基因克隆載體的種類和特性

1、生命中的螺旋結(jié)構(gòu)精彩人生螺旋式上升第一頁(yè)，共七十四頁(yè)。第二章基因克隆載體的種類和特性第二頁(yè)，共七十四頁(yè)。基因工程的基本條件A 目的基因（從特定的生物基因組或cDNA中通過各種方法分離和擴(kuò)大繁殖獲得足夠量的目的基因或cDNA序列）B 用于基因克隆的載體（合適的載體，并對(duì)載體DNA進(jìn)行克隆，制備足夠量又達(dá)到一定純度的載體DNA）C 用于核酸操作的工具酶D 用于基因轉(zhuǎn)移的受體菌或細(xì)胞（宿主細(xì)胞）（能攝取外源重組DNA并使其穩(wěn)定維持和表達(dá)，或有待于實(shí)施遺傳改良的細(xì)胞）第三頁(yè)，共七十四頁(yè)。一、載體的功能、特征及種類載體（vector)： 攜帶外源基因(或DNA片段)進(jìn)入受體細(xì)胞（復(fù)制、整合或表達(dá)）的工具

2、。使用載體的目的基因的復(fù)制擴(kuò)增基因的表達(dá)基因的整合基因的調(diào)控其他第四頁(yè)，共七十四頁(yè)。1、載體的功能（1）運(yùn)送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞（2）為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力（3）為外源基因的擴(kuò)增或表達(dá)提供條件第五頁(yè)，共七十四頁(yè)。2、載體應(yīng)具備的條件（1）具有對(duì)受體細(xì)胞的可轉(zhuǎn)移性（2）具有與特定受體細(xì)胞相適應(yīng)的復(fù)制位點(diǎn)或整合位點(diǎn)（3）長(zhǎng)度盡可能小，以提高其載裝能力（4）具有多種單一的核酸內(nèi)切酶切割位點(diǎn)（Multiple Cloning Site,即多克隆位點(diǎn)，MCS）（5）具有合適的選擇性標(biāo)記第六頁(yè)，共七十四頁(yè)。3、載體的種類（1）質(zhì)粒（plasmid）載體（又可分為：克隆載體、中間載體、穿梭載體

3、和表達(dá)載體）（2）噬菌體（phage）載體 A、噬菌體 B、考斯質(zhì)粒（粘性質(zhì)粒）（cosmid) C、M13DNA（單鏈絲狀噬菌體）（3）酵母人工染色體載體（YAC）（4）細(xì)菌人工染色體載體（BAC）（5）其他載體第七頁(yè)，共七十四頁(yè)。4、載體的要求獨(dú)立復(fù)制可插入外源片段易分離，易操作第八頁(yè)，共七十四頁(yè)。二、質(zhì)粒（plasmid)1、質(zhì)粒是存在于細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)中獨(dú)立于染色體而自主復(fù)制的共價(jià)、閉合、環(huán)狀雙鏈DNA分子（Covalently closed circular DNA, ccc DNA)，質(zhì)粒是一類引人注目的亞細(xì)胞有機(jī)體，其結(jié)構(gòu)比病毒還要簡(jiǎn)單，既無(wú)蛋白質(zhì)外殼，也無(wú)細(xì)胞外生命周期，只能在寄主細(xì)

4、胞內(nèi)增殖，并隨著寄主細(xì)胞的分裂而被遺傳下去。2、它并不是細(xì)菌生長(zhǎng)所必需的，但可以賦予細(xì)菌某些抵御外界環(huán)境因素不利影響的能力。質(zhì)粒類型多種多樣，有F質(zhì)粒也叫性質(zhì)粒；有編碼抗菌素抗性基因的質(zhì)粒叫R質(zhì)粒，R質(zhì)?？蓪⑵淇剐赞D(zhuǎn)移到缺乏該質(zhì)粒的適宜的受體細(xì)胞，使后者也獲得同樣的抗菌素抗性能力；有產(chǎn)生大腸桿菌毒素的Col質(zhì)粒等。3、質(zhì)粒DNA分子可以持續(xù)穩(wěn)定地處于染色體外的游離狀態(tài)，但在一定的條件下又會(huì)可逆地整合到寄主染色體上，隨著染色體的復(fù)制而復(fù)制，并通過細(xì)胞分裂傳遞到后代。4、質(zhì)粒DNA不僅能在細(xì)菌中復(fù)制，并且在添加真核復(fù)制信號(hào)和啟動(dòng)子后，可以構(gòu)建出能在原核和真核細(xì)胞中均可復(fù)制的穿梭質(zhì)粒，并在真核細(xì)胞中

