植物組織培養(yǎng)的一些注意事項(xiàng)

1、 10/10植物組織培養(yǎng)的一些注意事項(xiàng) 植物組織培養(yǎng)的一些注意事項(xiàng) 一、常用培養(yǎng)基主要特性 1、高鹽成分培養(yǎng)基包括MS、LS、BL、BM、ER 等培養(yǎng)基。其中MS 培養(yǎng)基應(yīng)用最廣泛,其鉀鹽、銨鹽及硝酸鹽含量均較高, 微量元素種類齊全, 其養(yǎng)分?jǐn)?shù)量及比例均比較合適, 廣泛用于植物的器官、花藥、細(xì)胞及原生質(zhì)體的培養(yǎng)。LS、BM、ER 培養(yǎng)基由MS 培養(yǎng)基演變而來。 2 、硝酸鉀含量較高的培養(yǎng)基包括B5 、N6 、LH、GS 等培養(yǎng)基。 B5 培養(yǎng)基B5 培養(yǎng)基除含有較高的鉀鹽外, 還含有較低的銨態(tài)氮和較高的鹽 酸硫胺素, 較適合南洋杉、葡萄及豆科與十字花科植物等的培養(yǎng)。 N6 培養(yǎng)基N6 培養(yǎng)基(

2、 朱至清等1975 ) 系我國學(xué)者創(chuàng)造, 獲國家發(fā)明二等獎(jiǎng), 適用于單子葉植物花藥培養(yǎng), 柑橘花藥培養(yǎng)也適合, 在楸樹、針葉樹等的組織培養(yǎng)中使用效果也好。 SH 培養(yǎng)基是礦鹽濃度較高的一種培養(yǎng)基, 其中銨與磷酸是由磷酸二氫銨 ( NH4 H2 PO4 ) 提供的, 這種培養(yǎng)基適合于某些單子葉及雙子葉植物的培養(yǎng)。 3 、中等無機(jī)鹽含量的培養(yǎng)基 H 培養(yǎng)基本培養(yǎng)基大量元素約為MS 培養(yǎng)基的一半, 僅磷酸二氫鉀及氯化鈣稍低, 微量元素種類減少, 而含量較MS 為高, 維生素種類比MS 多。適于花藥培養(yǎng)。 尼奇培養(yǎng)基(Niotsch 1969 ) 此培養(yǎng)基與H 培養(yǎng)基成分基本相同, 僅生物素比 H 培

3、養(yǎng)基高10 倍。也適合于花藥培養(yǎng)。 米勒培養(yǎng)基(Miller 1963 ) 此培養(yǎng)基和Blaydes(1966) 培養(yǎng)基二者成分完全相同。適合大豆愈傷組織培養(yǎng)和花藥等培養(yǎng)用。 4 、低無機(jī)鹽培養(yǎng)基大多情況下用于生根培養(yǎng)基。有以下幾種: 改良懷特培養(yǎng)基(White 1963 ) WS 培養(yǎng)基(Wolter & Skoog 1966) 克諾普液( Knop 1965 ) 花卉培養(yǎng)上用得多。 貝爾什勞特液(Berthelot 1934) HB 培養(yǎng)基( Holley & Baker 1963) 此培養(yǎng)基在花卉脫毒培養(yǎng)和木本植物的莖尖培養(yǎng)中效果良好。其成分是大量元素比1/ 2 克諾普( Knop )

4、液稍多, 微量元 素用貝爾什勞特液, 每升培養(yǎng)基中加0 . 5ml。 二、與培養(yǎng)基有關(guān)的一些細(xì)節(jié)問題 1、培養(yǎng)基所用藥品應(yīng)采用等級較高的化學(xué)純CP(三級) 及分極純AR(二級) , 以免雜質(zhì)對培養(yǎng)物造成不利影響。 2、調(diào)節(jié)PH也可用精密pH試紙(應(yīng)在干燥器中保存, 以免吸濕而失效)。培養(yǎng)基過酸的可用1mol/ L 氫氧化鈉( NaOH) 來調(diào)節(jié); 培養(yǎng)基過堿的可用1mol/ L 鹽酸( HCl ) 來調(diào)節(jié)( 1mol/ L NaOH 的配制方法是稱40gNaOH, 溶解后加入蒸餾水, 定容到1 000ml 即可。1mol/ L HCl 的配制方法是量取12mol/ L HCl 84ml , 加

