干細(xì)胞的體外培養(yǎng)

1、關(guān)于干細(xì)胞的體外培養(yǎng)第1頁，共74頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)35分，星期三一、干細(xì)胞的概念干細(xì)胞(stem cells, SC)是一類具有自我復(fù)制能力(self-renewing)的多潛能細(xì)胞，在一定條件下，它可以分化成多種功能細(xì)胞。干細(xì)胞是一種未充分分化，尚不成熟的細(xì)胞，具有再生各種組織器官和人體的潛在功能，醫(yī)學(xué)界稱之為“萬用細(xì)胞”。 第2頁，共74頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)35分，星期三干細(xì)胞幾個(gè)主要特征具有自我更新能力與自我維持能力，可以無限增殖分裂。干細(xì)胞一旦形成，在機(jī)體內(nèi)終生都具有自我更新能力，以維持自身數(shù)目的恒定。既具有生理性的更新能力，也具有對損傷或疾病導(dǎo)致的反應(yīng)

2、有修復(fù)能力，如骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞等。 干細(xì)胞維持自穩(wěn)性的機(jī)制：對稱分裂和不對稱分裂第3頁，共74頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)35分，星期三 4 干細(xì)胞的對稱分裂和不對稱分裂對稱分裂 （symmetry division）不對稱分裂 （asymmetry division）干細(xì)胞 分 化 細(xì) 胞 干細(xì)胞 分化細(xì)胞第4頁，共74頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)35分，星期三干細(xì)胞幾個(gè)主要特征干細(xì)胞本身不是終末分化細(xì)胞；具有多向分化的能力（多能性或全能性），即可以分化發(fā)育成各種胚層組織的細(xì)胞（ES細(xì)胞），或可以分化成為本系統(tǒng)各譜系的細(xì)胞（特定組織干細(xì)胞，如造血干細(xì)胞）。第5頁，共74頁，202

3、2年，5月20日，13點(diǎn)35分，星期三干細(xì)胞幾個(gè)主要特征干細(xì)胞的自我更新與分化需要特定的微環(huán)境，也就是說干細(xì)胞往哪一種方向分化，必須在該細(xì)胞生存的特定微環(huán)境前提下進(jìn)行分化。已有諸多的實(shí)驗(yàn)表明，如將ES細(xì)胞種植入小鼠大腦內(nèi)，這些干細(xì)胞將向神經(jīng)系統(tǒng)分化。在不同生長因子刺激下干細(xì)胞可表現(xiàn)出不同分化潛能第6頁，共74頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)35分，星期三干細(xì)胞幾個(gè)主要特征干細(xì)胞分裂產(chǎn)生的子細(xì)胞只能有兩種命運(yùn)保持為干細(xì)胞或分化為特定細(xì)胞。第7頁，共74頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)35分，星期三二、干細(xì)胞的分類1、按分化潛能大小來分類:全能干細(xì)胞（ Totipotent stem cell

4、 ）：能分化成所有組織和器官的干細(xì)胞，它具有形成完整個(gè)體的分化潛能。如受精卵，胚胎干細(xì)胞。多能干細(xì)胞（ pluripotent stem cell ），具有分化出多種組 織細(xì)胞的潛能，但卻失去了發(fā)育成完整個(gè)體的能力，發(fā)育 潛能受到一定的限制。如骨髓多能造血干細(xì)胞是典型的例 子，它可分化出至少十二種血細(xì)胞 。專能干細(xì)胞（ unipotent stem cell ），這類干細(xì)胞只能向 一種類型或密切相關(guān)的兩種類型的細(xì)胞分化，如上皮組織 基底層干細(xì)胞、肌肉中的成肌細(xì)胞等。第8頁，共74頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)35分，星期三2、根據(jù)來源來分: 來源于胚胎- 胚胎干細(xì)胞 ESC （Embryo

5、nic Stem Cell ） 胚胎性生殖細(xì)胞 EGC （Embryonic Germ Cell ） 來源于成體組織- 成體干細(xì)胞 ASC （Adult-derived Stem Cell ）第9頁，共74頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)35分，星期三胚胎干細(xì)胞指從著床前的胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（桑椹胚）或原始生殖細(xì)胞獲得的一種具有多潛能性、可發(fā)育成為各種細(xì)胞、同時(shí)可保持不分化狀態(tài)而持續(xù)生長的克隆細(xì)胞系。它可以無限增殖并分化成為全身200多種細(xì)胞類型，進(jìn)一步形成機(jī)體的所有組織、器官。為全能干細(xì)胞。 第10頁，共74頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)35分，星期三成體干細(xì)胞是成體組織內(nèi)具有自我更新及分化