5、表達(dá)，因此這類載體在基因工程中應(yīng)用廣泛。第九頁(yè)，共七十四頁(yè)。除了酵母的殺傷質(zhì)粒(Killer plasmid)是RNA質(zhì)粒外，所有的質(zhì)粒都是DNA質(zhì)粒。關(guān)于質(zhì)粒DNA的大小, 文獻(xiàn)中有多種說法： 小的僅有103KD，僅能編碼2-3種蛋白質(zhì)； 大的可達(dá)105KD，兩者相差上百倍。 1Kb200Kb (Sambrok et al.) 5Kb400Kb (Lehninger) MD(megadaltons)=106D (兆道爾頓) 1.5Kb1MD質(zhì)粒DNA大小范圍：一般在1-200kb之間,多數(shù)10kb左右第十頁(yè)，共七十四頁(yè)。質(zhì)粒常見于原核細(xì)菌和真菌中第十一頁(yè)，共七十四頁(yè)。質(zhì)粒的發(fā)展概況 1.第一

6、階段（1977年前）：天然質(zhì)粒和重組質(zhì)粒的利用，如pSC101, colE1, pCR, pBR313和pBR322 (1977, Bolivar et al) 2.第二階段：增大載體容量（降低載體長(zhǎng)度），建立多克隆位點(diǎn)區(qū)和新的遺傳標(biāo)記基因。如pUC系列載體。 3.第三階段：進(jìn)一步完善載體功能以滿足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列載體，含T3，T7，sp6啟動(dòng)子載體，表達(dá)型載體及各種探針型載體。質(zhì)粒載體是上世紀(jì)70年代實(shí)驗(yàn)室普遍使用的基因克隆載體。 第十二頁(yè)，共七十四頁(yè)。（一）質(zhì)粒的生物學(xué)特點(diǎn)1、自主復(fù)制性(Self-replication)：2、相容性和不相容性(incompati

7、bility) ：3、可轉(zhuǎn)移性(transferability or transitivity)：第十三頁(yè)，共七十四頁(yè)。1、質(zhì)粒的自主復(fù)制性：質(zhì)粒能利用寄主細(xì)胞的DNA復(fù)制系統(tǒng)進(jìn)行自主復(fù)制質(zhì)粒DNA上的復(fù)制子結(jié)構(gòu)決定了質(zhì)粒與寄主的對(duì)應(yīng)關(guān)系根據(jù)在每個(gè)細(xì)胞中的分子數(shù)（拷貝數(shù)）多寡，質(zhì)粒可分為 兩大復(fù)制類型： 嚴(yán)緊型復(fù)制控制的質(zhì)粒（stringent plasmid）：質(zhì)粒的復(fù)制受寄主細(xì)胞染色體DNA和染色體蛋白質(zhì)的控制，在細(xì)胞中以低拷貝數(shù)量形式存在， 1 - 3 拷貝。（低拷貝數(shù)質(zhì)粒） 松弛型復(fù)制控制的質(zhì)粒（relaxed plasmid）：質(zhì)粒的復(fù)制不受寄主細(xì)胞染色體DNA和染色體蛋白質(zhì)的控制，

8、在細(xì)胞中以高拷貝數(shù)量形式存在，10 - 60 拷貝。（高拷貝數(shù)質(zhì)粒） 第十四頁(yè)，共七十四頁(yè)。1、質(zhì)粒的自主復(fù)制性：拷貝數(shù)的控制機(jī)制 質(zhì)粒DNA復(fù)制啟動(dòng)控制控制復(fù)制起始因子與復(fù)制起始位點(diǎn)（ori）的結(jié)合P/OrepreporiCopRep抑制蛋白起始蛋白Pcopcop第十五頁(yè)，共七十四頁(yè)。質(zhì)粒復(fù)制控制的分子模型：*抑制蛋白質(zhì)稀釋模型(Inhibitor dilution model) 關(guān)鍵論點(diǎn)是：阻遏蛋白質(zhì)是組成型合成，其濃度同質(zhì)粒的拷貝數(shù)成正比。*自體阻遏蛋白質(zhì)模型(Autorepressor model) 關(guān)鍵論點(diǎn)是：阻遏蛋白質(zhì)的合成受負(fù)反饋(Negative feedback)機(jī)理調(diào)節(jié)，而

