呼吸道九聯(lián)檢sop

1、文件編號 ：0001紅河州第三人民醫(yī)院檢驗科版本：第一版生效日期： 2016主題內(nèi)容呼吸道感染病原體九聯(lián)檢操作程序第頁呼吸道九聯(lián)檢操作程序一、呼吸道感染概述呼吸道感染是指病原體感染人體的鼻腔 、咽喉、氣管和支氣管等呼吸系統(tǒng) 。分為上呼吸道感染和下呼吸道感染 ，上呼吸道感染常見的是急性上呼吸道感染 （acute upper respir tract infection ），指鼻腔 、咽或喉部急性炎癥的概稱 ，是呼吸道最常見的一種傳染病 。常見病因為病毒，少數(shù)由細菌引起 ?；颊卟环帜挲g 、性別、職業(yè)和地區(qū) 。不僅具有較強的傳染性 ，而且可引起嚴重并發(fā)癥 。下呼吸道感染是最常見的感染性疾患 ，包括急

2、性氣管 支氣管炎 、慢性支氣管炎 、肺炎、支氣管擴張等 ，由病毒、細菌、支原體、衣原體、軍團菌等微生物引起，其防治應遵循預防為主 、準確診斷 、及時治療的原則 ，治療時必須明確引起感染的病原體以選擇有效的抗生素 。一、免疫熒光法介紹免疫熒光技術(shù) （Immunofluorescence technique ）又稱熒光抗體技術(shù)，是標記免疫技術(shù)中發(fā)展最早的一種 。它是在免疫學 、生物化學和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項技術(shù) 。很早以來就有一些學者試圖將抗體分子與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合 ，利用抗原抗體反應進行組織或細胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位 。Coons 等于 1941 年首次采用熒光素進行標記而獲得成功 。這

3、種以熒光物質(zhì)標記抗體而進行抗原定位的技術(shù)稱為熒光抗體技術(shù) （fluorescent antibody technique ）。 用熒光抗體示蹤或檢查相應抗原的方法稱熒光抗體法 ；用已知的熒光抗原標記物示蹤或檢查相應抗體的方法稱熒光抗原法 。這兩種方法總稱免疫熒光技術(shù) ，因為熒光色素不但能與抗體球蛋白結(jié)合 ，用于檢測或定位各種抗原 ，也可以與其他蛋白質(zhì)結(jié)合 ，用于檢測或定文件編號 ：0001紅河州第三人民醫(yī)院檢驗科版本：第一版生效日期： 2016主題內(nèi)容呼吸道感染病原體九聯(lián)檢操作程序第頁位抗體，但是在實際工作中熒光抗原技術(shù)很少應用 ，所以人們習慣稱為熒光抗體技術(shù) ，或稱為免疫熒光技術(shù) 。用免疫熒

4、光技術(shù)顯示和檢查細胞或組織內(nèi)抗原或半抗原物質(zhì)等方法稱為免疫熒光細胞 （或組織）化學技術(shù) 。熒光免疫法按反應體系及定量方法不同 ，還可進一步分做若干種 。與放射免疫法相比 ，熒光免疫法無放射性污染 ，并且大多操作簡便 ，便于推廣 。該技術(shù)的主要特點是 ：特異性強、敏感性高 、速度快。主要缺點是 ：非特異性染色問題尚未完全解決 ，結(jié)果判定的客觀性不足 ，技術(shù)程序也還比較復雜 。但近年來發(fā)展了幾種特殊的熒光免疫測定 ，已經(jīng)很好改善了這些缺點 ，與酶免疫測定和放射免疫分析一樣 ，應用在臨床檢驗中 。1原理免疫學的基本反應是抗原 -抗體反應 。由于抗原抗體反應具有高度的特異性 ，所以當抗原抗體發(fā)生反應時

5、 ，只要知道其中的一個因素 ，就可以查出另一個因素 。免疫熒光技術(shù)就是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標記在抗體 （或抗原）上，與其相應的抗原 （或抗體）結(jié)合后，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)一種特異性熒光反應。其根據(jù)反應體系的不同可分為 ：直接法：將標記的特異性熒光抗體 ，直接加在抗原標本上 ，經(jīng)一定的溫度和時間的染色，用水洗去未參加反應的多余熒光抗體 ，室溫下干燥后封片 、鏡檢。間接法：如檢查未知抗原 ，先用已知未標記的特異抗體 （第一抗體 ）與抗原標本進行反應，用水洗去未反應的抗體 ，再用標記的抗抗體 （第二抗體）與抗原標本反應 ，使之形成抗原 抗體 抗體復合物 ，再用水洗去未反應的標記抗體 ，干燥、

