分析化學(xué)課件：色譜通論 液相色譜

1、色譜通論&液相色譜1 概述 2 色譜法基本原理3 發(fā)展概況 (自學(xué)) 4 柱色譜5 薄層色譜法6 薄層掃描法7 紙色譜法 本章小結(jié)1 概述 一. 色譜法 (層析法)定義：利用各組分物理化學(xué)性質(zhì)的不同，在流動相流經(jīng)固定相時，由于各組分在兩相間的吸附、分配或其它親和力的差異而產(chǎn)生不同速度的移動，最終達(dá)到分離的目的。分離基礎(chǔ)：差速遷移 (例:賽跑) 特點(diǎn)：效率高，靈敏度高，能把性質(zhì)相近的物質(zhì)彼此分 開，適合于干擾組分存在的混合物的分離分析。 二、分類 (一) . 以兩相所處的狀態(tài)分類： 流動相 固定相 類型 液 固 L-S色譜 液 液 L-L色譜 氣 固 G-S色譜 氣 液 G-L色譜 (二). 按

2、分離機(jī)理分類： (1). 吸附色譜: 利用吸附劑表面對不同組分吸附力不同而分離。 (LS 色譜 gS色譜) 固定相為固體的色譜。 (2). 分配色譜: (LL , gL). 利用各組分在兩相間分配系 數(shù)不同進(jìn)行分離。 (3). 離子交換: 利用不同組分對離子交換劑親和力不同分離。 (4).分子排阻色譜: 利用某些凝固對不同組分因分子大小不 同而阻止作用不同，進(jìn)行分離。(三). 按操作類型分類： 柱色譜：氣相、高效、超臨界流體、經(jīng)典柱等等。 平面色譜：薄層、紙色譜（載體水）。 逆流分配：屬液相色譜，目前已很少使用。2 色譜法基本原理 一. 色譜過程： 物質(zhì)分子在相對運(yùn)動的兩相間，分配“平衡”的過

3、程。 前面已講其分離機(jī)制是差速遷移。例：順、反偶氮苯在柱中吸附解吸附，再吸附 用化學(xué)方法無 法分離。柱中填氧化鋁,將正、反體溶液加入流動相中沖洗,經(jīng)吸附,解吸附流出曲線:二. 分配系數(shù)與保留行為的關(guān)系： 1. 分配系數(shù)：柱中分配平衡后，組分在固定相與流動相 中的濃度之比。 K =CS / Cm S固定相 m流動相 K與T有關(guān)。 對于不同的分離機(jī)理，K的含義不同: 吸附色譜 稱 吸附系數(shù) 分配色譜 稱 分配系數(shù) 離子交換色譜 稱 離子交換系數(shù) 分子排阻色譜 稱 分子排阻系數(shù) 2. 保留時間：從進(jìn)樣到某組分色譜峰峰頂?shù)臅r間間隔， 為該組分的保留時間（tR ）。 保留體積：從進(jìn)樣到某組分色譜峰峰頂所

4、需流動相的體積 為該組分的保留體積VR。 死時間：不保留組分(不與固定相作用的組分)的保留時間 為死時間tm(即流動相的保留時間)。 死體積：Vm 保留時間是色譜的定性參數(shù)，同樣組分，在同樣色譜條件 下，tR 應(yīng)相同。3. tR 與K 的關(guān)系： 設(shè)R為一個分子在流動相中出現(xiàn)的幾率, 則固定相中1 R 。 ( 1- R) / R = CsVs/CmVm = KVs/Vm 整理后得: 1/ R = 1+ KVs/Vm 即有: 色譜基本關(guān)系式之一在一定的色譜條件下, tm、Vs、Vm為定值, tR與K呈線形關(guān)系。 組分的K大, tR大,后洗脫(后出峰)。 組分的K小, tR小,先洗脫(先出峰)?；旌?/p>