5、水定容至1 000ml)。經(jīng)高壓蒸汽滅菌后, 由于某些成分的分解(如蔗糖的分解) 或氧化, 酸度會增加( pH 值一般可降低0 . 2 )。有時(shí)玻璃器皿質(zhì)量較差, 其中一部分物質(zhì)溶解, 也會影響酸度的變化。這些在調(diào)整pH 值時(shí)都要考慮進(jìn)去。分裝后應(yīng)立即滅菌, 若因故不能及時(shí)滅菌, 最好放入冰箱中在24h 內(nèi)完成滅菌工作。滅菌時(shí)壓力表讀數(shù)為0 . 8kg/ cm2 1 . 1kg/ cm2 , 121時(shí)保持15min20min 即可。 3、某些生長調(diào)節(jié)物質(zhì), 如吲哚乙酸、玉米素及某些維生素等物質(zhì)遇熱不穩(wěn)定, 因此不能進(jìn)行高壓滅菌, 而需用過濾方法滅菌, 經(jīng)過濾滅菌的溶液, 可在瓊脂培養(yǎng)基溫度下降

6、到大約40時(shí)加入到已高壓滅菌的培養(yǎng)基中。 4、配好的培養(yǎng)基可放到培養(yǎng)室中預(yù)培養(yǎng)3d ,若沒有污染反應(yīng), 則證明是可靠的, 可以使用。暫時(shí)不用的培養(yǎng)基最好置于10下保存, 含有生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的培養(yǎng)基在45低溫下保存則更理想。含吲哚乙酸或赤霉素的培養(yǎng)基應(yīng)在配制一周內(nèi)用完, 其他培養(yǎng)基至多也不能超過一個(gè)月。一般情況下, 兩周內(nèi)應(yīng)用完, 以免干燥變質(zhì)。 三、培養(yǎng)材料及消毒 1、取材季節(jié)的影響：大多數(shù)植物應(yīng)在其生長開始的季節(jié)采樣, 生長末期或已進(jìn)入休眠期, 則外植體對誘導(dǎo)反應(yīng)遲鈍或無反應(yīng)。 2、器官的生理狀態(tài)和發(fā)育年齡：沿植物的主軸, 越向上的部分所形成的器官其生長的時(shí)間越短, 其生理年齡也越老, 越接近

7、發(fā)育上的成熟, 越易形成花器官。反之, 越向下, 其生理年齡越小。木本植物的組織培養(yǎng)中, 以幼齡樹的春梢嫩枝段或基部的萌條較好, 下胚軸與具有3 對4 對真葉的嫩莖段, 生長效果也較 好。一般情況下, 幼年組織比老年組織具有較高的形態(tài)發(fā)生能力。 3、材料大小的影響：材料越小成活率越低, 莖尖培養(yǎng)存活的臨界大小應(yīng)為一個(gè)莖尖分生組織帶1 個(gè)2 個(gè)葉原基, 約0 .2mm0 .3mm 大小。葉片、花瓣等約為5mm2 , 莖段則長約0 .5mm。因此, 除非用于去除病毒否則不宜將外植體切的過小。但并不是說外植體越大越好, 外植體過大易造成污染, 有實(shí)驗(yàn)證明外植體越大污染率越高。 4、材料的滅菌：一般是

8、組織越大越易污染, 夏季比冬季帶菌多，甚至不同年份污染的情況也有區(qū)別。取材最好選在中午或下午, 避開陰雨天取材可減少污染率。消毒是為了消滅病菌, 以保證無菌組織培養(yǎng)的進(jìn)行。但不同植物及一株植物不同部位的組織, 其帶菌程度不同, 它們對不同種類、不同濃度的消毒劑的敏感度也不一樣。最初所使用的消毒劑種類, 濃度及消毒時(shí)間的長短都要進(jìn)行摸索, 以達(dá)到最佳的消毒效果。 材料有絨毛最好在消毒液中加入幾滴吐溫- 80 ,對與難消毒的根及地下部位材料可將其浸入消毒液中進(jìn)行抽氣減壓, 以幫助消毒液的滲入, 從而達(dá)到徹底滅菌的目的。潘學(xué)峰等( 1998) 報(bào)道, 12% 的雙氧水+ 0 .1%的升汞混合液對南方