6、封片后鏡檢 。如果檢查未知抗體 ，則表明抗原標文件編號 ：0001紅河州第三人民醫(yī)院檢驗科版本：第一版生效日期： 2016主題內(nèi)容呼吸道感染病原體九聯(lián)檢操作程序第頁本是已知的 ，待檢血清為第一抗體 ，其它步驟的抗原檢查相同 。根據(jù)抗原抗體反應后定量方法的不同可分為 ：熒光抗體技術(shù) (熒光顯微鏡技術(shù))：抗原抗體反應后 ，利用熒光顯微鏡判定結(jié)果的檢測方法 。免疫熒光測定技術(shù) ：抗原抗體反應后 ，利用特殊儀器測定熒光強度而推算被測物濃度的檢測方法 。2.熒光物質(zhì)許多物質(zhì)都可產(chǎn)生熒光現(xiàn)象 ，但并非都可用作熒光色素 。只有那些能產(chǎn)生明顯的熒光并能作為染料使用的有機化合物才能稱為免疫熒光色素或熒光染料 。

7、所用熒光物質(zhì)介紹 ：異硫氰酸熒光素 （fluoresceinisothiocyanate ，F(xiàn)ITC）：為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末 ，易溶于水或酒精等溶劑 。分子量為 389.4，最大吸收光波長為 490 495nm ，最大發(fā)射光波長 520530nm ，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光 ，有兩種同分異結(jié)構(gòu) ，其中異構(gòu)體 型在效率、穩(wěn)定性、與蛋白質(zhì)結(jié)合能力等方面都更好 ，在冷暗干燥處可保存多年 ，是應用最廣泛的熒光素 。其主要優(yōu)點是 ： 人眼對黃綠色較為敏感 ， 通常切片標本中的綠色熒光少于紅色 。一、呼吸道九聯(lián)檢產(chǎn)品介紹九項呼吸道感染病原體IgM 抗體檢測試劑盒 ，采用間接免疫熒光法（IFA），同時檢測人血

8、清中呼吸道感染主要病原體的 IgM 抗體，可檢的病原體包括 ：嗜肺軍團菌血清 1 型、肺炎支原體 、Q 熱立克次體、。在下一步驟中 ，抗原，用免疫熒光顯微鏡觀文件編號 ：0001紅河州第三人民醫(yī)院檢驗科版本：第一版生效日期： 2016主題內(nèi)容呼吸道感染病原體九聯(lián)檢操作程序第頁肺炎衣原體 、腺病毒、呼吸道合胞病毒 、甲型流感病毒 、乙型流感病毒和副流感病毒 1、2 和 3 型。用于呼吸道感染疾病的輔助診斷 。1.檢測原理間接免疫熒光法 （IFA）（圖 1）是基于待測樣本中的抗體與吸附在載玻片上的抗原發(fā)生的反應 。樣本中存在的特異性抗體和抗原反應 ，未與抗原結(jié)合的免疫球蛋白在洗滌步驟中除去-抗體復

9、合物與熒光素標記的抗人球蛋白反應察結(jié)果。圖 1圖 1：九項呼吸道感染病原體 IgM 抗體檢測試劑盒檢測原理試劑盒組成及用途組分成分和用途載玻片檢測的物理載體 ，覆有聚四氟乙烯并包被有針對檢測物的特異性抗原 ，包裝袋內(nèi)有一袋硅膠以防潮 。質(zhì)控品用于證明試劑盒及試驗的有效性 ，含有人血清及防腐劑。吸附劑羊抗人 IgG 用來吸附人 IgG 避免干擾 IgM 檢測 ，含紅河州第三人民醫(yī)院檢驗科主題內(nèi)容呼吸道感染病原體九聯(lián)檢操作程序有防腐劑。文件編號 ：0001版本：第一版生效日期： 2016第頁3.1熒光素標記的抗人免疫球蛋白結(jié)合物，含有染色液 、實FITC 結(jié)合物 防腐劑和蛋白穩(wěn)定劑 。和抗原抗體復

10、合物反應 ，并顯驗色。前封閉介質(zhì)甘油緩沖液 ，便于觀察。準磷酸鹽緩沖用于洗滌步驟 ，從反應介質(zhì)中除去未結(jié)合的免疫球蛋備液(PBS)白和結(jié)合物 。1）操作步驟量筒燒杯離心管微量移：1000ml、1000ml、3.液器、溫育濕盒、洗瓶、水平搖床、恒溫箱、蓋玻片、熒光顯微鏡 。2）PBS洗液的準備 ：將 1 瓶 PBS粉末倒入燒杯中 ，加入 1L 蒸餾水中 ，搖勻直至完全溶解 ，配好后儲存在 2-8oC 備用。3）使用前 ，將所有試劑平衡至室溫 ，將恒溫箱調(diào)至 37。3.2 實驗步驟1）樣本的稀釋：按1:1比例稀釋血清標本，即血清加入15L15LPBS中。陰陽性對照不需要稀釋 。2）用吸附劑處理稀釋

