大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備

1、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備標(biāo)簽：tr.,Ca.,co.分類： 細(xì)胞技術(shù) 感受態(tài)細(xì)胞來(lái)源： 實(shí)驗(yàn)管理實(shí)驗(yàn)概要 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的CaCl2法制備及質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 實(shí)驗(yàn)原理處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)菌經(jīng)CaCl2處理后接受外源DNA的能力顯著增加。細(xì)菌處于容易吸 收外源 DNA 的狀態(tài)叫感受態(tài)。在自然條件下，很多質(zhì)粒都可通過(guò)細(xì)菌接合作用轉(zhuǎn)移到新的宿主內(nèi)，但在人工構(gòu)建的質(zhì)粒載 體中，一般缺乏此種轉(zhuǎn)移所必需的mob基因，因此不能自行完成從一個(gè)細(xì)胞到另一個(gè)細(xì)胞 的接合轉(zhuǎn)移。如需將質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)移進(jìn)受體細(xì)菌，需誘導(dǎo)受體細(xì)菌產(chǎn)生一種短暫的感受態(tài)，以 攝取外源 DNA。轉(zhuǎn)化(Transformation )是將外源DNA分子引

2、入受體細(xì)胞，使之獲得新的遺傳性狀的一種 手段，它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領(lǐng)域的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)。轉(zhuǎn)化過(guò)程所用的 受體細(xì)胞一般是限制修飾系統(tǒng)缺陷的變異株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變體(R-,M-)，它可以容忍外源DNA分子進(jìn)入體內(nèi)并穩(wěn)定地遺傳給后代。受體細(xì)胞經(jīng)過(guò)一些 特殊方法(如電擊法，CaCl2，RbCl(KCl)等化學(xué)試劑法)的處理后，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生 了暫時(shí)性的改變，成為能允許外源DNA分子進(jìn)入的感受態(tài)細(xì)胞(Compenent cells)。進(jìn)入 受體細(xì)胞的DNA分子通過(guò)復(fù)制、表達(dá)實(shí)現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移，使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。 將經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞在篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)，即

3、可篩選出轉(zhuǎn)化子(Transformant，即帶有異 源DNA分子的受體細(xì)胞)。目前常用的感受態(tài)細(xì)胞制備方法有CaCl2和RbCl(KCl)法， RbCl(KCl)法制備的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率較高，但CaCl2法簡(jiǎn)便易行，且其轉(zhuǎn)化效率完全可 以滿足一般實(shí)驗(yàn)的要求，制備出的感受態(tài)細(xì)胞暫時(shí)不用時(shí)，可加入占總體積15%的無(wú)菌甘油 于-70C保存(半年)，因此CaCl2法使用更廣泛。主要試劑0.1mol/L CaCl2 溶液LB 液體培養(yǎng)基（3）3。甘油：3omL甘油溶于loomL蒸餾水，高壓滅菌。主要設(shè)備（1）超凈工作臺(tái)（2）冷凍離心機(jī)（3）恒溫?fù)u床（4）70 C 冰箱（5）10mL 移液管（6）吸耳球

4、（7）imL、200yL移液槍（配套槍頭）（8）50mL 離心管（9）i.5mL離心管實(shí)驗(yàn)材料大腸桿菌 DH5a （R-, M-, Amp-）實(shí)驗(yàn)步驟（一）受體菌的培養(yǎng)從LB平板上挑取新活化的E. coli DH5a單菌落，接種于35mL LB液體培養(yǎng)基中,37C 下振蕩培養(yǎng)過(guò)夜（12h左右）。（2）將該菌種懸液以1:100的比例接種，取250pL菌液轉(zhuǎn)接到25mL LB液體培養(yǎng)基中，37C 振蕩培養(yǎng)23h至OD600=0.5左右。（二）感受態(tài)細(xì)胞的制備（注意：以下操作在超凈工作臺(tái)完成。）將菌液轉(zhuǎn)入50mL離心管中，冰上放置I0min。在4C下，4000r/min離心I0min。棄去上清，將管