5、物中各組分K相差愈大,各組分愈易彼此分開。K與組分、流動相、固定相、的性質(zhì)和溫度有關(guān)。而在色譜條件一定時, tR主要取決于組分的性質(zhì)。因此, tR是定性參數(shù)。三. 分離機(jī)制: 在分類已簡單提了一下,自己學(xué)習(xí),后面用到時再詳細(xì) 補(bǔ)充說明。 4 柱色譜有吸附柱色譜、分配柱色譜、離子交換柱色譜等。一. 液固 吸附柱色譜:固體吸附劑: 是一些多孔性物質(zhì),表面布滿吸附點(diǎn)位(吸附中心)。吸附: 溶質(zhì)在液固、氣固 兩相交界面上集中濃縮的現(xiàn)象。 它發(fā)生在固體表面上。(一) 色譜分離過程: X : 樣品中各組分分子 Y : 流動相分子 Xm: 流動相中溶質(zhì) Ya: 吸附劑表面的流動相分子 Xa: 吸附劑吸附的溶

6、質(zhì)分子 Ym: 流動相由Ya回到流動相中 吸附平衡常數(shù): 由于流動相分子是大量的,所以Ym/ Ya 可視為常數(shù)。 Ka = Xa / Xm 吸附常數(shù)組分Ka越大, tR越長。(組分易被吸附,移行速度慢,保留值就大)。 洗脫曲線: (二)吸附等溫線 一定溫度,某組分在吸附劑表面吸附平衡,該組分在兩 相中的濃度相關(guān)曲線。 1、直線形等溫線是理想等溫線,其所對應(yīng)的色譜峰為對稱 峰。即吸附劑表面沒被溶質(zhì)所飽和，斜率K=Cs/Cm，組 分流出速度不受濃度的影響。峰前不變形，后不拖尾。2、凸形：由于固體吸附劑表面活性不同，大多數(shù)液相色譜 非線形，且凸形較多。吸附劑表面具有吸附能力不同的 吸附點(diǎn)位，溶質(zhì)在其

7、表面的分配系數(shù)不同。溶質(zhì)分子先 占據(jù)強(qiáng)吸附點(diǎn)位，然后再占據(jù)次強(qiáng)的、弱的、最弱的。 強(qiáng)的吸附點(diǎn)位被飽和，在洗脫過程中，被強(qiáng)吸附的溶質(zhì) 洗脫較慢，所以其洗脫峰呈拖尾峰。（減少進(jìn)樣量）3、凹形：由于進(jìn)樣量較大，影響了固定相的物理性質(zhì)。隨 溶質(zhì)量的增加, Cs/Cm增加，所以呈凹形。 為防止流出曲線變形、拖尾，應(yīng)控制溶質(zhì)進(jìn)樣量。(三). 吸附劑的選擇和吸附活度： 1. 對吸附劑的要求： (1)表面積大，具有一定的吸附能力。 (2)不應(yīng)與流動相發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。 (3)粒度要細(xì)，一般要200目。 2. 吸附劑：常用的有：氧化鋁、聚酰胺、硅膠等。 酸性pH = 54 分離酸性物質(zhì). 如氨基酸 (1) 中性pH

8、 = 7.5 氧化鋁 分離生物堿. 如揮發(fā)油,甾體等 堿性pH =910 分離堿性. 如生物堿 (2) 硅膠: 吸附能力稍弱于氧化鋁,用于分離弱酸活中性物(如 有機(jī)酸、氨基酸、甾體等)。硅醇基是使硅膠有一 定吸附能力的活性基團(tuán)。 三種存在形式: 吸附能力 ： 活性大小 ： (3) 聚酰胺:由酰胺聚合而成的高分子物質(zhì)。 其吸附原理利用分子內(nèi)酰胺基和羰基,可與酚、酸、硝基 化合物等形成氫鍵。吸附力與能形成氫鍵的基團(tuán)有關(guān)。 對位間位取代基均能形成氫鍵的,吸附力增大。鄰位基團(tuán) 間能形成分子內(nèi)氫鍵的,吸附力減小。芳香核具有較多共 軛鍵時,吸附力增大。3. 吸附劑的活度： 氧化鋁、硅膠的吸附力的大小, 與

9、其含水量有較大的關(guān)系： 活度級數(shù) 含水量 活度 吸附能力 小 少 大 強(qiáng) 大 多 小 弱 所以，加熱除水，活度提高，吸附力加強(qiáng)。 加一定水，活度下降，吸附力減弱。 活化：105110加熱除水為活化。 脫活：加一定水份，降低活性。 4. 薄層色譜法測Al2O3的活度: 把柱色譜法配置的染料溶液點(diǎn)在待測活性的氧化鋁薄層板上(軟板), 每種點(diǎn)24g , 用石油醚展開, 展距10cm, 觀察染料斑點(diǎn)中心移動距離在10.5cm, 則此吸附劑為級。 (四) 流動相的選擇: 流動相又稱洗脫劑、展開劑或移動相。 要求: 1. 純度高 2. 穩(wěn)定(對樣品和吸附劑不反應(yīng)) 3. 對樣品溶解度大 4. 粘度小(易洗