9、地下莖生姜滅菌10min 的效果最好。 四、材料的接種 1、接種室的消毒：植物組織培養(yǎng)技術(shù)實(shí)際上是一種無菌操作和無菌培養(yǎng)技術(shù), 做好接種室的消毒是至關(guān)重要的。污染的主要來源是空氣中的細(xì)菌和真菌孢子, 因此, 每次接種前應(yīng)進(jìn)行地面的清潔衛(wèi)生工作, 并用70%酒精噴霧使空氣的灰塵沉降, 并用紫外線燈照射20min。接種前超凈工作臺面要用新潔爾滅或酒精擦洗,并定期清洗過濾膜, 以延長使用壽命。 2、無菌操作要求：工作人員使用的工作服、帽子、口罩等, 要經(jīng)常保持干凈, 并定期進(jìn)行消毒, 即將洗凈、晾干的衣帽、口罩等用紙包好后與培養(yǎng)基一起進(jìn)行高壓滅菌。工作人員的頭發(fā)、衣服、手指中都帶有許多雜菌, 為此要

10、穿上工作服, 戴上帽子, 也必須剪除指甲, 并用肥皂擦洗, 最好再在新潔爾滅溶液中浸泡10 min , 接種操作前則用70%酒精擦洗。工作人員的呼吸所產(chǎn)生的污染, 主要是 在接種時(shí)談話或咳嗽所引起的, 因此, 在操作時(shí)應(yīng)禁止談話并應(yīng)戴上口罩。 3、材料的分離、切取和接種 切割動(dòng)作要快, 防止擠壓使材料受損傷而招致培養(yǎng)失敗, 也要避免使用生銹的刀片, 以防止氧化現(xiàn)象產(chǎn)生。接種時(shí)要防止交叉污染的發(fā)生,刀和鑷子等接種工具使用一次應(yīng)放入70% ( 或95%)酒精中浸泡, 然后灼燒放涼備用。 接種時(shí)輕輕取下封口紙, 動(dòng)作要慢以免氣流沖入瓶中造成污染。將瓶口靠近酒精燈火焰, 瓶口傾斜, 以免空氣中的微生物

11、落入瓶中,將瓶口外部在燈焰上燎數(shù)秒鐘, 將灰塵雜物等固定在原處, 然后用鑷子將外植體送入瓶中, 材料在培養(yǎng)容器內(nèi)的分布要均勻, 以保證必要的營養(yǎng)面積和光照條件。莖尖、莖段等基部插入固體培養(yǎng)基中, 葉片通常將葉背接觸培養(yǎng)基, 這是由于葉背氣孔多, 利于吸收水分和養(yǎng)分的緣故。 五、材料的初代培養(yǎng) 1、實(shí)驗(yàn)方案的設(shè)計(jì) 1）、單因子實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：單因子實(shí)驗(yàn)是組織培養(yǎng)中最常用的實(shí)驗(yàn)方法, 尤其在選擇適當(dāng)?shù)募に胤N類和濃度配比上使用最多。 2 ）、正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)植物離體培養(yǎng)的成功是由多種因素決定的。正交設(shè)計(jì)是多因素分析的有力工具, 它可以很方便的從眾多因素中選出主要影響因素及最佳水平, 因?yàn)樗梢杂幂^少的實(shí)驗(yàn)次數(shù)

12、得到較多的信息。例如, 一個(gè)7 因素水平的實(shí)驗(yàn), 若將各因素水平全部組合都做一遍, 需要27 = 128 次, 而正交設(shè)計(jì)只需做8 次實(shí)驗(yàn)就可以了, 雖然實(shí)驗(yàn)次數(shù)減少了, 但因?yàn)楦饕蛩厮酱钆渚鶆? 8 次實(shí)驗(yàn)基本代表了全部實(shí)驗(yàn)的情況。 正交實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì), 主要工具是正交表。大多數(shù)生物統(tǒng)計(jì)學(xué)書都列出了可供選擇的 正交表,如L 4 ( 23 ) , L 8 (27 )見(表2 - 11 , 表2 - 12) 。字母L 右下角號碼8 表示它有8 個(gè)實(shí)驗(yàn)要做, 括號內(nèi)的指數(shù)7 表示這張表所安排的實(shí)驗(yàn)最多可考察7 個(gè)因素(也可安排2 個(gè)6 個(gè), 超過7 個(gè)要選擇其他正交表) , 底數(shù)2 表示被考察的因素

13、只要求兩個(gè)水平。在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前可根據(jù)要測試因素的多少及每種因素所考察的水平, 選擇適合的正交表, 然后按表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)?，F(xiàn)舉一個(gè)例子來說明, 設(shè)影響某種植物試管苗生長的因素有光照時(shí)間、光照強(qiáng)度、pH 值、溫度、蔗糖濃度、BA濃度、NAA 濃度7 個(gè)因素, 每個(gè)因素選擇兩個(gè)水平, 即, 光照時(shí)間( 10h , 14h )、光照強(qiáng)度(1000lx , 2000lx )、pH 值( 5 . 5 , 5 . 8 )、溫度( 20 , 25) 、BA 濃度( 0 . 5 , 2 . 0 )、NAA 濃度( 0 . 5 ,1 . 0)、蔗糖濃度(2% , 4%)?，F(xiàn)根據(jù)因素和水平的多少選擇一個(gè)適合本實(shí)驗(yàn)的正交表

