重組DNA1技術1課件

1、重組DNA技術(1)DNA Recombination technology (1)楊 敏 檢驗醫(yī)學院臨床生物化學教研室臨床分子診斷學-技術篇2課前復習1.核酸分離純化的原則是什么？2. 核酸分離純化的基本步驟？核酸的分離與純化核酸分離、純化原則 保持核酸分子一級結構的完整性 保證純度分離提取核酸的主要步驟 核酸的釋放：細胞的破碎 核蛋白的解聚、變性，蛋白質的去除 核酸的濃縮、沉淀和洗滌 核酸的濃度測定 核酸的保存DNA知識回顧DNA and RNA are large macromolecules with several levels of complexityNucleotides fo

2、rm the repeating unitsPhosphodiester bonds link nucleotides to form a strand Two strands interact to form a double helixThe double helix interacts withproteins resulting in 3-D structuresin the form of chromatin NUCLEIC ACID STRUCTURE3D structureBase + sugar nucleoside ExampleAdenine + ribose = Aden

3、osineAdenine + deoxyribose = DeoxyadenosineBase + sugar + phosphate(s) nucleotideExample Adenosine monophosphate (AMP)Adenosine diphosphate (ADP)Adenosine triphosphate (ATP)Combining all the partsThe structure of nucleotides found in (a) DNA and (b) RNAA, G, C or TA, G, C or UdNMPNMPNucleotide Polym

4、erization Reaction: Phosphodiester Bond FormationCopyright The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or displayWrite the strand complementary to: 5 ACTAGCCTAAGTCG 3Answer3 TGATCGGATTCAGC 55 CGACTTAGGCTAGT 33 GCTGAATCCGATCA 5Rotation要求掌握重組DNA技術、限制性內切酶、載體的概念，分子克隆的基本步驟。熟悉常用的D

5、NA連接酶、DNA聚合酶等工具酶，常用載體的特點。了解重組 DNA技術的應用。DigestionFragment recoveryLigationTransformationSelectionAmplificationPlasmid preparation Protein expression 重組DNA技術：Recombinant DNA technology是指用酶學的方法將目的DNA在體外重組于自我復制的載體DNA分子上，然后將重組DNA導入宿主細胞中進行擴增和繁殖，以獲得大量的目的DNA片段，或以此為基礎，通過基因的誘導表達，得到大量相應蛋白質產物的過程。常稱作分子克?。╩olecul

6、ar cloning）技術或基因工程(gene engineering)技術。DNA克隆克?。╟lone）： 細胞通過無性繁殖后產生的與親代細胞完全相同的子代群體，來自同一始祖的相同副本或拷貝的集合?？寺』╟loning）： 獲取同一拷貝的過程，即無性繁殖。分子克?。―NA克?。┘毎寺€體克?。▌游锘蛑参铮┕ぞ呙赶拗菩院怂醿惹忻窪NA連接酶DNA聚合酶I逆轉錄酶Taq DNA聚合酶堿性磷酸酶T4多核苷酸激酶末端轉移酶S1核酸酶限制性核酸內切酶（restriction endonuclease）所有工具酶中最為重要，是一類識別雙鏈DNA分子中某特定的核苷酸序列，并在識別序列內或附近切割DNA

7、雙鏈結構的核酸內切酶，是細菌內存在的保護性酶。與對應的甲基化酶共同組成了細菌內的限制修飾系統(tǒng)。Restriction Endonucleases: Type IIEnzymeIsolated fromRecognition sequenceEco RIE. coli, strain R, 1st enzymeGAATTCEco RVE. coli, strain R, 5th enzymeGATATCHind IIIH. Influenzae（流感嗜血桿菌）, strain d, 3rd enzymeAAGCTTThere are hundreds of Hydrolyze 3,5-phosp

8、hodiester bond Recognition site, cutting style & end type of EcoRICut DNA in the interior雙軸對稱回文結構palindrome 5533GAATTCGAATTCNNNN5-overhang5-overhangEnzymeSequenceCut FrequencySau3AIEcoRINotI5-GATC-35-GAATTC-35-GCGGCCGC-30.25kb4kb65kbFrequency=(1/4)n , where n=the number of bps in the recognition seq

9、uenceP76改錯BamH1 GGATCCCCTAGGHaeIIIGGCCCCGGCohesive Ends(5 Overhang)Cohesive Ends(3 Overhang)KpnI GGTACCCCATGGBlunt Ends(No Overhang)Restriction EnzymesGATCCTAGDpnI(Requires methylation)Methylation-sensitive EnzymesGGCCCCGGHaeIII(Inhibited by methylation)CCCGGGGGGCCCXmaI(5 Overhang)CCCGGGGGGCCCSmaI(B

10、lunt Ends)IsoschizomersEnzymes GeneratingCompatible Cohesive EndsGGATCCCCTAGGBamHI(5 Overhang)AGATCTTCTAGABglII(5 Overhang)CTCGTGGAGCACBssSI(5 Overhang)NNCAGTGNNNNGTCACNNTspRI(3 Overhang)Enzymes RecognizingNon palindromic SequencesRestriction Enzymes部分常用限制性內切酶特異識別:4或6個堿基回文結構特異切割5突出黏末端5-overhangcohes

