《微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用》核心知識(shí)總結(jié)

1、PAGE9專題2：微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用一、培養(yǎng)基的種類及用途（1）按培養(yǎng)基物理性質(zhì)劃分:名稱特征功能固體培養(yǎng)基外觀顯固體狀態(tài)的培養(yǎng)基，加凝固劑如瓊脂主要用于微生物的分離、鑒定、活菌計(jì)數(shù)、保藏菌種液體培養(yǎng)基呈液體狀態(tài)的培養(yǎng)基主要用于工業(yè)生產(chǎn)（2）按培養(yǎng)基的化學(xué)成分劃分：名稱特征功能天然培養(yǎng)基用化學(xué)成分不明確的天然物質(zhì)配成主要用于工業(yè)生產(chǎn)合成培養(yǎng)基用化學(xué)成分已知的化學(xué)物質(zhì)配成主要用于微生物的分類、鑒定（3）按培養(yǎng)基的功能分：種類制備方法特征用途選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)基中加入某種化學(xué)成分，抑制不需要微生物的生長根據(jù)某種微生物的特殊營養(yǎng)要求或其對某化學(xué)、物理因素的抗性而設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基，使混合菌樣中的劣勢菌變成優(yōu)勢

2、菌，從而提高該菌的篩選率培養(yǎng)分離出特定微生物，如：加入青霉素分離得到酵母菌和霉菌鑒別培養(yǎng)基在培養(yǎng)基中加入某種試劑或化學(xué)藥品依據(jù)微生物產(chǎn)生的某種代謝產(chǎn)物與培養(yǎng)基中特定試劑或化學(xué)藥品反應(yīng)，產(chǎn)生明顯的特征變化而設(shè)計(jì)鑒別和區(qū)分菌落相似的微生物，如伊紅和美藍(lán)培養(yǎng)基可以鑒別大腸桿菌二、微生物的營養(yǎng)1碳源概念凡能為微生物提供所需碳元素的營養(yǎng)物質(zhì)O3等（自養(yǎng)型微生物，如藍(lán)藻；硝化細(xì)菌等）有機(jī)碳源：糖類、脂肪酸、花生粉餅、石油等（異養(yǎng)型微生物，絕大多數(shù)細(xì)菌與全部真核微生物）作用主要用于構(gòu)成微生物體細(xì)胞的物質(zhì)和一些代謝產(chǎn)物異養(yǎng)微生物的主要能源物質(zhì)說明不同種類的微生物，對碳源需要差別大2氮源：概念凡能為微生物提供所

3、需氮元素的營養(yǎng)物質(zhì)硝酸鹽等；有機(jī)氮源：尿素、牛肉膏、蛋白胨、氨基酸等作用主要用于合成蛋白質(zhì)、核酸以及含氮的代謝產(chǎn)物說明異養(yǎng)微生物：含C、H、O、N的化合物既是碳源，又是氮源關(guān)于氮源物質(zhì)的，既可利用無機(jī)含氮化合物作為氮源，也可利用有機(jī)含氮化合物作為氮源。固氮微生物可以利用氮?dú)庾鳛榈?。銨鹽、硝酸鹽等既可作為微生物最常用的氮源，也可作為某些化能自養(yǎng)微生物的能源物質(zhì)。如消化細(xì)菌。自養(yǎng)微生物與異養(yǎng)微生物類型的劃分主要是依靠能否以CO2作為生長的主要或唯一的碳源，而不是由氮源決定。3水：水是微生物生命活動(dòng)必需的一種重要物質(zhì)。4無機(jī)鹽無機(jī)鹽對微生物的生理功能有：構(gòu)成微生物細(xì)胞的組成成分；作為酶的組成成分，