6、一種或一種以上子細(xì)胞的未成熟細(xì)胞。來源于成年組織或器官，一般具有組織特異性，只能分化成特定的細(xì)胞或組織。為多能干細(xì)胞或單能干細(xì)胞，如造血干細(xì)胞和上皮干細(xì)胞等。 第11頁，共74頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)35分，星期三3、根據(jù)干細(xì)胞組織發(fā)生的名稱進(jìn)行分類:胎胎干細(xì)胞造血干細(xì)胞骨髓間質(zhì)干細(xì)胞肌肉干細(xì)胞成骨干細(xì)胞內(nèi)胚層干細(xì)胞視網(wǎng)膜干細(xì)胞胰腺干細(xì)胞第12頁，共74頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)35分，星期三三、干細(xì)胞研究的歷史情況 1959年，美國首次報(bào)道了通過體外受精（IVF）動物。 60年代，幾個(gè)近親種系的小鼠睪丸畸胎瘤的研究表明其來源于胚胎生殖細(xì)胞（embryonic germ ce

7、lls, EG細(xì)胞）,此工作確立了胚胎癌細(xì)胞（embryonic carcinoma cells, EC細(xì)胞）是一種干細(xì)胞。 1968年，Edwards 和Bavister 在體外獲得了第一個(gè)人卵子。 70年代，EC細(xì)胞注入小鼠胚泡產(chǎn)生雜合小鼠。培養(yǎng)的EC細(xì)胞作為胚胎發(fā)育的模型，雖然其染色體的數(shù)目屬于異常。1978年，第一個(gè)試管嬰兒在英國誕生。 第13頁，共74頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)35分，星期三1981年，從小鼠胚泡內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分離出小鼠ES細(xì)胞，并建立了小鼠ES細(xì)胞體外培養(yǎng)條件。將ES細(xì)胞注入小鼠，能誘導(dǎo)形成畸胎瘤。 1984-1988年，Anderews 等人從人睪丸畸胎瘤細(xì)胞系

8、Tera-2中產(chǎn)生出多能的、可鑒定的（克隆化的）細(xì)胞，稱之為胚胎癌細(xì)胞（embryonic carcinoma cells, EC細(xì)胞）?？寺〉娜薊C細(xì)胞在視黃酸的作用下分化形成神經(jīng)元樣細(xì)胞和其他類型的細(xì)胞。 1989年，Pera 等分離了一個(gè)人EC細(xì)胞系，此細(xì)胞系能產(chǎn)生出三個(gè)胚層的組織。這些細(xì)胞是非整倍體的（比正常細(xì)胞染色體多或少），他們在體外的分化潛能是有限的。 第14頁，共74頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)35分，星期三1998年美國有兩個(gè)小組分別培養(yǎng)出了人的多能干細(xì)胞： James A. Thomson在 Wisconsin大學(xué)領(lǐng)導(dǎo)的研究小組的方法是：人卵體外受精后，將胚胎培育到囊

9、胚階段，提取 inner cell mass細(xì)胞，建立細(xì)胞株。 John D. Gearhart在 Johns Hopkins大學(xué)領(lǐng)導(dǎo)的另一個(gè)研究小組的方法是：從受精后59周人工流產(chǎn)的胚胎中提取生殖母細(xì)胞( primordial germ cell )，建立細(xì)胞株。1999年12月，美國科學(xué)家在美國科學(xué)院院刊報(bào)告說，小鼠肌肉組織的成體干細(xì)胞可以“橫向分化”為血液細(xì)胞。隨后，世界各國的科學(xué)家相繼證實(shí)，成體干細(xì)胞，包括人類的成體干細(xì)胞具有可塑性。1999年12月，干細(xì)胞研究進(jìn)展被科學(xué)雜志評選為該年度世界十大科學(xué)進(jìn)展之首。2007年日本的Yamanaka研究小組和美國的James Thomson 研

10、究小組分別獲得誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞 （induced pluripotent stem cell，iPS細(xì)胞）。 第15頁，共74頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)35分，星期三至今已分離得到的胚胎干細(xì)胞物種有：小鼠的胚胎干細(xì)胞（1981）金黃地鼠（1988）、貂（1993）、豬（1994，1997）、雞（1996）、恒河猴（1995）、絨猴（1996）。分離得到人的胚胎干細(xì)胞（1998），胚胎生殖細(xì)胞（1998），目前不斷報(bào)道成年組織來源的的干細(xì)胞。第16頁，共74頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)35分，星期三四、胚胎干細(xì)胞的體外培養(yǎng)（一）技術(shù)原理基本原則：促進(jìn)ES增殖的同時(shí)，維持其未分化的二