10、脫)。選擇流動相應(yīng)考慮三方面：1. 被分離物質(zhì)的極性與結(jié)構(gòu): (1) 基本母核相同 , 基團(tuán)極性愈大 , 分子極性愈大。 基本母核相同 , 極性基團(tuán)數(shù)目愈多 , 分子極性愈大。 常見的取代基極性大小順序: 烷烴 烯烴 醚類 硝基化合物 二甲胺 脂類 酮類 醛類 硫醇 胺類 酰胺 醇類 酚類 羧酸類 (2) 分子雙鍵多, 吸附力 , 共軛度, 吸附性 。(3) 空間排列 , 影響極性。 如：2. 吸附劑的活度: 被分離物質(zhì)的極性 吸附劑活度 大 應(yīng)選 小 防吸附太牢,難洗脫 小 大 防tR太小,不易分離 3. 流動相: 相似相溶的原則 被分離物質(zhì)的極性 吸附劑活度 流動相極性 大 小 大 小 大

11、 小 常用流動相極性強(qiáng)弱順序: 石油醚 環(huán)己烷 四氯化碳 苯 甲苯幾 乙醚 氯仿 醋酸乙酯 正丁醇 丙醇 乙醇、甲醇 1 , 說明B+ 較牢地結(jié)合在樹脂上 KB/A 1 , 說明A+ 較牢地結(jié)合在樹脂上 所以KB/A說明了樹脂對A+、 B+兩種離子選擇性交 換的能力,故也稱之為選擇性系數(shù)。 KB/A , B與樹脂結(jié)合能力強(qiáng) , 洗脫慢 , tR 。2. 選擇性系數(shù)與分配系數(shù)的關(guān)系: 即: 分配系數(shù)不同是離子交換分離的先決條件。 5 薄層色譜法TLC 操作流程: 鋪板 活化 點(diǎn)樣 飽和 展開 顯色 定性 , 定量。 一. 原理: 將混合組分的試液, 點(diǎn)在鋪了吸附劑的玻璃板一端, 在密閉容器中用適

12、當(dāng)?shù)娜軇?(展開劑、流動相) 展開, 各組分不斷地被吸附, 解吸附 隨展開劑前移, 利用吸附劑對不同組分的吸附力 (吸附常數(shù))不同, 產(chǎn)生差速遷移, 而達(dá)到分離。 特點(diǎn): 快速、靈敏(幾幾十微克)、 高選擇、顯色方便。二 參數(shù): (一) 定性參數(shù): 比移值 RfA= a / c RfB = b / c 討論: Rf = 0 未移行 (被固定完全吸附, K ) Rf = 1 移至前沿 (組分不被固定相吸附, K 0 ) 一般: 0 Rf 1 Rf是薄層色譜的定性參數(shù), 在同一色譜條件下, 同樣結(jié)構(gòu) 的分子由相同的Rf值。(例: SMZ、TMP) 某物質(zhì)，當(dāng)色譜條件一致時，Rf定值，定性用，但重現(xiàn)

13、 性差。有人建議用相對可比值定性。 參考斑可以是另加的物質(zhì),亦可以樣品中另一組分為參考。 Rf值的大小, 主要取決于該組分在兩相間的分配系數(shù), 因此: Vm: 薄層板的死體積; VS: 板固定相體積; K: 該條件的分配系數(shù) 物質(zhì)極性大, 吸附力強(qiáng); 反之, 物質(zhì)極性小, 吸附力弱。 Rf最佳范圍: 0.30.5 , 也可控制在0.20.8使用。 (二)分離參數(shù): 分離度 X1、X2色斑中心到原點(diǎn)的距離。 W1、W2兩色斑的峰寬(掃描測定)。一般亦可用縱向直徑。（三）容量因子相平衡參數(shù)三. 固定相 1. 吸附柱色譜的固定相薄層色譜也可以使用, 但薄層色譜所用的硅膠、Al2O3粒度比柱色譜更細(xì)。