9、且其濃度是恒定的。第十六頁(yè)，共七十四頁(yè)。2、質(zhì)粒的相容性和不相容性(又稱為親和性與不親和性) ：在同一時(shí)間內(nèi)從一個(gè)細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)多個(gè)不同類型的質(zhì)粒 ，只有當(dāng)不同的質(zhì)粒是相容的時(shí)才能存在于同一個(gè)細(xì)胞中； ：質(zhì)粒的不相容性是指在沒有選擇壓力的情況下，兩種親緣關(guān)系密切的不同質(zhì)粒，不能夠在同一寄主細(xì)胞中穩(wěn)定共存的現(xiàn)象。不相容的質(zhì)粒一般都利用同一復(fù)制系統(tǒng)，拷貝多的復(fù)制更快，結(jié)果在細(xì)菌繁殖幾代之后，細(xì)菌的子細(xì)胞中絕大多數(shù)都含有占優(yōu)勢(shì)的質(zhì)粒 。 ：注意：只有當(dāng)有確切的證據(jù)表明第二種B質(zhì)粒已經(jīng)進(jìn)入含有A質(zhì)粒的寄主細(xì)胞，而且它的DNA不受寄主細(xì)胞限制體系的降解作用，但這兩種質(zhì)粒卻不能長(zhǎng)期共存，只有在這種情況下，我們

10、才能說A和B是不親和的質(zhì)粒。 ：不親和群的概念： 彼此之間互不相容的質(zhì)粒，屬于同一不親和群(incompatibility group)。彼此能夠共存的質(zhì)粒則屬于不同的不親和群。同一不親和群的質(zhì)粒在親緣關(guān)系上則比較接近。第十七頁(yè)，共七十四頁(yè)。質(zhì)粒不親和性的分子基礎(chǔ)質(zhì)粒不親和性的分子基礎(chǔ)，主要是由于它們?cè)趶?fù)制功能之間的相互干擾造成的：*1負(fù)反饋調(diào)節(jié)環(huán)(negative feed-back loop)大多數(shù)質(zhì)粒產(chǎn)生可控制質(zhì)粒復(fù)制的阻遏蛋白質(zhì)，其數(shù)量與細(xì)胞中質(zhì)粒拷貝數(shù)成正比。在質(zhì)?？截悢?shù)少的情況下，細(xì)胞中阻遏蛋白質(zhì)亦相對(duì)降低，于是阻遏蛋白質(zhì)與質(zhì)粒DNA中靶序列相互作用，使之發(fā)生復(fù)制。隨著質(zhì)粒DNA復(fù)

11、制的結(jié)果，質(zhì)?？截悢?shù)上升，于是所編碼產(chǎn)生的阻遏蛋白質(zhì)也就隨之增多。細(xì)胞中阻遏蛋白質(zhì)濃度增多的結(jié)果，會(huì)形成二聚體，于是失去與質(zhì)粒DNA結(jié)合并促使其發(fā)生復(fù)制的能力。結(jié)果質(zhì)粒復(fù)制停止，也就是說質(zhì)?？截悢?shù)是受阻遏蛋白質(zhì)的負(fù)反饋調(diào)節(jié)：負(fù)反饋調(diào)節(jié)環(huán)(negative feed-back loop) 當(dāng)質(zhì)粒面臨高拷貝數(shù)和高濃度的阻遏蛋白時(shí)，其復(fù)制活動(dòng)便被抑制了。 當(dāng)質(zhì)粒處于低拷貝數(shù)和低濃度的阻遏蛋白時(shí)，其復(fù)制活動(dòng)更會(huì)繼續(xù)進(jìn)行。第十八頁(yè)，共七十四頁(yè)。*2.同一個(gè)細(xì)胞含兩種相容質(zhì)粒 由于這兩種相容質(zhì)粒親緣關(guān)系遠(yuǎn)，故它們所產(chǎn)生的阻遏蛋白質(zhì)就不會(huì)互相影響另一個(gè)質(zhì)粒的復(fù)制。于是這兩種相容的質(zhì)粒在同一細(xì)胞中都保持著自己