11、倍體狀態(tài)。有飼養(yǎng)層（feeder layer）培養(yǎng)法：以小鼠成纖維細(xì)胞耐硫代鳥嘌呤和耐烏苯苷亞系（STO）或小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（ Mouse Embryo Firbroblasts, MEF）制備飼養(yǎng)細(xì)胞單層，主要是利用其分泌的生長因子FGF和抑制干細(xì)胞分化因子白血病抑制因子（LIF）共同作用，保持干細(xì)胞在體外克隆而不分化。無飼養(yǎng)層培養(yǎng)法：利用各種能分泌抑制分化因子的細(xì)胞制備條件培養(yǎng)基或在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入重組的LIF制備條件培養(yǎng)基。第17頁，共74頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)35分，星期三（二）基本過程飼養(yǎng)層細(xì)胞制備或條件培養(yǎng)基制備胚胎的制備和培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞的分離胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)胚胎干細(xì)

12、胞的鑒定凍存與復(fù)蘇細(xì)胞克隆形態(tài)堿性磷酸酶檢測核型的鑒定分化能力的觀察嵌合能力的測定第18頁，共74頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)35分，星期三1、飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（ MEF）：取孕12.5-14.5 d鼠胚胎軀干，以植塊培養(yǎng)法或分散細(xì)胞培養(yǎng)法制備，取第三代至第五代細(xì)胞作為飼養(yǎng)層細(xì)胞。STO細(xì)胞：按照一般已建細(xì)胞系培養(yǎng)方法。DMEM加10%小牛血清作為培養(yǎng)液。采用胎數(shù)多小鼠一次大量培養(yǎng)MEF凍存，用時(shí)復(fù)蘇。第19頁，共74頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)35分，星期三 MEF和STO的優(yōu)缺點(diǎn)：MEF分泌促進(jìn)胚胎干細(xì)胞增殖和抑制分化因子的能力比STO強(qiáng)，STO作飼養(yǎng)細(xì)胞時(shí)常需

13、在培養(yǎng)基中加入LIF。MEF不能長期傳代，需經(jīng)常準(zhǔn)備懷孕小鼠制備第三代至第五代細(xì)胞，STO則可長期傳代培養(yǎng)。MEF不具耐藥性，不能作為轉(zhuǎn)染外源性基因的胚胎干細(xì)胞篩選用。SNL細(xì)胞為轉(zhuǎn)染了neor抗性基因和LIF基因的STO細(xì)胞，可分泌足夠的抑制分化因子，并因帶有neor抗性基因可用于轉(zhuǎn)基因胚胎干細(xì)胞篩選。胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)過程中，死亡MEF或STO的染色體可能導(dǎo)致胚胎干細(xì)胞的突變及影響正常核型的保持。不易獲得純的胚胎干細(xì)胞作為生化和分子生物學(xué)方面的分析。使用前如用絲裂霉素C處理，如清洗不徹底，殘余的絲裂霉素C會影響胚胎干細(xì)胞的增殖。第20頁，共74頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)35分，星期三報(bào)

14、道的人源性滋養(yǎng)層細(xì)胞：人骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞胎兒肌肉或胎兒皮膚細(xì)胞新生兒包皮成纖維細(xì)胞成人子宮內(nèi)膜細(xì)胞人胎盤成纖維細(xì)胞人胚胎干細(xì)胞經(jīng)體內(nèi)分化獲取的間充質(zhì)干細(xì)胞第21頁，共74頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)35分，星期三2、飼養(yǎng)單層制備MEF或STO連成一片，以含10g/ml絲裂霉素培養(yǎng)液370C作用2-3 h（如細(xì)胞層較薄，也可縮短至30min-1.5h），或射線照射（劑量為30-100Gy）。棄含絲裂霉素培養(yǎng)液，PBS洗5次， 射線處理者不用清洗。消化細(xì)胞，制備懸液種植至用0.1%明膠處理過（0.1%明膠水溶液覆蓋培養(yǎng)瓶表面，室溫2h以上）的培養(yǎng)瓶，種植細(xì)胞數(shù)：MEF7.5104-10

15、5個(gè)/cm2，STO為5104個(gè)/cm2。培養(yǎng)至細(xì)胞連成一片沒有間隙（中間可補(bǔ)加處理過的細(xì)胞），制備好的飼養(yǎng)單層置培養(yǎng)箱，5天內(nèi)使用，使用前換成干細(xì)胞培養(yǎng)液。第22頁，共74頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)35分，星期三觀察：好的飼養(yǎng)單層，細(xì)胞連成一片，無間隙，死亡細(xì)胞和雜細(xì)胞極少。MEF和STO產(chǎn)生的抑制分化因子一部分分泌到培養(yǎng)液中，一部分錨定在細(xì)胞外基質(zhì)上。無間隙的飼養(yǎng)單層保證了胚胎干細(xì)胞都能與飼養(yǎng)層細(xì)胞接觸而達(dá)到最佳效果。第23頁，共74頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)35分，星期三3、用于培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基直接在胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液中加入重組的LIF，使終濃度為1000U/ml