11、后的血清 ：將30稀釋后的血清加入150吸L附劑中，徹底混勻。陰陽性對照不需吸附劑處理 。處理后的血清要離心 10-15 分鐘除去沉淀 ，以防干擾檢測 。3）在載玻片的每孔中加吸附劑處理過的血清。在一個載玻片的15L每孔中加入 15L 不稀釋的陽性對照 ，在另一個載玻片的每孔中加入 15L 不稀釋的陰性對照 。4）將載玻片放入濕盒中 ，37溫育 90分鐘。文件編號 ：0001紅河州第三人民醫(yī)院檢驗科版本：第一版生效日期： 2016主題內(nèi)容呼吸道感染病原體九聯(lián)檢操作程序第頁5）用 PBS洗液的緩慢水流沖洗載玻片 （避免直接沖入孔內(nèi) ）后，浸泡在 PBS中并放置在水平搖床上輕輕搖動 10 分鐘。將

12、載玻片用蒸餾水緩慢水流沖洗 （避免直接沖入孔內(nèi) ）。6）載玻片自然晾干 。7）每孔加入 15LFITC 結(jié)合物溶液 （不需稀釋 ）。8）將載玻片放入濕盒 ，37溫育 30 分鐘 。9）重復 6 和 7 的洗滌步驟 。10）加幾小滴封閉介質(zhì) ，小心蓋上蓋玻片 。11）盡快用熒光顯微鏡在 400 倍放大率下觀察結(jié)果 。如果不能立即觀察，可將其避光放置于 2-8oC 不超過 24 小時。4結(jié)果判斷4.1 有效性判斷每一次試驗都應設(shè)立陽性和陰性對照 ，以確認試驗和試劑盒的有效性。觀察到的熒光模式應為 ：陽性對照 ：腺病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒或副流感病毒對陽性質(zhì)控的 1-15% 細胞出現(xiàn)蘋果綠細胞

13、核 、胞漿或胞膜熒光（在副流感病毒和呼吸道合胞病毒中能同時觀察到著色的合胞 ）；軍團菌、衣原體或立克次體中所有的細菌呈現(xiàn)出蘋果綠熒光 ；支原體對陽性質(zhì)控在細胞外圍呈現(xiàn)蘋果綠色熒光 。陰性對照 ：軍團菌、肺炎衣原體和立克次體無熒光 ，支原體 、腺病毒、甲型和乙型流感病毒 、呼吸道合胞病毒和副流感病毒的細胞呈現(xiàn)紅色 。文件編號 ：0001紅河州第三人民醫(yī)院檢驗科版本：第一版生效日期： 2016主題內(nèi)容呼吸道感染病原體九聯(lián)檢操作程序第頁4.2 樣本結(jié)果判斷陽性結(jié)果：可以觀察到腺病毒 、流感病毒、呼吸道合胞病毒或副流感病毒對陽性血清的 1-15% 細胞的細胞核 、胞漿或胞膜出現(xiàn)蘋果綠色熒光 （在副流感

14、病毒和呼吸道合胞病毒中能同時觀察到著色的合胞 ）；軍團菌、衣原體或立克次體中所有的細菌呈現(xiàn)出蘋果綠色熒光 ；支原體對陽性血清在細胞外圍呈現(xiàn)蘋果綠色熒光 。陰性結(jié)果 ：可觀察到軍團菌 、肺炎衣原體和立克次體無熒光 ，支原體 、腺病毒、甲型和乙型流感病毒 、呼吸道合胞病毒和副流感病毒的細胞呈現(xiàn)紅色 。4.3 檢驗結(jié)果的解釋每一批產(chǎn)品在放行前都要經(jīng)過嚴格的內(nèi)部質(zhì)量控制 （Q.C）.檢驗。質(zhì)控品科溯源到經(jīng)過內(nèi)部確認的參考血清盤 。2）如果所有細胞或第十孔出現(xiàn)熒光表明存在抗核和抗細胞抗體 ，不能判斷為陽性 ，應用其他方法進行檢驗 。當質(zhì)控孔中吳熒光時一定要查明原因 。3）由于非軍團菌感染的病人中經(jīng)常出現(xiàn)