12、的正常拷貝數(shù)。*3.同一細(xì)胞含兩種不相容的質(zhì)粒 鑒于兩不相容的質(zhì)粒親緣關(guān)系密切，它們所產(chǎn)生的阻遏蛋白質(zhì)不僅影響自身質(zhì)粒DNA復(fù)制，還會(huì)彼此影響對(duì)方質(zhì)粒DNA的復(fù)制。這就出現(xiàn)了兩種阻遏蛋白質(zhì)聯(lián)合調(diào)控質(zhì)粒復(fù)制速率。 質(zhì)粒拷貝數(shù)控制體系無(wú)法辨別這兩種不相容性質(zhì)粒，只是隨機(jī)地選擇其中一種進(jìn)行復(fù)制。于是出現(xiàn)拷貝數(shù)偏差。 兩種不相容質(zhì)粒往往拷貝數(shù)不相當(dāng)，其中高拷貝數(shù)的質(zhì)粒對(duì)復(fù)制抑制劑的敏感性較低拷貝數(shù)的要差一些。因此在復(fù)制抑制劑(阻遏蛋白質(zhì))濃度低的情況下，高拷貝數(shù)質(zhì)粒仍可復(fù)制，從而最終使低拷貝質(zhì)粒被淘汰掉(稀釋掉)。第十九頁(yè)，共七十四頁(yè)。革蘭氏陰性菌的質(zhì)?？煞殖蓛纱箢悾?接合型質(zhì)粒：能在天然條件下自發(fā)地

13、從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞（接合作用），如F、Col、R質(zhì)粒等； 非接合型質(zhì)粒：不能在天然條件下獨(dú)立地發(fā)生接合作用，如Col、R的其它成員 值得注意的是，某些非接合型質(zhì)粒（ColE1）在接合型質(zhì)粒的存在和協(xié)助下，也能發(fā)生DNA轉(zhuǎn)移，這個(gè)過程由 bom 和mob 基因決定基因工程一般只能利用非接合型質(zhì)粒，保證分子操作過程中質(zhì)粒在細(xì)胞中的穩(wěn)定性。3、質(zhì)粒的可轉(zhuǎn)移性第二十頁(yè)，共七十四頁(yè)。質(zhì)粒DNA的分子構(gòu)型SC構(gòu)型：即共價(jià)閉合環(huán)形的cccDNA所呈現(xiàn)的超螺旋構(gòu)型。走在凝膠的最前面。OC構(gòu)型：即開環(huán)DNA(ocDNA)所呈現(xiàn)的構(gòu)型，其中一條DNA鏈保持完整的環(huán)形結(jié)構(gòu)，另一條鏈上則出現(xiàn)有一個(gè)至數(shù)個(gè)的缺口

14、。走在凝膠的最后方部位。L構(gòu)型：發(fā)生雙鏈斷裂形成的線性DNA分子所呈現(xiàn)的構(gòu)型，通稱L型。走在凝膠中間部位。第二十一頁(yè)，共七十四頁(yè)。第二十二頁(yè)，共七十四頁(yè)。質(zhì)粒的電泳圖譜第二十三頁(yè)，共七十四頁(yè)。（二）質(zhì)粒載體必須具備的條件（3種共同的組成部分）1、具有復(fù)制區(qū)或復(fù)制因子(replicator) 復(fù)制因子： 是指一段特定的質(zhì)粒DNA，它含有質(zhì)粒DNA的復(fù)制起點(diǎn)(ori)(origin of replication)，以及編碼質(zhì)粒DNA和質(zhì)粒復(fù)制所需要的DNA序列結(jié)構(gòu)。 *注意 復(fù)制因子(replicator)和復(fù)制子(replicon)之間在概念上的差別。復(fù)制子(replicon)：系指含有一個(gè)復(fù)制