16、。Baffalo大鼠肝細(xì)胞株BRL條件培養(yǎng)基（BRL-CM):能分泌抑制畸胎癌（瘤）和胚胎干細(xì)胞分化的因子DIF。收集培養(yǎng)72h的培養(yǎng)液，過濾除菌，用前6-7份+3-4份胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液，再添加8-10%胎牛血清。年齡 2-3周大鼠心肌細(xì)胞條件培養(yǎng)基（RH-CM）：分泌抑制胚胎干細(xì)胞分化因子。收集1-6代細(xì)胞培養(yǎng)液，過濾除菌，用前6份+3份胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液+1份胎牛血清。第24頁，共74頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)35分，星期三4、胚胎干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)（1）培養(yǎng)液配制培養(yǎng)液要用超純水或五蒸水，不能有細(xì)菌內(nèi)毒素污染，水要現(xiàn)用現(xiàn)制。高糖DMEM作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，葡萄糖濃度為（4.5g/L）：

17、有助于囊胚貼壁、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)增殖及胚胎干細(xì)胞集落形成。使用前還要添加-巰基乙醇（0.1mmol/L）或單硫甘油（ 0.15mmol/L）：保護(hù)細(xì)胞內(nèi)酶和蛋白質(zhì)中的巰基不被氧化，促進(jìn)胚胎干細(xì)胞的貼壁和克隆形成。使用前要添加15%胎牛血清：必不可少，但也有缺點(diǎn)。第25頁，共74頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)35分，星期三血清缺點(diǎn)：成分復(fù)雜，不利于整合到胚胎干細(xì)胞基因組中外源性基因功能的測定；可能含有一些未知的促進(jìn)胚胎干細(xì)胞分化的因子；含有微量的血紅蛋白和內(nèi)毒素，干擾胚胎干細(xì)胞生長。無血清胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液無上述缺點(diǎn)，但細(xì)胞貼附力不如有血清培養(yǎng)基。第26頁，共74頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)35

18、分，星期三（2）胚胎干細(xì)胞的分離小鼠：母小鼠超數(shù)排卵交配（注射孕馬血清促性腺激素和人絨毛膜促性腺激素）胚胎采集：取孕3.5d（囊胚期或桑椹期）的母小鼠取胚胎胚胎培養(yǎng)：培養(yǎng)皿內(nèi)制備直徑0.5cm左右露滴狀培養(yǎng)液液滴，并覆蓋透明石蠟油，胚胎置于液滴中培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞分離：普通分離法、免疫外科法，棄除滋胚層細(xì)胞，獲得內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（inner cell mass，ICM），并分散為3-4個(gè)細(xì)胞在一起的細(xì)胞團(tuán)第27頁，共74頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)35分，星期三人胚胎干細(xì)胞來源 a.自終止妊娠（5-9周人工流產(chǎn)）的胎兒中提取生殖母細(xì)胞( primordial germ cell )。 28 Gear

19、hart法第28頁，共74頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)35分，星期三29 b.取自體外受精胚胎囊胚期內(nèi)層細(xì)胞。用這種方法，每個(gè)胚胎可取得1520個(gè)細(xì)胞用于培養(yǎng)。 Thomson法第29頁，共74頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)35分，星期三c.通過體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移技術(shù)（SCNT技術(shù)）獲取30 第30頁，共74頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)35分，星期三其它干細(xì)胞的分離與純化 干細(xì)胞表面有許多特殊的標(biāo)記，以造血系統(tǒng)為例，干細(xì)胞的表面標(biāo)志有Sca-1和c-kit等。另外各種成體干細(xì)胞還有各自獨(dú)特的標(biāo)記物，如人造血干細(xì)胞表現(xiàn)為CD34+和Thy10+而CD10，CD14，CD15，CD16，

20、CD19，CD20皆為陰性另外干細(xì)胞還有不同于一般分化細(xì)胞的物理特性，比如干細(xì)胞不被染料Hoechst33324和Rhodamine123染色。利用這些特性及表面標(biāo)志，采用熒光細(xì)胞分離器從單細(xì)胞懸液中即可分離純化干細(xì)胞。 第31頁，共74頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)35分，星期三（3）胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)有飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)：將內(nèi)細(xì)胞團(tuán)吸置處理過的飼養(yǎng)層上，一個(gè)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)放置一個(gè)孔，370C、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)2d后出現(xiàn)小集落，并逐步增大，6-10d可消化傳代，消化時(shí)，消化30s后棄消化液，殘余消化液繼續(xù)作用，當(dāng)飼養(yǎng)單層出現(xiàn)裂隙（或顯微鏡下細(xì)胞之間分開），終止消化，一般為2-3min加適量培養(yǎng)