4、也是某些酶的激活劑；調(diào)節(jié)和維持微生物細(xì)胞的滲透壓和pH；某些無機(jī)鹽具有特殊功能，如化能自養(yǎng)細(xì)菌的能源物質(zhì)NH3等。5生長因子。6培養(yǎng)微生物還需要滿足微生物生長對pH、特殊營養(yǎng)物質(zhì)以及氧氣的要求。三、微生物的純化培養(yǎng)（兩種接種方法）1平板劃線法：操作簡單，但單菌落不易分離1無菌操作：在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)，在劃線操作結(jié)束時(shí)，仍然需要灼燒接種環(huán)。操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時(shí)，接種環(huán)上的菌種直接線次數(shù)的增加，使每次劃線時(shí)菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。劃線結(jié)

5、束后灼燒接種環(huán)，能及時(shí)殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者。2在灼燒接種環(huán)之后，要等其冷卻后再進(jìn)行劃線，以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。3由于劃線后，線條末端細(xì)菌的數(shù)目比線條起始處要少，所以，每次從上一次劃線的末端開始，能使細(xì)菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個(gè)細(xì)菌繁殖而來的菌落。2稀釋涂布平板法：操作復(fù)雜，但單菌落易分離1無菌操作：涂布平板的所有操作都應(yīng)在火焰附近進(jìn)行。應(yīng)從操作的各個(gè)細(xì)節(jié)保證“無菌”。例如，對涂布器等接種器具進(jìn)行消毒和滅菌、酒精燈與培養(yǎng)皿的距離要合適、吸管頭不要接觸任何其他物體、吸管要在酒精燈火焰周圍。2每一個(gè)稀釋度下涂布三個(gè)平板作為重復(fù)組，不

6、同稀釋度下涂布的平板形成對照組，且每個(gè)平板所用的樣液不超過毫升。3統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí)注意選取菌落數(shù)介于30300個(gè)之間的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，且重復(fù)組結(jié)果要有相近性。3評價(jià)和分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果1培養(yǎng)基的制作是否合格如果未接種的培養(yǎng)基在恒溫箱中保溫12d后無菌落生長，說明培養(yǎng)基的制備是成功的，否則需要重新制備。2接種操作是否符合無菌要求如果培養(yǎng)基上生長的菌落的顏色、形狀、大小基本一致，并符合該菌落的特點(diǎn)，則說明接種操作是符合要求的；如果培養(yǎng)基上出現(xiàn)了其他菌落，則說明接種過程中，無菌操作還未達(dá)到要求，需要分析原因，再次練習(xí)。3是否進(jìn)行了及時(shí)細(xì)致的觀察與記錄培養(yǎng)12h與24h后的菌落的大小會(huì)有明顯的不同，及時(shí)觀察記錄

7、的同學(xué)會(huì)發(fā)現(xiàn)這一點(diǎn)，并能觀察到其他一些細(xì)微的變化。四、菌落數(shù)目的統(tǒng)計(jì)1、顯微鏡直接計(jì)數(shù)法原理：利用特定細(xì)菌計(jì)數(shù)板或血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，在顯微鏡下計(jì)算一定容積的樣品中微生物的數(shù)量。缺點(diǎn)：不能區(qū)分死菌與活菌。2、間接計(jì)數(shù)法（活菌計(jì)數(shù)法）原理：當(dāng)樣品的稀釋度足夠高時(shí)，培養(yǎng)基表面生長的一個(gè)菌落過統(tǒng)計(jì)平板上的菌落數(shù)，就能推測出樣品中大約有多少個(gè)活菌。統(tǒng)計(jì)結(jié)果一般用菌落數(shù)而不用活菌數(shù)來表示。因?yàn)榫鋽?shù)往往比活菌的實(shí)際數(shù)目低。五、土壤中纖維素分解菌的篩選1、篩選原理剛果紅可以與纖維素形成紅色復(fù)合物，但并不和水解后的纖維二糖和葡萄糖發(fā)生這種反應(yīng)。纖維素分解菌能產(chǎn)生纖維素酶分解纖維素，從而使菌落周圍形成透明圈。2、篩