15、起始位點(diǎn)的DNA復(fù)制單位，例如細(xì)菌染色體、病毒基因組、質(zhì)?；蚪M等，凡其DNA能夠進(jìn)行自主復(fù)制的遺傳單元均稱為復(fù)制子。*在一般的情況下，一個(gè)質(zhì)粒只含有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，構(gòu)成一個(gè)獨(dú)立的復(fù)制子。但在少數(shù)的情況下，由融合產(chǎn)生的質(zhì)粒也會(huì)含有兩個(gè)復(fù)制子，但其中只有一個(gè)有活性。第二十四頁(yè)，共七十四頁(yè)。2、具有抗菌素抗性基因 一種理想的質(zhì)粒克隆載體應(yīng)具有兩種抗菌素抗性基因，以便為寄主細(xì)胞提供易于檢測(cè)的表型性狀作為選擇記號(hào)，而且在有關(guān)的限制酶識(shí)別位點(diǎn)上插入外源DNA片段之后形成的重組質(zhì)粒，至少仍要保留一個(gè)強(qiáng)選擇記號(hào)。3、具有若干限制酶單一識(shí)別位點(diǎn) 這樣的分子結(jié)構(gòu)特性，可以滿足基因克隆的需要，而且在其中插入適當(dāng)大小

16、的外源DNA片段之后，應(yīng)不影響質(zhì)粒DNA的復(fù)制功能。第二十五頁(yè)，共七十四頁(yè)。4、具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù) 這類質(zhì)粒的優(yōu)點(diǎn)在于： a.低分子量質(zhì)粒易于操作，克隆了外源DNA片段之后(一般不超過15Kb)仍可有效地轉(zhuǎn)化給受體細(xì)胞； b.含有較高的拷貝數(shù)有利于質(zhì)粒DNA的制備，增加克隆DNA片段(基因)的產(chǎn)量； c.低分子量的質(zhì)粒分子中對(duì)某種限制酶具多重識(shí)別位點(diǎn)的機(jī)率也就相應(yīng)下降；第二十六頁(yè)，共七十四頁(yè)。質(zhì)粒的遺傳標(biāo)記基因1、 標(biāo)記基因的作用 1）指示外源DNA分子（載體或重組分子）是否進(jìn)入宿主細(xì)胞 這種指示可以是選擇性的（Ampr ，Tetr ，Kanr），也可以是非選擇性的（如lacZ）

17、2）指示外源DNA分子是否插入載體分子形成了重組子。 * 這種指示也可以是選擇性的（如TcS），也可以是非選擇性的（如TcS， lacZ），絕大多數(shù)為后者。 *有的遺傳標(biāo)記基因可以完成上述兩項(xiàng)作用。當(dāng)充任第一作用時(shí)，最好是選擇性標(biāo)記基因；當(dāng)完成第二作用時(shí)，目前多采用非選擇性的檢測(cè)性標(biāo)記基因。有的基因是不能用作選擇性標(biāo)記基因（lacZ等）。第二十七頁(yè)，共七十四頁(yè)。2、標(biāo)記基因的種類 1）抗性標(biāo)記基因（可直接用于選擇轉(zhuǎn)化子） 主要是抗生素抗性基因: Ampr ，Tetr ，Cmlr，Kanr，Strr 2）生化標(biāo)記基因 其表達(dá)產(chǎn)物可催化某些易檢測(cè)的生化反應(yīng)，如lacZ第二十八頁(yè)，共七十四頁(yè)。3、常

18、用的遺傳標(biāo)記基因及其作用機(jī)制1) 四環(huán)素抗性基因（ Tetr or Tcr） Tetracycline 可結(jié)合在核糖體30s亞基中的一種蛋白質(zhì)分子上，抑制核糖體的轉(zhuǎn)位過程。四環(huán)素抗性基因編碼一種399 AAs的蛋白質(zhì)，與細(xì)菌細(xì)胞膜結(jié)合，阻止四環(huán)素分子進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞。2) 氨芐青霉素抗性基因（ Ampr or Apr） Ampicillin可抑制細(xì)菌細(xì)胞膜上參與細(xì)胞壁合成酶類的活性。Apr抗性基因編碼一種分泌到細(xì)菌細(xì)胞周間質(zhì)的酶，可特異性地切割氨芐青霉素的內(nèi)酰胺環(huán)，使氨芐青霉素失活。第二十九頁(yè)，共七十四頁(yè)。3) 氯霉素抗性基因（ Cmlr or Cmr） Chlorophenicol可結(jié)合在核糖體