21、液，輕輕吹打成單細(xì)胞懸液，接種新飼養(yǎng)層擴(kuò)大培養(yǎng)。無飼養(yǎng)層培養(yǎng)：明膠包被培養(yǎng)板，條件培養(yǎng)基。已建系胚胎干細(xì)胞：將已培養(yǎng)2-3d生長旺盛干細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液，添加新的培養(yǎng)液，按照1：3或1：6比例轉(zhuǎn)鐘。第32頁，共74頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)35分，星期三注意事項(xiàng)：最初分離的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)以3-4個(gè)細(xì)胞團(tuán)為宜，但集落形成后，傳代過程中一定要消化成單細(xì)胞，否則胚胎干細(xì)胞會互相誘導(dǎo)，易于分化。培養(yǎng)條件要始終如一。為了增強(qiáng)胚胎干細(xì)胞粘附力，除明膠包被外，還可以用纖維連接蛋白和多聚賴氨酸等促進(jìn)粘附。第33頁，共74頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)35分，星期三（4）培養(yǎng)結(jié)果hES細(xì)胞集落（10）胚

22、胎干細(xì)胞呈集落狀（島嶼狀）生長，邊緣整齊，表面平滑，結(jié)構(gòu)致密，隆起生長，細(xì)胞之間界限不清。消化成單細(xì)胞后細(xì)胞小而圓，核大，胞漿小。第34頁，共74頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)35分，星期三A phase contrast image of the pluripotent murine embryonic germ cell第35頁，共74頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)35分，星期三A culture dish containing hundreds of colonies of murine embryonic germ cells. Each red-stained spot re

23、presents an individual colony comprised of hundreds or thousands of stem cells.第36頁，共74頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)35分，星期三5、胚胎干細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇凍存液：胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液+10%-15%DMSO。凍存細(xì)胞密度：106-107個(gè)/ml凍存與復(fù)蘇方法同普通細(xì)胞。LIF條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞，仍然用不含LIF的胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液凍存。第37頁，共74頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)35分，星期三（三）胚胎干細(xì)胞的鑒定1、 ES細(xì)胞生物學(xué)特性（1）ES細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)及核型ES細(xì)胞具有與早期胚胎細(xì)胞相似的形

24、態(tài)結(jié)構(gòu)，胞體體積小，核大，有一個(gè)或幾個(gè)核仁。細(xì)胞中多為常染色質(zhì)，胞質(zhì)結(jié)構(gòu)簡單，散布著大量核糖體和線粒體，核型正常，保留了二倍體性質(zhì)。正常ES細(xì)胞染色體正常，如發(fā)生異常則其很難發(fā)育分化形成動物個(gè)體。 第38頁，共74頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)35分，星期三（2）ES細(xì)胞生長特性ES細(xì)胞在體外分化抑制培養(yǎng)中，呈克隆狀生長，細(xì)胞緊密地聚集在一起，形似鳥巢，細(xì)胞界限不清，克隆周圍有時(shí)可見單個(gè)ES細(xì)胞和分化的扁平狀上皮細(xì)胞。 ES細(xì)胞增殖迅速，每1824 h分裂增殖 1次。此外，其還可以在體外進(jìn)行選擇、操作、凍存。凍存的細(xì)胞可在需要時(shí)隨時(shí)解凍，繼續(xù)培養(yǎng)不失其原有特性，并且來自一個(gè)克隆的細(xì)胞具有同

25、樣的特征。第39頁，共74頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)35分，星期三40 人胚胎干細(xì)胞(hES)的特點(diǎn) 形態(tài)：圓形或橢圓，體積較小，核質(zhì)比較大，體外抑制分化培養(yǎng)時(shí)呈鳥巢狀，集落生長并緊密堆積，細(xì)胞界限不明顯。第40頁，共74頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)35分，星期三 （3）ES細(xì)胞的高度分化潛能 ES細(xì)胞在體外需在飼養(yǎng)層細(xì)胞上培養(yǎng)才能維持其未分 化狀態(tài)，一旦脫離飼養(yǎng)層就自發(fā)地進(jìn)行分化。在單層培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞自發(fā)分化成多種細(xì)胞， 懸浮培養(yǎng)中： “簡單類胚體” “囊狀胚體” 細(xì)胞分化物。ES細(xì)胞可進(jìn)行誘導(dǎo)分化 *用RA（維生素A酸或視黃酸）作誘導(dǎo)90以上的ES細(xì)胞 分化為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞， *聚

26、集培養(yǎng)的ES細(xì)胞誘導(dǎo)分化則可分化為有節(jié)律性收縮 的心肌細(xì)胞。 *將ES細(xì)胞注射到同源動物皮下，可形成組織瘤，其細(xì)胞 組成可代表3個(gè)胚層細(xì)胞。 *用ES細(xì)胞作核供體進(jìn)行細(xì)胞核移植，可以得到可發(fā)育重 構(gòu)胚和動物個(gè)體。第41頁，共74頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)35分，星期三 （4）堿性磷酸酶的表達(dá) 許多資料表明，小鼠、大鼠的桑椹胚細(xì)胞和囊胚細(xì)胞均有堿性磷酸酶（AKP）表達(dá)，小鼠的EC細(xì)胞和ES細(xì)胞中均含有豐富的AKP。而在已分化的EC細(xì)胞和ES細(xì)胞中AKP呈弱陽性或陰性。豬、兔的桑椹胚和早期囊胚AKP呈陽性。因此，AKP常用來作為鑒定EC細(xì)胞或ES細(xì)胞分化與否的標(biāo)志之一。第42頁，共74頁，

27、2022年，5月20日，13點(diǎn)35分，星期三 （5）胚胎階段特異性細(xì)胞表面抗原的表達(dá) 早期胚胎細(xì)胞表面均表達(dá)胚胎階段特異性表面抗原（SSEA-1）。在胚胎的原始外胚層細(xì)胞、ES細(xì)胞、EC細(xì)胞和原始生殖細(xì)胞的表面均可檢測到SSEA-1的表達(dá)。小鼠SSEA-1的表達(dá)自8細(xì)胞期開始，直到原始外胚層形成期。早期囊胚ICM細(xì)胞全部呈強(qiáng)陽性，晚期囊胚中部分ICM呈強(qiáng)陽性，部分呈弱陽性，少部分為陰性。因此，SSEA也常作為ES細(xì)胞鑒定的一個(gè)標(biāo)志。第43頁，共74頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)35分，星期三 2、ES細(xì)胞的全能性主要體現(xiàn)在以下幾方面： 形成畸胎瘤。將ES細(xì)胞注人同源動物皮下可形成畸胎瘤，包

28、括三個(gè)胚層細(xì)胞； 形成類胚體。培養(yǎng)ES細(xì)胞在非粘附底物中懸浮生長，或控制增殖細(xì)胞數(shù)目，能夠使之生成類胚體，它是一個(gè)與畸胎瘤相似的多種細(xì)胞系混雜的集合體、具有三個(gè)胚層組織； 第44頁，共74頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)35分，星期三 直系分化。通過控制ES細(xì)胞生長環(huán)境，或遺傳操縱特定基因表達(dá)，ES細(xì)胞可直接分化成某特定種系細(xì)胞，例如將神經(jīng)決定基因NeuroD2和NeuroD3轉(zhuǎn)人ES細(xì)胞，可使之分化為神經(jīng)細(xì)胞； 形成嵌合體。將ES細(xì)胞注射到同種動物囊胚腔中后，可以形成嵌合體（chimera），ES細(xì)胞可以參與嵌合體各個(gè)器官包括生殖腺的發(fā)育。這是檢驗(yàn)一個(gè)細(xì)胞系是否為ES細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)。 第45頁

29、，共74頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)35分，星期三3、ES細(xì)胞的鑒定- 細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)- 核型分析- 堿性磷酸酶（AKP）染色- SSEA-I 免疫熒光標(biāo)記- 分化能力檢測 體外分化試驗(yàn) 體內(nèi)分化試驗(yàn) 嵌合體形成試驗(yàn) 核移植試驗(yàn)第46頁，共74頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)35分，星期三 （1）ES細(xì)胞形態(tài)學(xué)鑒定 依ES細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)（胞體體積小，核大、有一個(gè)或幾個(gè)核仁）和生長特性（呈克隆狀生長，細(xì)胞緊密聚集，形似鳥巢，界限不清）對ES細(xì)胞進(jìn)行初步鑒定。第47頁，共74頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)35分，星期三 （2）核型分析 ES細(xì)胞具有正常二倍體核型，可用核型分析進(jìn)行檢驗(yàn)第

30、48頁，共74頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)35分，星期三 （3）堿性磷酸酶（AKP）染色原理：AKP在堿性條件（pH9.0-9.6）下能使孵育液中的-磷酸奈酚鈉水解，產(chǎn)生-奈酚，然后再與偶氮鹽偶聯(lián)，形成不溶性染料而呈現(xiàn)顏色。步驟：生長胚胎干細(xì)胞克隆的蓋片以無水乙醇或冷丙酮固定10-15min水洗滴加孵育液室溫5-10min水洗10min復(fù)染（甲基綠等） 10min。結(jié)果：未分化胚胎干細(xì)胞顏色以所用偶氮鹽品種而異，分化者則為復(fù)染液顏色。對照：以已建系ES細(xì)胞（或小鼠的脫帶桑椹胚或囊胚）作為陽性對照，作用液中不含-萘酚磷酸鈉為陰性對照。 第49頁，共74頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)35