15、交叉抗體 ，軍團菌陽性的結(jié)果需結(jié)合臨床癥狀綜合評價 。建議做較高稀釋度的檢測來提高陽性預測值。4）與說明書中所列結(jié)果不同不能判為陽性 。5）在初次感染和再次感染的過程中 。IgG 和 IgM 抗體有不同的表現(xiàn)方式：初次感染時 ，幾乎在所有的情況下 IgM 和 IgG 均出現(xiàn)（IgM 早于 IgG 出現(xiàn)）；而再次感染時 ，可能會出現(xiàn) IgM。在許多疾病中病人文件編號 ：0001紅河州第三人民醫(yī)院檢驗科版本：第一版生效日期： 2016主題內(nèi)容呼吸道感染病原體九聯(lián)檢操作程序第頁的一生都可能存在高低度的 IgG，而 IgM 一般情況下在感染后 2-3 個月存在血清中 ，因此 IgM 是近期感染的有效標

16、志物 。6）九種病原體 IgM 抗體陰性及陽性結(jié)果的熒光染色圖譜 ：陽性結(jié)果熒光圖譜 ：陰性結(jié)果熒光圖譜 ：5.在使用本產(chǎn)品中所需注意事項如下：1）本產(chǎn)品用于體外診斷 ，僅限專業(yè)人員使用 。2）在使用前 ，建議用戶仔細閱讀和理解說明書 ，嚴格按照程序進行操作才能獲得可靠的檢測結(jié)果。特別是樣本和試劑的正確吸取以及仔細的洗板 、溫育的時間控制對獲得準確結(jié)果都很重要。另外使用前 ，應將所有試劑平衡至室溫 ，載玻片要平衡至室溫后再打開 。文件編號 ：0001紅河州第三人民醫(yī)院檢驗科版本：第一版生效日期： 2016主題內(nèi)容呼吸道感染病原體九聯(lián)檢操作程序第頁3）每一次試驗都應設(shè)立陽性和陰性對照 ，以確認試

17、驗和試劑盒的有效性。觀察到的熒光模式應與說明書要求相符合 ，否則檢驗無效。4）洗滌時注意不要直接對著孔直接沖洗 ，以免沖洗掉已經(jīng)固化反的應復合物 。5）單一樣本抗體檢測結(jié)果不能幫助作出近期感染的診斷 。應采集雙份樣本（急性期和康復期 ）同時檢測來觀察血清轉(zhuǎn)化或抗體水平的明顯升高 。6）僅使用試劑盒內(nèi)的組分 ，不要混用不同試劑盒或不同廠家的試劑組分。只有 PBS、吸附劑、封閉介質(zhì)和載玻片可與其他批次 VIRCELLIFA 試劑盒通用 ，其它組分同批次可以混用 。使用時，最好在無菌條件下操作試劑以防微生物污染 。僅使用試驗所需量的吸附劑 、PBS、質(zhì)控血清和結(jié)合物 ，剩余的試劑不要倒回瓶中 。PB

18、S溶解后儲存在 28 oC 一般為 4 個月，使用前需檢查 ，如出現(xiàn)渾濁請勿使用 。7）每步操作必須使用干凈吸頭 ，僅使用干凈的耗材 ，最好是一次性使用的耗材 。8）包裝如有損壞請勿使用 。9）切勿用嘴吸移液管加樣 。10）本試劑盒中的吸附劑 、結(jié)合物和質(zhì)控血清含有動物源性物質(zhì) ，質(zhì)控血清還含有人源性物質(zhì) 。盡管本試劑盒中的人血清質(zhì)控品已經(jīng)測試為 HBsAg、HCV 抗體和 HIV 抗體陰性 ,質(zhì)控血清和病人樣本仍應作為潛在感染性物質(zhì)進行處理 ?？變?nèi)包被的經(jīng)滅活的嗜肺軍團菌血清1 型、肺炎支原體 、Q 熱立克次體 、肺炎衣文件編號 ： 0001紅河州第三人民醫(yī)院檢驗科版本：第一版生效日期： 2016主題內(nèi)容呼吸道感染病原體九聯(lián)檢操作程序第頁原體、腺病毒、呼吸道合胞病毒 、甲型流感病毒 、乙型流感病毒和副流感病毒 1、2 和 3 型，也仍應視為具有潛在感染性并小心處置。目前沒有方法可以確保這些或其他感染性物質(zhì)不存在，因此所有的材料應視為具有潛在感染性進行處置 ，應遵守當?shù)仃P(guān)于臨床廢棄物處理的法規(guī) 。11）結(jié)合物 、吸附劑 、封閉介質(zhì)和質(zhì)控品含有疊氮鈉 （濃度 0.1%），避免接觸酸和重金屬。12）封閉介質(zhì)含