19、50 S亞基上，阻止蛋白質(zhì)合成。Cmr基因編碼氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶，使氯霉素乙酰化導(dǎo)致乙?；穆让顾夭荒芙Y(jié)合在核糖體上。4) 卡那霉素(Kanr), 新霉素(Neor)和G418抗性(G418r)基因 Kanamycin，Neomycin和G418均屬脫氧鏈霉胺氨基葡萄糖苷類抗生素，可結(jié)合在核糖體上阻止蛋白質(zhì)的合成。Kanr等抗性基因均可使這類抗生素磷酸化，使之不能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。第三十頁(yè)，共七十四頁(yè)。5）半乳糖苷酶基因（lacZ 和lacZ） 半乳糖苷酶基因有1021 AAs，基因產(chǎn)物裝配為四聚體后才有酶活。該蛋白質(zhì)可分為兩部分：鏈和鏈。前者負(fù)責(zé)四聚體裝配，后者具半乳糖苷酶活性；只有當(dāng)兩者都存在時(shí)，

20、才會(huì)表現(xiàn)出酶活性，該作用稱之為-互補(bǔ)作用。這兩個(gè)部分可獨(dú)立存在， 分別由兩個(gè)基因編碼。為鏈編碼的基因稱之為lacZ(編碼145 AAs)。這兩個(gè)基因（LacZ和LacZ）均可作為標(biāo)記基因。 lacZ（lacZ）中含有多克隆位點(diǎn)，當(dāng)無(wú)外源DNA片段插入時(shí)，質(zhì)粒表達(dá)半乳糖苷酶的-肽，與缺失突變體宿主菌（不能編碼-肽）表達(dá)的lacZ基因產(chǎn)物（ 鏈）互補(bǔ)，產(chǎn)生有活性的半乳糖苷酶，在含有指示劑X-gal和誘導(dǎo)劑IPTG的存在下，菌落呈現(xiàn)蘭色；外源基因插入后，破壞了lacZ -肽基因的結(jié)構(gòu)，細(xì)菌內(nèi)不能產(chǎn)生半乳糖苷酶活性，菌落呈白色。第三十一頁(yè)，共七十四頁(yè)。半乳糖苷酶基因的優(yōu)點(diǎn): a.酶催化X-Gal水解為

21、蘭色產(chǎn)物，檢測(cè)直觀 b. lacZ編碼的5-端可允許很大的變化（如加入多克隆位點(diǎn)）而不影響酶活性 c. lacZ和鏈基因的分別表達(dá)可使載體小而容量大注：X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-半乳糖苷） IPTG（異丙基硫代-D-半乳糖苷）第三十二頁(yè)，共七十四頁(yè)。 P LacZ LacZ 轉(zhuǎn)錄 翻譯 LacZ基因的結(jié)構(gòu)與產(chǎn)物pUC18 BamHI片段重組DNA分子 轉(zhuǎn)化 E.coli外源 DNA BamHI片段 涂布在含X-Gal和Amp的平板上,白色菌落為重組子，蘭色菌落為原載體利用LacZ基因篩選重組子第三十三頁(yè)，共七十四頁(yè)。質(zhì)粒的選擇性標(biāo)記第三十四頁(yè)，共七十四頁(yè)。（三）質(zhì)粒的分類1、根據(jù)質(zhì)

22、?；蚓幋a的特性分五大類：A、致育質(zhì)粒（fertility plasmid)/F-質(zhì)粒：只含有轉(zhuǎn)移基因（tra-)，除了促進(jìn)接合轉(zhuǎn)移外沒有其他功能。B、抗性質(zhì)粒（resistance plasmid)/R質(zhì)粒：含有氯霉素、青霉素或水銀抗性基因。如RP4質(zhì)粒，發(fā)現(xiàn)于假單胞桿菌。C、Col質(zhì)粒（col-plasmid)：編碼大腸桿菌毒素（colicine)，可以殺死其他細(xì)菌，如存在于E.coli中的CoE1質(zhì)粒。第三十五頁(yè)，共七十四頁(yè)。D、降解質(zhì)粒（Degradative plasmids)：可以降解特殊的分子，如：甲苯、水楊酸。E、致瘤質(zhì)粒（Virulence plasmids)或叫烈性質(zhì)粒：可