31、分，星期三第50頁，共74頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)35分，星期三（4）胚胎干細(xì)胞特異表面抗原的表達(dá)免疫熒光檢測SSEA胚胎階段特異性抗原:SSEA-1 SSEA-3 SSEA-4 Thmoson分離的hES 陰性 弱陽性 強(qiáng)陽性Gearhart分離的hES 陽性 弱陽性 陽性小鼠ES 陽性 陰性 陰性鼠和人胚胎干細(xì)胞表達(dá)的表面抗原有種屬差異。RT-PCR檢測轉(zhuǎn)錄因子Oct-4的表達(dá) Oct-4只限定在多潛能細(xì)胞中表達(dá)。人和小鼠的胚胎干細(xì)胞都表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子Oct-4，當(dāng)胚胎干細(xì)胞分化時(shí)，其表達(dá)能力大大降低。第51頁，共74頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)35分，星期三52第52頁，共7

32、4頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)35分，星期三（5）分化能力檢測體外分化能力觀察:無飼養(yǎng)層和無抑制分化因子的條件下培養(yǎng)，胚胎干細(xì)胞會分化成各種細(xì)胞或發(fā)育成胚胎體：3d “簡單類胚體” 5-10d“囊狀胚體” 貼壁細(xì)胞為細(xì)胞分化物。第53頁，共74頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)35分，星期三體內(nèi)分化能力觀察：ES細(xì)胞接種同一品系小鼠腹股溝（107個(gè)細(xì)胞）或裸鼠、SCID小鼠（106個(gè)細(xì)胞）約2周后出現(xiàn)腫塊，4-5周進(jìn)一步增大，摘除腫塊固定切片染色：見三個(gè)胚層組織，為畸胎瘤結(jié)構(gòu)裸鼠和SCID小鼠可接種異種細(xì)胞和組織的移植也可接種腹腔，2-3周后觀察腫瘤第54頁，共74頁，2022年，5月2

33、0日，13點(diǎn)35分，星期三嵌合能力測定：野灰色小鼠品系（如129鼠）ES注射白化體小鼠（BALB/c小鼠）或純合非野灰色小鼠（C57BL/6小鼠）著床前胚胎內(nèi)，或?qū)碓从诎谆w小鼠的ES注射野灰色小鼠或純合非野灰色小鼠著床前胚胎內(nèi)，再移植到假孕母鼠子宮內(nèi)，使之發(fā)育成個(gè)體。 如ES具有嵌合能力，則會融合到宿主胚胎細(xì)胞中，并共同發(fā)育形成各種組織細(xì)胞并產(chǎn)生個(gè)體小鼠即為嵌合體，其毛色應(yīng)是ES細(xì)胞來源品系小鼠和胚胎供體小鼠毛色的雜合，即有白色皮毛也有野灰色或黑色皮毛。 除毛色觀察，也可檢測同工酶遺傳標(biāo)記，或采用PCR和小衛(wèi)星DNA方法等鑒定嵌合體。第55頁，共74頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)35分

34、，星期三六、成體干細(xì)胞優(yōu)點(diǎn)獲取相對容易 源于患者自身的成體干細(xì)胞在應(yīng)用時(shí)不存在組織相容性的問題，避免了移植排斥反應(yīng)和使用免疫抑制劑 理論上，成體干細(xì)胞致瘤風(fēng)險(xiǎn)很低，而且所受倫理學(xué)爭議較少 成體干細(xì)胞還具有多向分化潛能 第56頁，共74頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)35分，星期三但胚胎干細(xì)胞也存在自身的優(yōu)勢： 胚胎干細(xì)胞能永生化，可以傳代建系，且增殖能力強(qiáng)，來源充沛。 雖然成體干細(xì)胞具有向多系分化的能力，但這種分化的“效率”尚不理想。通過體外的擴(kuò)增培養(yǎng)能提高轉(zhuǎn)化效率，但是體外的轉(zhuǎn)化是否會引起成體干細(xì)胞遺傳變化還有待證實(shí)，而且這種分化是否是成體干細(xì)胞多系分化的結(jié)果尚無法肯定。成體干細(xì)胞和胚胎干