14、, 選L (27)最理想, 8 填表時(shí), 因素水平對號入座, 見表( 2 - 13 )。第一號實(shí)驗(yàn)是光照時(shí)間10h/ d、光照強(qiáng)度1000lx、pH 值5 . 5、BA 濃度2 . 0、NAA 濃度0 . 5、蔗糖濃度4% , 其他實(shí)驗(yàn)依次類推。根據(jù)8 個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果, 如出苗數(shù)量、苗高、生根數(shù)、移栽成活率等, 綜合考慮, 根據(jù)需要選取各最適培養(yǎng)條件。也可通過一定的計(jì)算方法(參考統(tǒng)計(jì)學(xué)書) , 算出極差( R) , 極差(R) 表示每個(gè)因素在實(shí)驗(yàn)中所起作用的大小, R 越大表示該因素的不同水平對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響越大, 但若沒有可計(jì)算的指標(biāo)時(shí), 還是選擇單因子實(shí)驗(yàn)較好。 2、初代培養(yǎng)物的建立 1）、保

15、證無菌 2）、條件合適：首先, 一定要選擇好合適的作物種類、品種及培養(yǎng)的部位; 其次,一定要選擇合適的培養(yǎng)基, 激素及其他添加物; 還要注意掌握適宜的環(huán)境條件。所以在進(jìn)行一種植物的組織培養(yǎng)之前, 應(yīng)查找該種植物有關(guān)方面的資料, 根據(jù)這種植物過去所采用的培養(yǎng)部位、培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件和培養(yǎng)技術(shù)等, 再?zèng)Q定自己的工作步驟。 3）、操作技術(shù)過關(guān) 3、污染的防治 1）、植物材料的選擇及防止污染 通常多年生的木本材料比一二年生的草本材料帶菌多; 老的材料比幼嫩的材料帶菌多; 田間生長的材料比溫室生長的材料帶菌多; 帶泥土的材料比不帶泥土的材料帶菌多。為此對于培養(yǎng)材料的取材就應(yīng)很認(rèn)真地加以選擇, 以減少污染的

16、發(fā)生。 用莖尖作外植體時(shí), 應(yīng)在室內(nèi)或無菌條件下對枝條進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。將枝條用水沖洗干凈后插入無糖的營養(yǎng)液或自來水中, 使其發(fā)枝, 然后以這種新抽的嫩枝條作為外植體, 便可大大減少材料的污染?；蛟跓o菌條件下對采自田間的枝條進(jìn)行暗培養(yǎng), 待抽出徒長的黃化枝條時(shí)取材, 也可明顯地減少污染。 對木本植物等難以消毒的材料可采用多次滅菌法。如將切好的外植體放入1 . 3%次氯酸鹽溶液中(商品漂白粉25%的溶液)消毒30min , 然后用無菌水沖洗3 次, 再放在無菌條件下,次日用2 . 6%次氯酸鈉滅菌30min , 然后用無菌水沖洗3 次。也可采用多種藥液多次浸泡法,以加強(qiáng)滅菌效果。 材料內(nèi)部易感染病菌,

17、 在這種情況下, 必須在培養(yǎng)基中加入抗生素類, 防止初代培養(yǎng)物污染。 2）、人為污染的防止 接種前應(yīng)用肥皂將手仔細(xì)洗凈后, 再用70%酒精擦洗雙手, 并需及時(shí)剪除指甲。在工作中特別要注意避免交叉感染, 雙手必須清潔, 工具則用一次即需消毒一次。工作人員呼吸所產(chǎn)生的污染, 主要是接種時(shí)說話或咳嗽所引起的, 因此, 操作時(shí)嚴(yán)禁談話, 并應(yīng)戴上口罩, 也應(yīng)穿工作服, 戴工作帽。 污染中特別注意一種呈乳白色的細(xì)菌污染, 這種細(xì)胞為芽孢桿菌。法國林木育種協(xié)會鑒定為遲緩芽孢桿菌( Bacillus lenlus) , 它外被莢膜, 耐高溫, 一般消毒劑難以殺死。它可隨培養(yǎng)材料、用具等傳播; 它可出現(xiàn)在培養(yǎng)