23、以使宿主細(xì)菌變成病原體，如根癌農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒。第三十六頁(yè)，共七十四頁(yè)。2、人工構(gòu)建的質(zhì)粒據(jù)功能及用途可分為六大類：A、多拷貝質(zhì)粒：復(fù)制子經(jīng)過人工突變，除去控制拷貝數(shù)的負(fù)調(diào)節(jié)基因，使質(zhì)?？截悢?shù)達(dá)到每個(gè)細(xì)胞數(shù)千，用于擴(kuò)增外源基因。B、測(cè)序質(zhì)粒：C、整合質(zhì)粒：裝有整合促進(jìn)基因及整合特異序列，便于外源基因準(zhǔn)確重組整合入受體細(xì)胞的染色體上。D、穿梭質(zhì)粒：含有兩個(gè)不同的復(fù)制子，能在兩種不同的受體細(xì)胞中復(fù)制。E、表達(dá)質(zhì)粒：裝有強(qiáng)的啟動(dòng)基因，合適的順序以及有效的終止子，以便任何外源基因在受體細(xì)胞內(nèi)的高效表達(dá)。F、探針質(zhì)粒：篩選克隆或?qū)ふ一蛟?，通常裝有一個(gè)可定量測(cè)定其表達(dá)的標(biāo)記基因，如抗性基因。篩選啟動(dòng)子

24、、終止子等。第三十七頁(yè)，共七十四頁(yè)。（四）實(shí)驗(yàn)室常用質(zhì)粒舉例1、pBR322：該質(zhì)粒的優(yōu)點(diǎn)：1）分子大小4363bp，比較小、容易純化。2）含有2個(gè)抗生素抗性基因,ampR和tetR,可以作為選擇標(biāo)記。3）受體細(xì)胞內(nèi)，pBR322以多拷貝存在，一般一個(gè)細(xì)胞內(nèi)可達(dá)到15個(gè)，而在蛋白質(zhì)合成抑制劑存在下，可達(dá)到1000-3000拷貝，如氯霉素?？梢援a(chǎn)生大量的重組pBR322分子。第三十八頁(yè)，共七十四頁(yè)。pBR332質(zhì)粒第三十九頁(yè)，共七十四頁(yè)。第四十頁(yè)，共七十四頁(yè)。第四十一頁(yè)，共七十四頁(yè)。第四十二頁(yè)，共七十四頁(yè)。2、pBR325、pBR327： 它們都是在pBR322 基礎(chǔ)上去掉1000bp左右的片段

25、，留下了ampR和tetR的完整片段，但改變了質(zhì)粒復(fù)制和接合能力。第四十三頁(yè)，共七十四頁(yè)。第四十四頁(yè)，共七十四頁(yè)。第四十五頁(yè)，共七十四頁(yè)。3、pUC質(zhì)粒：也來(lái)自于pBR322，pUC18和pUC19是最常用的質(zhì)粒載體，幾乎未含多余的DNA片段。優(yōu)點(diǎn)：ColE1復(fù)制起點(diǎn)，松弛性，高拷貝，Rop基因（控制拷貝數(shù)的基因）突變，松弛性更強(qiáng)。Amp(R)MCS（單一的多種常用內(nèi)切酶位點(diǎn)）互補(bǔ)（在MCS中插入外源片段后，可通過互補(bǔ)作用形成的藍(lán)色和白色菌落篩選重組質(zhì)粒）小分子質(zhì)粒（小于3000bp)第四十六頁(yè)，共七十四頁(yè)。拷貝數(shù)：500-2000裝有多克隆位點(diǎn)（MCS）正選擇顏色標(biāo)記 lacZ用于基因克隆和