14、 硅膠 40 m (一般要求200目左右) 常用硅膠GF254: 吸附劑(硅膠)、粘合劑(石膏),摻入熒光劑254 nm,呈黃綠色。 符號: 硅膠G 硅膠 + 石膏 硅膠H 硅膠(未加任何物質(zhì)) 硅膠HF254 硅膠不含粘合劑+熒光物質(zhì) 硅膠GF254 硅膠+石膏+熒光物質(zhì)2. 鋪板: 常用平滑的玻璃板,洗凈待用。 軟板: 吸附劑直接鋪涂。最大缺點(diǎn), 風(fēng)吹即飛(已不用)。 硬板: 吸附劑+粘合劑糊狀鋪板涼干活化 常用粘合劑: CMC-Na 羧甲基纖維素鈉。(0.250.75%的 CMC-Na水溶液與吸附劑3：1調(diào)粘研磨) 活化: 涼干的板在110活化1小時,于干燥器中備用。 四. 展開劑選擇:

15、 (同柱)僅操作方法不同。 分離強(qiáng)極性物質(zhì), 選擇強(qiáng)極性展開劑, 同時也應(yīng)考慮固 定相的活性。 物質(zhì)極性 吸附力 流動相極性 防止 大 強(qiáng) 大 太牢, Rf太小 小 弱 小 Rf太大 分離混合樣品時, 展開劑選擇一般規(guī)則: (1)先用單一的中等極性展開劑試一下。 (2)改用二元展開劑, 其比例要摸索。 目的: 改變展開劑的極性。 例: A、B兩組分試樣 A B 展開劑 苯 Rf 0.45 0.42 分不開 改為 苯+乙醇 Rf 0.38 0.52 可分開 能否說出 A、B哪一組分極性大？ 解：顯然B的極性大。因?yàn)檎归_劑極性加大時, 極性大的組分 Rf(相似相溶)。 一般做實(shí)驗(yàn)組分Rf控制在0.

16、20.8之間。 五. 點(diǎn)樣與展開: (一)點(diǎn)樣 點(diǎn)樣量一般在一幾十g, 23 mm。 點(diǎn)樣量太大, 斑易拖尾, 影響分離效果。 注: 有時用于薄層制備與分離提取時,條狀點(diǎn)樣。 點(diǎn)樣位置: 距底邊1.52cm處, 鉛筆畫線、點(diǎn)點(diǎn)。(二)展開: 先飽和1520分鐘,再展開,防止邊緣效應(yīng)。 * 展開劑浸薄層板下端0.5cm, 不能浸住起始線, 層析缸 應(yīng)密閉。 展開方式: 為單向展開,亦可雙向展開、多次展開等。 六. 定性與定量: (一)定性: 找斑所在位(求Rf)對照。 1. 顯色: 本身有色的可日光下顯色 紫外燈下顯色:主要用于熒光物質(zhì)有明顯熒光斑、有紫外吸收的物質(zhì)。 熒光薄層板:用于有紫外吸收

17、的物質(zhì)。 顯色劑 (通用型顯色劑：硫酸乙醇液或碘） 2. 定性分析: 比較組分與對照品Rf值。 對未知樣品,要幾個展開體系均有一致Rf值,才可認(rèn)為同一物質(zhì)。 (二)定量: 1. 目視比色:色斑大小、深淺 (誤差大, 1030%) 2.洗脫法:刮下,溶解,光度法測定。 5 % (基本符合微量分析誤差要求)。 3.薄層掃描: 誤差 5 % (符合要求)。 6 薄層掃描法 一. 薄層掃描儀: 1. 光路: 如圖-雙波長雙光束掃描,光 經(jīng)過兩個單色器得到1, 2的光, 由斬光器分別將光照在薄層板 上, 經(jīng)放大后得到吸收度信號是 1和2的兩波長吸光度之差。 2. 波長選擇原則： 參比波長: , 化合物吸

18、收光譜的基線部分 (即無吸收或吸收最小的波長) 測定波長:, 通常選擇化合物吸收峰波長。 如此測定消除了背景的吸收干擾,得到了 較好的曲線。 二. AC曲線: 不符合Beer-Lambert定律, 符 合Kubelka-mark (克曼方程)及 峰面積與進(jìn)樣量呈曲線關(guān)系。 透光率 T= i / I0 ( I0 : 照射光強(qiáng), i:光透過微分 薄層上的入射光強(qiáng) ) 反射率 R= j / I0 ( j : 為反射光強(qiáng)度 ) 透射法中: A = -lg T/T0 ( T0、R0空板透光率和反射率. 反射法中: R = -lg R/R0 T、R 斑點(diǎn)的透光率和反射率.) 三. 掃描條件的選擇: (一)