18、基表面, 或呈滴形云霧狀存在于培養(yǎng)基內(nèi)。若出現(xiàn)應(yīng)嚴(yán)格滅菌, 清洗用具, 更換消毒酒精。4、防止外植體褐變 1）、褐變的影響因素 褐變是由于組織中的多酚氧化酶被激活, 使細(xì)胞的代謝發(fā)生變化, 酚類物質(zhì)被氧化后產(chǎn)生醌類物質(zhì), 這類物質(zhì)呈棕褐色, 它們會逐漸擴(kuò)散到培養(yǎng)基中, 抑制其他酶的活性, 毒害培養(yǎng)的材料。褐變的影響因素是復(fù)雜的, 隨植物種類、基因型、外植體的部位及生理狀況等的不同而危害的程度也有區(qū)別。 材料本身的生理狀態(tài)不同, 接種后褐變的程度也不同。如在歐洲栗的培養(yǎng)中, 用幼年型的材料培養(yǎng)含醌類物質(zhì)少, 而用成年型材料培養(yǎng)時(shí)含醌類物質(zhì)多。而在卡德利亞蘭的培養(yǎng)中, 較短的新生莖致褐物質(zhì)含量高,

19、 而較長的新生莖致褐物質(zhì)含量低, 另外致褐物質(zhì)的含量也因季節(jié)的不同而不同, 冬季褐變少, 夏秋季褐變最嚴(yán)重, 存活率最低。在枝條上取芽的時(shí)期及所取部位不同也有區(qū)別, 如歐洲栗取1 月后半月的芽培養(yǎng)則醌的形成少, 而在5 月6 月取芽培養(yǎng)則醌類物質(zhì)發(fā)生嚴(yán)重。在第一至第四個(gè)芽的生長期單寧類物質(zhì)合成多, 因此, 接種后褐變也嚴(yán)重。油棕用幼嫩外植體( 如胚)培養(yǎng)較少褐變, 而用高度分化的葉片接種后則容易褐變?？傊? 分生部位接種后形成的醌類物質(zhì)少, 而分化的部位則形成的醌類物質(zhì)較多。 培養(yǎng)基成分過高的無機(jī)鹽濃度會引起棕櫚科植物外植體酚的氧化。例如油棕用MS 無機(jī)鹽培養(yǎng)基容易引起外植體的褐變, 而用降低

20、了無機(jī)鹽濃度的改良MS 培養(yǎng)基 時(shí)則可減輕褐變, 而且可獲得愈傷組織和胚狀體。激素使用不當(dāng)時(shí), 材料也容易褐變。細(xì)胞分裂素6 - 芐基氨基嘌呤或激動(dòng)素有刺激多酚氧化酶活性提高的作用, 這在甘蔗的組織培養(yǎng)中表現(xiàn)十分明顯。在外植體最適宜的脫分化條件下, 分生能力強(qiáng)的細(xì)胞大量增殖, 酚類的氧化會受到抑制。在芽旺盛增殖時(shí), 褐變也被抑制。此外, 培養(yǎng)條件不適宜, 如溫度過高或光照過強(qiáng), 均可使多酚氧化酶的活性提高, 從而加速被培養(yǎng)組織的褐變。 培養(yǎng)時(shí)間過長接種后材料培養(yǎng)時(shí)間過長, 未及時(shí)轉(zhuǎn)移, 也會引起材料的褐變, 甚至導(dǎo)致全部死亡, 這在培養(yǎng)過程中是經(jīng)?？梢姷?。 2）、褐變的防止 選擇適當(dāng)?shù)耐庵搀w和

21、培養(yǎng)條件：選擇適當(dāng)?shù)耐庵搀w和培養(yǎng)條件是克服褐變的最主要的手段。外植體應(yīng)有較強(qiáng)的分生能力, 在最適宜的細(xì)胞脫分化和再分化的培養(yǎng)條件下, 使外植體處于旺盛的生長狀態(tài), 便可大大減輕褐變。 抗氧化劑的作用：在培養(yǎng)基中加入抗壞血酸、聚乙烯吡咯烷酮( PVP)、半胱氨酸等抗氧化劑, 或用抗氧化劑進(jìn)行材料的預(yù)處理或預(yù)培養(yǎng), 可減輕醌類物質(zhì)的毒害。 連續(xù)轉(zhuǎn)移：對于易褐變的材料, 進(jìn)行連續(xù)轉(zhuǎn)移, 可以減輕醌類物質(zhì)對培養(yǎng)物的毒害作用。 六、試管苗的增殖與繼代培養(yǎng) （一）、加快試管苗的繁殖速度 1、試管苗繁殖類型 試管繁殖類型共有五種：微型扦插型、叢生芽增殖型、器官發(fā)生型、胚狀體發(fā)生型、原球莖發(fā)生型，一定要注意其