5、倒置imin以便培養(yǎng)液流盡。（3）用冰上預(yù)冷的 0.1mol/L 的 CaCl2 溶液 10mL 輕輕懸浮細(xì)胞，冰上放置 30min。（4）04C 4000r/min離心i0min，棄去上清，加入2mL預(yù)冷的0.imol/L的CaCl2溶液， 輕輕懸浮細(xì)胞，冰上放置（務(wù)必冰上放置）。（注意：以上操作完成了新鮮感受態(tài)細(xì)胞的制 備）（三）感受態(tài)細(xì)胞的分裝與凍存在2mL制備好的感受態(tài)細(xì)胞中加入2mL30%甘油（即1:1體積，甘油終濃度15%）。（2）將此感受態(tài)細(xì)胞分裝成每份200L（1.5mL dorf管），液氮速凍，快速轉(zhuǎn)入-70C冰箱保 存。（如果沒(méi)有液氮，可以將分裝的感受態(tài)細(xì)胞直接轉(zhuǎn)入-70C

6、冰箱保存。）注意事項(xiàng)(1)、細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)和密度最好從-70 C或-20C甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細(xì)胞的菌液。不要用已經(jīng) 過(guò)多次轉(zhuǎn)接，及貯存在4C的培養(yǎng)菌液。細(xì)胞生長(zhǎng)密度以每毫升培養(yǎng)液中的細(xì)胞數(shù)在5x107 個(gè)左右為佳。即應(yīng)用對(duì)數(shù)期或?qū)?shù)生長(zhǎng)前期的細(xì)菌，可通過(guò)測(cè)定培養(yǎng)液的0D600控制。對(duì)TG1菌株，OD600為0. 5時(shí)，細(xì)胞密度在5x107個(gè)/ml左右。(應(yīng)注意OD600值與細(xì) 胞數(shù)之間的關(guān)系隨菌株的不同而不同)。密度過(guò)高或不足均會(huì)使轉(zhuǎn)化率下降。 此外，受體 細(xì)胞一般應(yīng)是限制-修飾系統(tǒng)缺陷的突變株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變株。并 且受體細(xì)胞還應(yīng)與所轉(zhuǎn)化的載體性質(zhì)相匹

7、配。、試劑的質(zhì)量所用的CaCl2等試劑均需是最高純度的，并用最純凈的水配制，最好分裝保存于4C。、防止雜菌和雜DNA的污染 整個(gè)操作過(guò)程均應(yīng)在無(wú)菌條件下進(jìn)行，所用器皿，如離心管，移液槍頭等最好是新的，并經(jīng) 高壓滅菌處理。所有的試劑都要滅菌，且注意防止被其它試劑、DNA酶或雜DNA所污染, 否則均會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率或雜DNA的轉(zhuǎn)入。、整個(gè)操作均需在冰上進(jìn)行，不能離開(kāi)冰浴，否則細(xì)胞轉(zhuǎn)化率將會(huì)降低。人人都愛(ài) protocol。蛋白的純化菌液離心取出三角瓶,倒入離心管中，離心(6000rpm,10mi n,4C )離心之后，倒去上清.細(xì)胞重懸加上2mL的lysis buffer洗沉淀，重懸細(xì)胞.lysis

8、 buffer 配方是 HEPES (2M,PH 7.0)200|jl, Nacl (4M) 500pl, DTT 3pl, Brij 100pl,PMSF 200MH20 19ml共 20ml 體系.初步溶解加入溶菌酶20pl (100mg/ml)于重懸液中，然后冰浴20min.再用1.5ml EP管分裝.冷凍將分裝后的菌體放入-80C冰箱里冷凍約20min （或者使用液氮快速冷凍細(xì)胞懸液）后，取 出待其融化。細(xì)胞破碎融化之后破碎細(xì)胞，用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)破碎，每次10s, i nterval 20s, 20次若量大可用壓榨 機(jī)來(lái)破碎.離心離心細(xì)胞破碎液,12500rpm,1h,4C,然后收集

9、上清并轉(zhuǎn)另一個(gè)1.5ml管，再加100pl 1M Tris-HCl buffer（PH 8.0） 到上清中。（堿性有利于蛋白的獲得）可以先放-80.純化上清 準(zhǔn)備 Ni 柱在試管中加上空柱，緩慢滴加300pl的Ni柱于空柱中,待其完全沉淀（每300pl樹(shù)脂液中有5%Ni-NTA agnose）。再用 2ml 的 AT buffer 平衡柱子（大約 1h ）。AT buffer 配方： Tris-HCl 1M PH8.0 1000pl,NaCl 4M 1OOOpl,Brij 20pl,DTT 3pl, H2O 18ml. 上樣加2ml上清到Ni柱中，并用2ml AT buffer沖洗.（注意緩慢