26、測(cè)序重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體：pUC18/pUC19第四十七頁(yè)，共七十四頁(yè)。第四十八頁(yè)，共七十四頁(yè)。4、pGEM3Z： pGEM3Z與pUC載體非常相似，不同的是pGEM3Z含有兩段額外的短的DNA片段，每一段可以作為RNA聚合酶的識(shí)別位點(diǎn)。第四十九頁(yè)，共七十四頁(yè)。第五十頁(yè)，共七十四頁(yè)。第五十一頁(yè)，共七十四頁(yè)。5、多功能質(zhì)粒載體：pBluescript KS() 或SK( )第五十二頁(yè)，共七十四頁(yè)。6、植物基因工程常用的幾個(gè)載體（煙大）(1)pCAMBIA1391Lenth:10657bp卡那霉素抗性潮霉素抗性gusA第五十三頁(yè)，共七十四頁(yè)。(2)pCAMBIA1300Lenth:8958bp卡

27、那霉素和潮霉素抗性第五十四頁(yè)，共七十四頁(yè)。（3）-1在pCAMBIA1300基礎(chǔ)上改造的用于研究?jī)蓚€(gè)蛋白之間相互關(guān)系并能通過瞬時(shí)表達(dá)綠色熒光蛋白的載體第五十五頁(yè)，共七十四頁(yè)。（3）-2改造的1300載體第五十六頁(yè)，共七十四頁(yè)。（3）-3改造的1300載體第五十七頁(yè)，共七十四頁(yè)。（4）用于研究RNAi的載體pFGC1008Length:10914bp第五十八頁(yè)，共七十四頁(yè)。第五十九頁(yè)，共七十四頁(yè)。質(zhì)粒載體的優(yōu)缺點(diǎn)簡(jiǎn)便易操作質(zhì)粒穩(wěn)定質(zhì)粒文庫(kù)不穩(wěn)定質(zhì)粒容載外源DNA的長(zhǎng)度有限質(zhì)粒文庫(kù)放大不均衡第六十頁(yè)，共七十四頁(yè)。三、細(xì)菌噬菌體載體細(xì)菌噬菌體簡(jiǎn)稱噬菌體，它是專性侵染細(xì)菌的病毒。能高效率高特異性地侵染

28、宿主細(xì)胞，然后或自主復(fù)制繁殖，或整合入宿主基因組中潛伏起來(lái)，而且在一定的條件下上述兩種狀態(tài)還會(huì)相互轉(zhuǎn)化。 高效率的感染性能使外源基因高效導(dǎo)入受體細(xì)胞， 自主復(fù)制繁殖性能使外源基因在受體細(xì)胞中高效擴(kuò)增噬菌體結(jié)構(gòu)非常簡(jiǎn)單，一般由蛋白質(zhì)外殼和內(nèi)部DNA分子組成。 兩種主要的噬菌體結(jié)構(gòu)類型是： 1）頭尾結(jié)構(gòu)（噬菌體載體） 2）絲狀結(jié)構(gòu)（M13單鏈絲狀噬菌體）。第六十一頁(yè)，共七十四頁(yè)。（一） 噬菌體載體（lambda phage vector)1、 噬菌體的生物學(xué)特性2、 噬菌體的感染周期3、 噬菌體的溶源狀態(tài)第六十二頁(yè)，共七十四頁(yè)。大腸桿菌的 噬菌體DNA1、 噬菌體的生物學(xué)特性：噬菌體是大腸桿菌的溫

29、和型噬菌體， -DNA全長(zhǎng)48502個(gè)核苷酸， -DNA上至少有61個(gè)基因第六十三頁(yè)，共七十四頁(yè)。5TCCAGCGGCGGGG33CCCGCCGCTGGA 5 粘性末端（COS 位點(diǎn)）COScos頭部合成基因尾部合成基因溶菌控制基因晚期控制基因DNA合成控制基因阻遏基因早期控制基因阻遏基因重組基因刪除與整合基因l - DNA第六十四頁(yè)，共七十四頁(yè)。2、 噬菌體感染周期E.coli吸附LamB受體注入復(fù)制包裝裂解第六十五頁(yè)，共七十四頁(yè)。噬菌體的侵染循環(huán)第六十六頁(yè)，共七十四頁(yè)。3、 噬菌體的溶源狀態(tài) 噬菌體感染野生型大腸桿菌后，只有一部分細(xì)胞進(jìn)入裂解循環(huán)。大多數(shù)感染的大腸桿菌裂解受挫，噬菌體DNA直接整合到宿主細(xì)胞的染色體DNA上，并不裂解細(xì)菌，