22、遺傳穩(wěn)定性, 前三種途徑一般能保持遺傳穩(wěn)定性。 2、試管繁殖速率及計(jì)算 統(tǒng)計(jì)試管苗增殖速度, 有以苗為單位, 也有以芽或未生根的小莖作單位的, 以原球莖球狀體或胚狀體因難以統(tǒng)計(jì), 則以瓶為單位。大多數(shù)以芽和苗作單位。 試管苗理論上一年能繁殖多少, 可用下面的簡單公式計(jì)算: Y = mX n Y = 年繁殖數(shù) m = 無菌母株苗數(shù) X = 每個(gè)培養(yǎng)周期增殖的倍數(shù) n = 全年可增殖的周期次數(shù) 例如月季每5 周轉(zhuǎn)接一次, 甲品種每次增殖3 倍, 乙品種每次增殖5 倍, 丙品種每次增殖7 倍, 假定一開始都是一個(gè)芽, 那么這三個(gè)品種一年能繁殖多少呢? 根據(jù)公式可知: n =365d/35d= 10

23、.4 , 即每年可轉(zhuǎn)接10 次, 那么這三個(gè)品種年繁殖率分別計(jì)算如下: 甲品種Y = 131 0 = 59 000 = 5 .9104 乙品種Y = 151 0 = 9 760 000 = 9 .76106 丙品種Y = 171 0 = 282 000 000 = 2 .82108 從上可知甲品種每5 周轉(zhuǎn)接一次, 一年可繁殖出5 萬多苗, 乙品種每周期增殖5 倍, 一年可得900 多萬苗, 而丙品種每周期增殖7 倍, 一年可繁殖出2 億苗來。不過實(shí)際值遠(yuǎn)比理論值為低。因?yàn)閷?shí)踐中要受到多種因素制約, 困難很多。但理論計(jì)算可以作為一個(gè)計(jì)算產(chǎn)量的指標(biāo), 提供參考, 有它的積極意義。 3、提高繁殖速

24、度的方法 不僅試管苗的繁殖類型不同, 而且在試管內(nèi)又受到基因型、外植體來源、年齡、部位、培養(yǎng)基種類、附加成分和培養(yǎng)環(huán)境等多種因素的影響, 應(yīng)通過具體試驗(yàn)來摸索每種植物最快最好的繁殖方法。 1）、改進(jìn)培養(yǎng)基： 、不同的植物材料需要使用不同類型的培養(yǎng)基。 、糖具有維持培養(yǎng)基滲透壓的作用，在培養(yǎng)過程中植物組織不斷地從培養(yǎng)基中吸收糖，糖濃度降低，當(dāng)糖濃度不能維持正常滲透壓時(shí)，材料要轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中的維生素絕大部分為B族維生素，它們一各種輔酶的形式參與植物代謝活動(dòng)，影響形態(tài)發(fā)生、分化及試管苗的生長，為防植物缺乏，一般均加入。 、植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)在試管苗增殖中期決定性作用 A、促進(jìn)葉芽形成和生長

25、的激素：細(xì)胞分裂素抑制了植物的頂端優(yōu)勢，使得葉芽不斷分化和生長，逐漸形成芽叢，并促進(jìn)芽叢生長。大多植物最適用量為1.02.0，一般用量0.110.0。應(yīng)用最多的是6-BA,其次KT和2ip，ZT用的較少，因它的價(jià)格 太貴。對于微型扦插型繁殖可不加細(xì)胞分裂素或加0.1以下也可。除了細(xì)胞分裂素以外，還可加入低濃度的生長素，以促進(jìn)葉芽的生長，但要防止愈傷組織化。常用的有NAA,IBA,IAA，濃度在0.11.0。 在實(shí)際操作中高濃度細(xì)胞分裂素和低濃度生長素的配比，既能提高腋芽的增殖速度，也能保證腋芽健壯生長。如果細(xì)胞分裂素濃度過高生長素濃度過低，會形成過于細(xì)密的嫩芽，雖然提高了增殖速度，但苗多而弱，