19、 測光方式: 1. 吸收光度法: 透射法: A=-lg( T / T0) = lg ( T0/ T ) (用于透明板) 反射法: A = lg( R0/ R ) ( 適用于不透明層析板, 如硅膠板,Al2O3板 ) 2. 熒光法: 利用物質(zhì)本身能發(fā)出熒光的強(qiáng)弱或板上暗斑(熒光淬 滅)進(jìn)行定量。 熒光強(qiáng)度: F=I0 a b c ( : 效率, I: 入射光 , a: 系數(shù), b: 薄層 c: 樣品濃度)(二) 掃描方法: 直線掃描: 光束以直線軌跡通過色斑色斑外形 規(guī)則時用。 鋸齒形掃描: 光束以鋸齒形軌跡移動色斑外形 不規(guī)則時用。四. 定量方法: 1. 外標(biāo)一點(diǎn)法: 標(biāo)準(zhǔn)曲線通過原點(diǎn)時,才能

20、用之。 m樣 / m 標(biāo)= A樣 / A標(biāo) (A : 峰面積 ; m: 樣品或標(biāo)品的量) 2. 外標(biāo)二點(diǎn)法: 標(biāo)準(zhǔn)曲線不通過原點(diǎn)時,用之。 用兩種濃度的對照品液(或一種濃度、兩種點(diǎn)樣量)與 樣品液對比定量。 m = a + b A樣 式中: b = m1-m1/A1-A2 a = m1-bA1 7 紙色譜法 一. 基本原理 LL分配色譜 載體: 濾紙的紙纖維 固定相: 濾紙上吸附的水分(2026%水分中有6%的 水分通過氫鍵與纖維素 上的羥基結(jié)合成為 復(fù)合物) 流動相: 與水不相混溶的有機(jī)溶劑。 定性參數(shù): Rf 操作類似于薄層,但原理卻不同。 (一)Rf與K的關(guān)系: Rf大, K小, 極性小

21、的物質(zhì); Rf小, K大, 極性大的物質(zhì)。 由式: K愈小, Rf愈大。各組分K不同,就有不同的Rf, 從而得以分離。 (二) Rf的影響因素: 1. 物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu): 極性大的物質(zhì), 水中分配多, Rf小。 極性小的物質(zhì), 水中分配少, Rf大。例: 葡萄糖 鼠李糖 洋地黃毒甙分子中羥基數(shù) 5 4 3親脂性基團(tuán) 0 CH3 CH2 , CH3分子極性 大 次 小 Rf 小 中 大 2. 色譜條件的影響: 展開劑的極性: 展開劑的極性,極性物質(zhì)Rf ,親脂性組Rf 。 展開劑蒸氣: 對Rf影響較大, 所以應(yīng)先讓蒸氣將層析缸飽和, 以免造成流動相的比例改變。 溫度:二. 實(shí)驗(yàn)條件選擇: 1. 選

22、紙: 質(zhì)地均勻, 無折痕。 若Rf小, 選中速或快速濾紙; 若粘度大,選質(zhì)地松 的濾紙。若組分多,選中速或慢速濾紙。一般常 選中速濾紙。 2. 點(diǎn)樣: 一般幾幾十 g , 23 mm 3. 展開: 先飽和, 再展開, 與薄層類似。 4. 定性: Rf 顯色：與薄層一樣（無熒光薄層即硫酸顯色） 5. 定量: 剪下,洗脫,光度法定量。 例樣品在TLC上展開，10分鐘時有一Rf值，但20分鐘時的展開結(jié)果是：（ ）A、Rf值加倍 B、Rf值不變 C、樣品移行距離加倍D、樣品移行距離增加，但小于2倍 E、樣品移行距離增加，但大于2倍答案：(D） 例2用紙色譜分離組分A、B、C，以乙醇：水：冰醋酸（7：2：1）為展開劑時，Rf值的大小順序?yàn)镽faRfbRfc；若改用苯：丙酮：冰醋酸（7.5：2：0.5）為展開劑時，則Rf值的大小順序可能是（ ）。A