35、細(xì)胞各有自身的優(yōu)勢和缺陷。同時(shí)開展對兩者的研究，能互為裨益，相得益彰。兩者的研究對干細(xì)胞領(lǐng)域而言都是必要的。 第57頁，共74頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)35分，星期三成體干細(xì)胞鑒定方法：科學(xué)家尚未就成體干細(xì)胞的鑒定標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成一致，經(jīng)常被采用的鑒定方法包括： 利用分子標(biāo)記在活體組織中對細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，然后確定它們所產(chǎn)生的特定細(xì)胞類型。 將細(xì)胞從活體動物上分離出來，在對其進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的過程中進(jìn)行標(biāo)記，之后將細(xì)胞移植入另一個(gè)動物體內(nèi)，觀察該細(xì)胞是否可以再生其來源組織。 分離細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，并對其分化進(jìn)行控制，通常采用加入生長因子或向細(xì)胞內(nèi)引入新基因的方法，進(jìn)而觀察細(xì)胞的分化方向。 第58頁，

36、共74頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)35分，星期三 目前研究的成體干細(xì)胞 （Adult Stem Cells）Bone Marrow Heamatopoietic Stem Cells( HSC )Peripheral Blood Stem Cells ( PBSC )Fetal Liver Stem CellsUmbilical Cord Blood Stem CellsNeural Stem Cells 第59頁，共74頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)35分，星期三造血干細(xì)胞作為干細(xì)胞研究與應(yīng)用的突破口1. 造血細(xì)胞是細(xì)胞增殖分化的最佳模型。2. 造血干祖細(xì)胞及各系血細(xì)胞的表面標(biāo)志較

37、為清 楚，細(xì)胞表型特征可進(jìn)行定量分析，且可分選。3. 造血干細(xì)胞增殖及向各系分化的重要誘導(dǎo)因 子、受體、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、微環(huán)境等因素較為清楚。4. 造血細(xì)胞發(fā)揮功能可相對游離，不需“生物支架”、 神經(jīng)、血管、外科移植等復(fù)雜的“下游”工藝，因 此便于直接應(yīng)用于臨床。第60頁，共74頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)35分，星期三神經(jīng)干細(xì)胞(nural stem cell，NSC) NSC可增殖分化出中樞神經(jīng)系統(tǒng)的三種基本細(xì)胞：神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞。 神經(jīng)干細(xì)胞的生化標(biāo)記為巢素蛋白及波形蛋白。由于分離神經(jīng)干細(xì)胞所需的胎兒腦組織較難取材，神經(jīng)干細(xì)胞的研究仍處于初級階段。 第61頁，共74頁，

38、2022年，5月20日，13點(diǎn)35分，星期三五、目前干細(xì)胞的研究熱點(diǎn)人體干細(xì)胞的建株；干細(xì)胞保持不分化的培養(yǎng)；干細(xì)胞的定向誘導(dǎo)分化；干細(xì)胞應(yīng)用的法律、倫理道德問題；干細(xì)胞、組織工程、器官工程；胚胎組織的種植及定向誘導(dǎo)分化。第62頁，共74頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)35分，星期三 六、胚胎干細(xì)胞研究的應(yīng)用前景ES細(xì)胞在哺乳動物個(gè)體發(fā)生發(fā)育規(guī)律的研究中極有價(jià)值的工具；ES細(xì)胞是研究細(xì)胞分化的理想手段；ES細(xì)胞是研究基因功能的首選細(xì)胞；ES細(xì)胞作為生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物的主要途徑之一；ES細(xì)胞治療技術(shù)將引起一場醫(yī)學(xué)革命；ES細(xì)胞可用于研究細(xì)胞癌變機(jī)理和新藥物的篩選。第63頁，共74頁，2022年，5

39、月20日，13點(diǎn)35分，星期三 Human Disease modelHepatocytesBlood Cells藥物開發(fā)、毒性測試臨床醫(yī)療應(yīng)用基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究Human disease model胚胎干細(xì)胞的基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研發(fā)與臨床應(yīng)用第64頁，共74頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)35分，星期三來源于干細(xì)胞的組織可能用于治療的疾病 細(xì)胞類型 治療的疾病神經(jīng)細(xì)胞 中風(fēng)、帕金森氏病、老年癡呆癥、 脊髓損傷、多發(fā)性硬化病心肌細(xì)胞 心臟病發(fā)作、充血性心臟病產(chǎn)生胰島素的細(xì)胞 糖尿病軟骨細(xì)胞 骨性關(guān)節(jié)炎血細(xì)胞 免疫缺乏癥、血液病、白血病肝細(xì)胞肝炎、肝硬化皮膚細(xì)胞燒傷骨細(xì)胞骨質(zhì)疏松癥視網(wǎng)(眼)細(xì)胞黃斑癥骨骼肌細(xì)胞 肌肉萎縮癥第65頁，共74頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)35分，星期三干