26、降低了芽的質(zhì)量。但如果細(xì)胞分裂素過低，生長素過高，影響芽的增殖速度，甚至有時(shí)沒有側(cè)芽產(chǎn)生。B、誘導(dǎo)不定芽形成和生長的激素：除現(xiàn)有的芽之外, 任何器官上的, 通過器官發(fā)生重新形成的芽稱為不定芽。促進(jìn)外植體形成不定芽, 要使用一定量的細(xì)胞分裂素和生長素, 一般濃度不能過高。否則不但使器官分化能力降低, 而且也使遺傳性難以穩(wěn)定。 誘導(dǎo)外植體形成不定芽時(shí), 一般使用細(xì)胞分裂素的濃度高于生長素濃度的配比, 但也經(jīng)常采用細(xì)胞分裂素和生長素濃度的比值接近于1 的配比。 C、促進(jìn)胚狀體的形成和繁殖的激素：胚狀體途徑的優(yōu)點(diǎn)是增殖率高, 而且同時(shí)具有胚根和胚芽, 可免去生根?，F(xiàn)在胚狀體發(fā)生還不普遍或產(chǎn)生的胚狀體難

27、以成株或成株率太低, 以及遺傳性尚不穩(wěn)定, 故僅在有限植物中應(yīng)用。一般是在含有豐富還原氮的培養(yǎng)基上, 加有生長素, 特別是2 , 4 - D 以誘導(dǎo)胚狀體的發(fā)生, 然后轉(zhuǎn)移到降低濃度或沒有生長素的培養(yǎng)基上使其成熟、萌發(fā)和生長。 培養(yǎng)基中, 還可加入其他附加成分, 如氨基酸、水解乳蛋白( LH ) 300mg/ L500mg/ L、水解酪蛋白(CH) 200mg/ L500mg/ L, 以及腺嘌呤(ADE) 1mg/ L80mg/ L 等, 以促進(jìn)試管苗的生長。 2）、改善培養(yǎng)條件:試管苗增殖與培養(yǎng)條件如溫度、光照、濕度、培養(yǎng)器皿和培養(yǎng)基的pH值密切相關(guān), 需要進(jìn)行控制, 以促進(jìn)繁殖。 七、保持

28、試管苗的繼代培養(yǎng) 1、試管苗的繼代方法 1）、液體培養(yǎng) 2）、固體培養(yǎng) 2、影響試管苗繼代培養(yǎng)的因素及解決措施 1）、馴化現(xiàn)象：有些植物在開始的繼代培養(yǎng)中需要添加生長調(diào)節(jié)物質(zhì), 其后加入少量或不必加入生長調(diào)節(jié)物質(zhì)就可以生長, 此現(xiàn)象就叫做“馴化”。 2）、在長期的繼代培養(yǎng)中, 材料自身內(nèi)部要發(fā)生一系列的生理變化, 除了前面講的“馴化”現(xiàn)象外, 還會出現(xiàn)形態(tài)發(fā)生能力的喪失。 一般認(rèn)為分化能力衰退主要有三個(gè)因素: 第一、愈傷組織中含有從外植體啟動(dòng)分裂時(shí)就包括進(jìn)來的成器官中心（分生組織），當(dāng)重復(fù)繼代則會逐漸減少或喪失，這意味著不能形成維管束，只能保持無組織的細(xì)胞團(tuán)。 第二、形態(tài)發(fā)生能力的減弱和喪失也

29、可能與內(nèi)源生長物質(zhì)的減少或喪失有關(guān)。第三、也可能是細(xì)胞染色體出現(xiàn)畸變，數(shù)目增加或丟失。 3、影響繼代培養(yǎng)的其他因素 1）、植物材料的影響不同種類植物，同種植物不同品種，同一植物不同器官或不同部位繼代繁殖能力也不相同。一般是草本木本；被子植物裸子植物；年幼植物老年植物；剛分離植物已繼代植物；胚營養(yǎng)體植物；芽胚狀體愈傷組織。 2）、培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件適當(dāng)與否對能否繼代培養(yǎng)影響頗大，故常改變培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件來保持繼代培養(yǎng)。 3）、繼代培養(yǎng)時(shí)間長短關(guān)于繼代培養(yǎng)次數(shù)對繁殖率的影響的報(bào)道不一。有的材料長期繼代可保持原來的再生能力；有的經(jīng)過一定時(shí)間繼代后才有分化再生能力；而有的隨繼代時(shí)間加長而

