeIII(Inhibited by methylation)CCCGGGGGGCCCXmaI(5 Overhang)CCCGGGGGGCCCSmaI(B

10、lunt Ends)IsoschizomersEnzymes GeneratingCompatible Cohesive EndsGGATCCCCTAGGBamHI(5 Overhang)AGATCTTCTAGABglII(5 Overhang)CTCGTGGAGCACBssSI(5 Overhang)NNCAGTGNNNNGTCACNNTspRI(3 Overhang)Enzymes RecognizingNon palindromic SequencesRestriction Enzymes部分常用限制性內(nèi)切酶特異識(shí)別:4或6個(gè)堿基回文結(jié)構(gòu)特異切割5突出黏末端5-overhangcohes

11、ive end 3突出黏末端3-overhangcohesive end 平末端blunt end 同序同切酶 同序異切酶 同 裂 酶同 尾 酶Compatible end可配伍的末端制備可控特異片段5-CCGCGGTGGCGGCCGCTCTAGAACTAGTGGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTCGATATCAAGCTTATCGATACCGTCGACCTCGAGGGGGG -3只寫出了一條鏈的序列信息。找一找5-CCGCGGTGGCGGCCGCTCTAGAACTAGTGGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTCGATATCAAGCTTATCGATACCGTCGACCTCGAGGG

12、GGG -3只寫出了一條鏈的序列信息。選取的是載體上的多克隆位點(diǎn)。正確答案？Restriction enzyme analyse by NEB Cutter舉例說明限制性內(nèi)切酶反應(yīng)的設(shè)置DNA 1 g10 x NEB buffer 3 10 L100 x BSA 1 LBamHI 1 unitH2O 補(bǔ)充體積至100 L最適反應(yīng)溫度下保溫適當(dāng)時(shí)間。100ul 反應(yīng)限制性內(nèi)切酶反應(yīng)的影響因素DNA 的純度和結(jié)構(gòu)反應(yīng)緩沖液的pH及離子濃度酶解溫度和時(shí)間限制酶限制性內(nèi)切酶在DNA重組技術(shù)中的應(yīng)用改造和組建質(zhì)粒組建基因組DNA物理圖譜基因組DNA同源性研究DNA重組克隆及亞克隆DNA雜交與序列分析分析

13、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性Restriction fragment length polymorphism, RFLPRestriction Enzyme MappingBamH1XhoIXhoI1.1 kb1.7 kb1.2 kb2.8 kb4.3 kb3.7 kb2.3 kb1.9 kb1.4 kb1.3 kb0.7 kbBamH1XhoIBamH1XhoI4.0 kb2.8 kb1.2 kb1.7 kb1.2 kb1.1 kb還有其它可能性 ?DNA ligaseDNA連接酶是一種封閉DNA鏈上切口的酶，它借助ATP 或NAD（輔酶I，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 ）水解提供的能量催化一段DNA鏈上臨

14、近的5磷酸末端和3羥基末端生成磷酸二酯鍵，把兩個(gè)DNA片段連接在一起，從而封閉雙鏈DNA上的切口。35磷酸二酯鍵nickT4 DNA ligase: rATP, 互補(bǔ)的粘性末端，平末端E.Coli DNA ligase: NAD, 互補(bǔ)的粘性末端，平末端兩類常用DNA連接酶及其輔助因子焦磷酸部分AMP部分AMP部分NMN部分rATPNAD+連接機(jī)制：3步驟NADNMNDNA-腺苷酸 激活賴氨酸的-氨基切口(nick)與缺口(gap)的區(qū)別G ATTCCTTA GG AATTCCTTAT Gnickgap可連接不可連接磷酸二酯鍵斷裂 核苷酸缺失 效率高效率低 粘性末端連接Sticky ends

15、must match (be complementary) for optimal re-ligation.Sticky ends can be converted to blunt ends with nuclease or polymerase. Blunt ends can be converted to sticky ends by ligating to synthetic adaptors.Blunt ends can be re-ligated with less efficiency than sticky ends.Ligation of Restriction Enzyme

16、 Digested DNAEcoRIEcoRIEcoRIBamHIBamHIBamHIEcoRIEcoRIEcoRIBamHIBamHIEcoRIEcoRIBamHIBamHI 如何篩選我們想要的質(zhì)粒？如何通過克隆策略設(shè)計(jì)增加獲得想 要質(zhì)粒的機(jī)會(huì)？Question?影響連接酶效率的因素rATP/NADMg2+DTTpH 7.27.4DNA Polymerase催化以DNA為模板合成DNA的反應(yīng)，主要用于DNA的體外合成。共同特點(diǎn)：催化在帶引物的雙鏈DNA分子的3羥基端加上脫氧核苷酸，合成方向?qū)?yīng)于被合成鏈而言從5端到3端延伸，形成新的DNA鏈。反應(yīng)需要4種脫氧核糖核苷酸和Mg2+53 聚合酶活

17、性 a53外切酶活性 b35外切酶活性 c大腸埃希菌DNA聚合酶I: abc； 缺口平移法標(biāo)記，3黏性末端標(biāo)記、平端化，cDNA合成大腸埃希菌DNA聚合酶I Klenow 大片段: ac；補(bǔ)齊， 3末端標(biāo)記耐熱Taq DNA 聚合酶： ab, 微弱的非模板依賴的末端轉(zhuǎn)移酶活性，耐高溫；PCR, TA-cloning逆轉(zhuǎn)錄酶：ab, 以mRNA為模板合成cDNA;降解RNA:DNA中的RNA；用于構(gòu)建cDNA文庫T4 DNA 聚合酶：ac；補(bǔ)齊末端，標(biāo)記T7 DNA 聚合酶：ac；序列分析；測(cè)序酶GAATTCCTTAAGCTGCAGGACGTCEcoRIPstI AATTC GCTGCAGEco

18、RIPstIDigestionEnd Blutting AATTC TTAAGCGT4-DNA polymerase+dNTPIdentifying Natural Product Biosynthetic Genes from a Soil Metagenome by Using T7 Phage Selection Zhang K, He J, Yang M, Yen M, Yin J. Chembiochem. 2009, 10(16):2599-2606.反轉(zhuǎn)錄酶 reverse transcriptase堿性磷酸酶Alkaline phosphatase催化去除DNA、RNA、dNTP或NTP上的5端磷酸基團(tuán)，方便5端標(biāo)記同位素，防止連接反應(yīng)時(shí)載體的自身連接。細(xì)菌堿性磷酸酶Bacterial