11、ive end 3突出黏末端3-overhangcohesive end 平末端blunt end 同序同切酶 同序異切酶 同 裂 酶同 尾 酶Compatible end可配伍的末端制備可控特異片段5-CCGCGGTGGCGGCCGCTCTAGAACTAGTGGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTCGATATCAAGCTTATCGATACCGTCGACCTCGAGGGGGG -3只寫出了一條鏈的序列信息。找一找5-CCGCGGTGGCGGCCGCTCTAGAACTAGTGGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTCGATATCAAGCTTATCGATACCGTCGACCTCGAGGG

12、GGG -3只寫出了一條鏈的序列信息。選取的是載體上的多克隆位點。正確答案？Restriction enzyme analyse by NEB Cutter舉例說明限制性內切酶反應的設置DNA 1 g10 x NEB buffer 3 10 L100 x BSA 1 LBamHI 1 unitH2O 補充體積至100 L最適反應溫度下保溫適當時間。100ul 反應限制性內切酶反應的影響因素DNA 的純度和結構反應緩沖液的pH及離子濃度酶解溫度和時間限制酶限制性內切酶在DNA重組技術中的應用改造和組建質粒組建基因組DNA物理圖譜基因組DNA同源性研究DNA重組克隆及亞克隆DNA雜交與序列分析分析

13、限制性片段長度多態(tài)性Restriction fragment length polymorphism, RFLPRestriction Enzyme MappingBamH1XhoIXhoI1.1 kb1.7 kb1.2 kb2.8 kb4.3 kb3.7 kb2.3 kb1.9 kb1.4 kb1.3 kb0.7 kbBamH1XhoIBamH1XhoI4.0 kb2.8 kb1.2 kb1.7 kb1.2 kb1.1 kb還有其它可能性 ?DNA ligaseDNA連接酶是一種封閉DNA鏈上切口的酶，它借助ATP 或NAD（輔酶I，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 ）水解提供的能量催化一段DNA鏈上臨

14、近的5磷酸末端和3羥基末端生成磷酸二酯鍵，把兩個DNA片段連接在一起，從而封閉雙鏈DNA上的切口。35磷酸二酯鍵nickT4 DNA ligase: rATP, 互補的粘性末端，平末端E.Coli DNA ligase: NAD, 互補的粘性末端，平末端兩類常用DNA連接酶及其輔助因子焦磷酸部分AMP部分AMP部分NMN部分rATPNAD+連接機制：3步驟NADNMNDNA-腺苷酸 激活賴氨酸的-氨基切口(nick)與缺口(gap)的區(qū)別G ATTCCTTA GG AATTCCTTAT Gnickgap可連接不可連接磷酸二酯鍵斷裂 核苷酸缺失 效率高效率低 粘性末端連接Sticky ends

15、must match (be complementary) for optimal re-ligation.Sticky ends can be converted to blunt ends with nuclease or polymerase. Blunt ends can be converted to sticky ends by ligating to synthetic adaptors.Blunt ends can be re-ligated with less efficiency than sticky ends.Ligation of Restriction Enzyme

16、 Digested DNAEcoRIEcoRIEcoRIBamHIBamHIBamHIEcoRIEcoRIEcoRIBamHIBamHIEcoRIEcoRIBamHIBamHI 如何篩選我們想要的質粒？如何通過克隆策略設計增加獲得想 要質粒的機會？Question?影響連接酶效率的因素rATP/NADMg2+DTTpH 7.27.4DNA Polymerase催化以DNA為模板合成DNA的反應，主要用于DNA的體外合成。共同特點：催化在帶引物的雙鏈DNA分子的3羥基端加上脫氧核苷酸，合成方向對應于被合成鏈而言從5端到3端延伸，形成新的DNA鏈。反應需要4種脫氧核糖核苷酸和Mg2+53 聚合酶活

17、性 a53外切酶活性 b35外切酶活性 c大腸埃希菌DNA聚合酶I: abc； 缺口平移法標記，3黏性末端標記、平端化，cDNA合成大腸埃希菌DNA聚合酶I Klenow 大片段: ac；補齊， 3末端標記耐熱Taq DNA 聚合酶： ab, 微弱的非模板依賴的末端轉移酶活性，耐高溫；PCR, TA-cloning逆轉錄酶：ab, 以mRNA為模板合成cDNA;降解RNA:DNA中的RNA；用于構建cDNA文庫T4 DNA 聚合酶：ac；補齊末端，標記T7 DNA 聚合酶：ac；序列分析；測序酶GAATTCCTTAAGCTGCAGGACGTCEcoRIPstI AATTC GCTGCAGEco

18、RIPstIDigestionEnd Blutting AATTC TTAAGCGT4-DNA polymerase+dNTPIdentifying Natural Product Biosynthetic Genes from a Soil Metagenome by Using T7 Phage Selection Zhang K, He J, Yang M, Yen M, Yin J. Chembiochem. 2009, 10(16):2599-2606.反轉錄酶 reverse transcriptase堿性磷酸酶Alkaline phosphatase催化去除DNA、RNA、dNTP或NTP上的5端磷酸基團，方便5端標記同位素，防止連接反應時載體的自身連接。細菌堿性磷酸酶Bacterial