30、分化再生能力降低。 4）、季節(jié)的影響植物材料能否繼代與季節(jié)有關(guān)。 一般能達(dá)到每月繼代310倍，即可用于大量繁殖，盲目追求過高增殖倍數(shù)一是所產(chǎn)小苗小而弱，給生根、移栽帶來很大困難，二是會引起遺傳性不穩(wěn)定，造成災(zāi)難性后果。 八、試管苗的生根與移栽 （一）試管苗的生根 1、試管內(nèi)生根 1）、根發(fā)生過程植物離體培養(yǎng)根的發(fā)生都來自不定根。根的形成從形成上可以分為兩個(gè)階段，即形成根源基和根源基的伸長及生長。前一階段根源基的形成包括第一次、第二次細(xì)胞橫分裂和第三次細(xì)胞縱分裂，細(xì)胞橫分裂能夠被生長素促進(jìn)。根源基的啟動(dòng)和形成約歷時(shí)48h，后一階段為細(xì)胞快速伸長階段，大約需2448h。根源基的形成和生長素有關(guān)，根

31、源基的伸長可以在沒有外源生長素下實(shí)現(xiàn)。 2）、影響試管內(nèi)生根的因素 （1）、植物材料不同植物、不同基因型、同一植株不同部位和不同年齡對分化根都有決定性因素。若試管里不生根不要完全從培養(yǎng)中去找原因，也應(yīng)在取材時(shí)考慮。不同植物的一般生根規(guī)律是：木本比草本難，成年樹比幼年樹難，喬木比灌木難。 （2）、基本培養(yǎng)基大多數(shù)使用低濃度的MS培養(yǎng)基，其中不少使用1/2MS或1/3MS +多可能不利于發(fā)根，生根需要P和K元素，但不培養(yǎng)基。大量元素中有人認(rèn)為NH 4 宜太多；而Ca2+多數(shù)報(bào)道有利于根的形成于生長。微量元素對生根有利的是B和Fe。生根通常用1%3%的蔗糖。 （3）植物生長調(diào)節(jié)劑據(jù)報(bào)道單用一種生長素

32、的占51.5%，生長素加激動(dòng)素占 20.1%。a、愈傷組織分化根時(shí)使用NAA最多，濃度以1.02.0為多。使用IAA+激動(dòng)素濃度范圍以1.04.0和0.010.02居多。b、而胚軸、莖段、插枝、花梗等分化根時(shí)，使用IBA居首位，濃度以1.01為多?？梢娚囵B(yǎng)多數(shù)使用生長素，大多以IAA、IBA、NAA單獨(dú)用或配合使用，或與低濃度激動(dòng)素配合使用。NAA與細(xì)胞分裂素配合時(shí)摩爾比在（2030）：1為好。一般赤霉素、細(xì)胞分裂素、乙烯通常不利于發(fā)根，如與生長素配合，一般濃度宜低于生長素，ABA可能有助于發(fā)根，植物生長延緩劑多效唑（MET）對不定根的形成也有良好作用，使用濃度0.14.0。（4）、使用方

33、法將生根材料先在一定濃度植物生長調(diào)節(jié)劑中浸泡或培養(yǎng)一段時(shí)間，然后轉(zhuǎn)入無植物生長調(diào)節(jié)劑培養(yǎng)基中培養(yǎng)，能顯著提高生根率。 （5）、其他物質(zhì)間苯三酚、脯氨酸、核黃素、活性炭等等。 （6）、繼代培養(yǎng)新梢生根能力隨繼代時(shí)間增長而能力增加，植物在培養(yǎng)初期不易生根。從試管苗長成的植株上去枝條比在一般植株上取的更易生根。（7）、光照強(qiáng)度和光照時(shí)間對生根的影響十分復(fù)雜，結(jié)果不一。 （8）、pH值一般在5.06.0。 （9）、溫度 16oC 25oC。 2、試管外生根 有些植物種類在試管內(nèi)難以生根，或有根但與莖維管束不相通，或根與莖聯(lián)系差，或有根無根毛，或吸收功能極弱不易成活，此時(shí)可采用試管外生根的方法，把生根和馴化過程聯(lián)系起來，即可大幅度降低成本，又可提高移栽成活率。試管外生根有三種方法： （1）、在試管內(nèi)誘導(dǎo)根源基再移栽 （2）、在生根小室進(jìn)行生根和煉苗做一個(gè)生根小室，不用瓊脂和蔗糖，而用 透氣又保濕的基質(zhì)如泥炭、蛭石、珍珠巖、苔蘚等，并要控制溫度、光照、采用人工噴霧，霧滴要細(xì)。 （3）、盆插和瓶插生根法用罐頭瓶或盆內(nèi)裝有泥炭或腐殖土與細(xì)沙，每瓶插入20株或30株無根苗，插入深度為0.31.2cm,加入1/2MS+1.05.0IBA或IAA生根液,，在一定溫度、光照及濕度下培養(yǎng)，容易生根