10、滴加） 洗脫樣品加上 1ml 的 salt washing buffer 沖洗，其配方是 AT buffer 8ml,NaCl 5M 2ml,Brij 100pl.再加上 1ml 的 Imidazole buffer（AT buffer 9.8ml ,Imidazole 1M 0.2ml 沖洗,洗去非特 異性蛋白。 再洗脫目的蛋白用300pl的Elution buffer沖洗，獲得所需的特異性蛋白.Elution buffer配方：AT buffer 7.5ml,Imidazole 1M 2.5ml.純化細(xì)胞破碎液的沉淀用urea buffer重懸細(xì)胞沉淀，在常溫溫育1h,再離心（12500r

11、pm 1h 4C）,收集上清,重復(fù)上清純化步驟.urea buffer 的配方是 Tris-HCl 1M PH8.0 1000pl,NaCl 4M 1000pl, Brij 20pl,DTT 3pl, urea 8M 18ml.其余 buffer 均用 urea buffer 來(lái)配置.9.SDS的鑒定配膠（根據(jù)此蛋白的大?。?5KD），配置12%的膠）下 層 膠 的 配 方 :Acr/Bis 4.44ml, 下 層 膠 緩 沖 液 PH8.83.75ml,TEMED7|jl,10%APS75|jl,ddH2O6.8ml.上 層 膠 的 配 方 是 : Acr/Bis0.75ml, 上 層 膠

12、緩 沖 液 PH6.8 1.5ml,TEMED4|jl,10%APS37.5|jl,ddH2O3.75ml.配置樣品每管加樣品2pl,5xloading buffer 4pl再加ddH2O補(bǔ)全20pl體系.混合好loading buffer和樣品后，在100C下煮約5min,然后置室溫下冷卻后上樣。樣品 1：純化上清；樣品 2：純化沉淀；對(duì)照 1：未純化上清；對(duì)照2：未純化沉淀；對(duì)照3：標(biāo)準(zhǔn)甘油激酶上樣添加樣品，上樣20pl,同時(shí)加上Marker,10pl.電泳加上足夠的電泳緩沖液（1x）,要加在兩板內(nèi)外，一定要浸沒(méi)過(guò)板,形成電流通路.調(diào)好電壓進(jìn)行電泳，約1h后,loading buffer條

13、帶跑到底，便可停止.考馬斯亮藍(lán)染色將電泳后的PAGE膠取下放入容器中，加入50ml雙蒸水或去離子 水,加熱至沸騰后停止, 繼續(xù)在脫色搖床上搖動(dòng)5min,棄去水溶液.加上染色液，以浸沒(méi)膠面為準(zhǔn),加熱沸騰后保持狀態(tài)30-60S,停止加熱后繼續(xù)在脫色搖床 上搖動(dòng)10mi n,棄去染色液.加入約50ml的水,再加熱至沸騰后保持沸騰狀態(tài)30-60S,停止加熱后在搖床上要5-10mi n,換水可完成脫色.若要得到無(wú)背景的染色膠, 可重復(fù)脫色步驟或?qū)⒛z放在水中過(guò)夜.鎳柱。用不同濃度的咪唑洗脫。因?yàn)檫溥蚝徒M氨酸都帶正電，可在咪唑逐漸加大濃度的條件下洗脫目的蛋白。protocol里有啊。分離蛋白質(zhì)混合物的各種方

14、法主要是根據(jù)蛋白質(zhì)在溶液中的以下性質(zhì)：1）分子大?。?）溶 解度；3）電荷；4）吸附性質(zhì)；5）對(duì)其它分子的生物學(xué)親和力等進(jìn)行分離.常見(jiàn)的分離提純蛋白質(zhì)的方法有：1、鹽析與有機(jī)溶劑沉淀：在蛋白質(zhì)溶液中加入大量中性 鹽,以破壞蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì),使蛋白質(zhì)從溶液中沉淀析出,稱為鹽析.常用的中性鹽有：硫酸 銨、氯化鈉、硫酸鈉等鹽析時(shí),溶液的pH在蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)處效果最好凡能與水以任意比 例混合的有機(jī)溶劑,如乙醇、甲醇、丙酮等,均可引起蛋白質(zhì)沉淀.2、電泳法：蛋白質(zhì)分子在 高于或低于其pl的溶液中帶凈的負(fù)或正電荷，因此在電場(chǎng)中可以移動(dòng)電泳遷移率的大小主要 取決于蛋白質(zhì)分子所帶電荷量以及分子大小.3、透析法