8、選方案：土壤取樣選擇培養(yǎng)梯度稀釋將樣品涂布到鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基上挑選產(chǎn)生透明圈的菌落。3、選擇培養(yǎng)的目的：增加纖維素分解菌的濃度，確保能夠從樣品中分離到所需要的微生物。4、涉及到的微生物技術(shù)主要是：培養(yǎng)基的配制、無菌操作技術(shù)、稀釋涂布平板法、選擇培養(yǎng)基的作用和土壤取樣等。5、過程設(shè)計(jì)篩選菌株微生物的選擇培養(yǎng)，是指利用培養(yǎng)基的組成使適宜生長的特定微生物得到較快繁殖的技術(shù)。在本專題課題2提供的選擇培養(yǎng)基的配方中，尿素是培養(yǎng)基中的唯一氮源，因此，原則上只有能夠利用尿素的微生物才能夠生長。但實(shí)際上，微生物的培養(yǎng)是一個(gè)非常復(fù)雜的問題，有些微生物可以利用其他微生物的代謝產(chǎn)物生長繁殖，因此能夠在選擇培

9、養(yǎng)基上生長的微生物不一定是所需要的微生物，還需要進(jìn)一步的驗(yàn)證。統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目的理論依據(jù)是：當(dāng)樣品的稀釋度足夠高時(shí)，培養(yǎng)基表面生長的一個(gè)菌落，此，恰當(dāng)?shù)南♂尪仁浅晒Φ亟y(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目的關(guān)鍵。為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，通常將幾個(gè)稀釋度下的菌液都涂布在平板上，培養(yǎng)后再選擇菌落數(shù)在30300的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。教材的實(shí)例是為了說明設(shè)置重復(fù)組的重要性。第一位同學(xué)只涂布了一個(gè)平板，沒有設(shè)置重復(fù)組，因此結(jié)果不具有說服力。第二位同學(xué)考慮到設(shè)置重復(fù)組的問題，涂布了3個(gè)平板，但是，其中1個(gè)平板的計(jì)數(shù)結(jié)果與另2個(gè)相差太遠(yuǎn)，說明在操作過程中可能出現(xiàn)了錯(cuò)誤，因此，不能簡單地將3個(gè)平板的計(jì)數(shù)值用來求平均值。這個(gè)實(shí)例啟示了學(xué)生，

10、在設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)時(shí)，一定要涂布至少3個(gè)平板，作為重復(fù)組，才能增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)的說服力與準(zhǔn)確性。在分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí)，一定要考慮所設(shè)置的重復(fù)組的結(jié)果是否一致，若結(jié)果不一致，意味著操作有誤，需要重新實(shí)驗(yàn)。設(shè)置對照教材的實(shí)例是為了說明設(shè)置對照組的重要性。A同學(xué)的結(jié)果與其他同學(xué)不同，可能的解釋有兩種。一是由于土樣不同，二是由于培養(yǎng)基污染或操作失誤。究竟是哪個(gè)原因呢這可以通過實(shí)驗(yàn)來證明。實(shí)驗(yàn)方案有兩種。一種方案是可以由其他同學(xué)用與A同學(xué)一樣的土樣進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，如果結(jié)果與A同學(xué)一致，則證明A無誤；如果結(jié)果不同，則證明A同學(xué)存在操作失誤或培養(yǎng)基的配制有問題。另一種方案是將A同學(xué)配制的培養(yǎng)基在不加土樣的情況下進(jìn)行培養(yǎng)，作為空白對照，以證明培養(yǎng)基是否受到污染。通過這個(gè)事例可以看出，實(shí)驗(yàn)結(jié)果要有說服力，對照的設(shè)置是必不可少的。六、易錯(cuò)歸納1、培養(yǎng)物中是否有雜菌污染以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出菌落：對照的培養(yǎng)皿在培養(yǎng)過程中沒有菌落生長，說明培養(yǎng)基沒有被雜菌