15、：利用透析袋膜的超濾性質(zhì)，可將大分 子物質(zhì)與小分子物質(zhì)分離開(kāi).4、層析法：利用混合物中各組分理化性質(zhì)的差異,在相互接觸的 兩相（固定相與流動(dòng)相）之間的分布不同而進(jìn)行分離主要有離子交換層析，凝膠層析,吸附層 析及親和層析等,其中凝膠層析可用于測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量.5、分子篩：又稱凝膠過(guò)濾法，蛋 白質(zhì)溶液加于柱之頂部,任其往下滲漏,小分子蛋白質(zhì)進(jìn)入孔內(nèi),因而在柱中滯留時(shí)間較長(zhǎng),大 分子蛋白質(zhì)不能進(jìn)入孔內(nèi)而徑直流出，因此不同大小的蛋白質(zhì)得以分離.6、超速離心：利用物 質(zhì)密度的不同，經(jīng)超速離心后，分布于不同的液層而分離.超速離心也可用來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)的分 子量，蛋白質(zhì)的分子量與其沉降系數(shù)S成正比.蛋白純化過(guò)

16、程中,過(guò)完柱子后的上清稱為什么?我們稱為流穿液.蛋白過(guò)鎳柱純化的原理和步驟是什么？Ni柱中的氯化鎳可以與有His （組蛋白）標(biāo)簽的蛋白結(jié)合,也可以與咪唑結(jié)合. 步驟是：過(guò)柱子前可以選擇 Ni 柱重生,也就是往柱子里倒氯化鎳,一個(gè)柱長(zhǎng)體積就行了,然后 平衡柱子，拿你自己的buffer給蛋白提供最適的環(huán)境，我一般平衡4個(gè)柱長(zhǎng)，然后蛋白上樣，你可 以讓他自己掛,這樣掛柱子的效果好一些,如果流速太慢,可以加個(gè)恒流泵,但是一定不能太快, 太快掛柱效果差,當(dāng)然你也可以選擇循環(huán)掛柱,就是恒流泵的一頭接你裝蛋白的燒杯,從柱子 中留下來(lái)的液體還用同一個(gè)燒杯接回去.掛完之后，按理想來(lái)講，你的蛋白在Ni柱中與Ni就

17、結(jié) 合了,雜蛋白多數(shù)在燒杯里,留下來(lái)了,當(dāng)然肯定有少量雜蛋白也掛上了,這時(shí)候你要梯度洗脫, 拿咪唑和你的buffer配,一般從0 20mM 40mM.100mM這樣洗脫（當(dāng)你不知道你的蛋白大概 在什么時(shí)候出來(lái)的時(shí)候）我指的是咪唑的終濃度.咪唑加入之后，會(huì)和蛋白爭(zhēng)奪與Ni的結(jié)合位 點(diǎn),雜蛋白、你的目的蛋白,會(huì)在不同的濃度被洗脫下來(lái)，洗完之后，你可以用200mM咪唑洗柱 子,清理一切蛋白,然后平衡幾次,是否選擇重生你自己定咯然后放上 20%乙醇保存柱子就可 以咯 過(guò)的蛋白用不同的管子收下，然后SDS檢測(cè)在哪個(gè)管子里2016.4.4周 1：小搖：9點(diǎn)半，每個(gè)菌種5ml雙抗培養(yǎng)基（5ml新離心管），分別1,2,4號(hào)菌種。 共2 種菌（100:1 接菌）（1000:1 加入抗生素）加入100微升保存的菌種液。250rpm，3-4h試試。下午一點(diǎn)開(kāi)始大搖。大搖：一個(gè)1L的錐形瓶中5ml菌液+300ml雙抗培養(yǎng)基，250rpm，2-3h，4點(diǎn)半。 當(dāng)OD600約為0.6左右時(shí)