LFY類基因在莖端分生組織形成及其活動中的作用

1、北京大學政學者論文集（2001年） LFY類基因在莖端分子組織形成及其活動中的作用PAGE PAGE 407 LFY類基基因在莖莖端分生生組織形形成及其其活動中中的作用用Expreessiion Pattterrn oof LLFY-likke GGenee annd iits Funnctiion iin SShooot AApiccal Merristtem Acttiviity98級生命命科學學學院 細細胞生物物與遺傳傳學系 劉曼摘 要要 LFYY類基因因在植物物形態(tài)建建成過程程中具有有重要作作用，根根據(jù)其突突變體的的特征，曾曾一度被被認為是是在花分分生組織織和花序序分生組組織中特特異表

2、達達的“分生組組織特征征決定基基因”，控制制花序分分生組織織向花分分生組織織的轉變變。但隨隨著研究究的深入入，人們們發(fā)現(xiàn)其其在營養(yǎng)養(yǎng)分生組組織甚至至胚胎發(fā)發(fā)生過程程中都有有所表達達。本實實驗試圖圖通過啟啟動子活活動特點點研究、mRNA水平上原位雜交分析等各種方法，對其功能進行深入地探討，以期全面地認識該類基因在植物發(fā)育中的作用。Abstrractt LLFY-likke ggenees pplayy immporrtannt rrolee inn pllantt deevellopmmentt, wwhenn thhey werre ffirsst iisollateed ffromm muu

3、tannts of Anttirrrhinnum andd Arrabiidoppsiss, ttheyy weere thooughht tto bbe “SSAM-speeciffic-dettermminaatinng-ggenees”, reegullatiing thee trranssitiion froom iinflloreesceencee too flloweer mmeriisteem. Howweveer, furrtheer rreseearcch rreveealeed tthatt LFFY-llikee geeness aactiivitty ccan be f

4、ouund in embbryoogennesiis, shooot apiicess annd aaxilllarry bbudss att diiffeerennt sstagges as welll aas iin fflowwer priimorrdiaal. We chaaraccterrizeed LLFY proomotters aactiivitty aand invvesttigaatedd LFFY mmRNAA exxpreessiion witth WWholle-mmounnt iin ssituu Hyybriidizzatiion, inn orrderr too

5、 maake theeir funnctiion cleeareer. 引言 植物形態(tài)態(tài)建成有有與動物物形態(tài)建建成完全全不同的的特點：其完成成生活周周期所需需的地上上部分基基本器官官類型都都是由莖莖端分生生組織（shoot apical meristem, SAM）的活動而逐步形成的。因此，莖端分生組織在植物形態(tài)建成中的重要性是不言而喻的。但長期以來，雖然人們始終在努力，而且近十年來出現(xiàn)了分離得到莖端分生組織活動相關基因等重大的突破1，可目前在莖端分生組織的形成變化及其終結方式等基本問題方面卻仍然沒有得到合乎邏輯的解釋。根據(jù)突變體研究的早期結果，人們形成了目前占主導地位的觀點，即莖端分生組織在

6、“胚胎發(fā)生”過程中形成，隨后在“胚后發(fā)生”的過程中，被一些“分生組織特征決定基因”控制，逐步由“營養(yǎng)分生組織”改變?yōu)椤盎ㄐ蚍稚M織”和“花分生組織”2。但隨著研究的深入，人們逐漸發(fā)現(xiàn)，一些過去被認為是在“花分生組織”和“花序分生組織”中特異表達的“分生組織特征決定基因”，大部分都不用程度地在“營養(yǎng)分生組織”甚至“胚胎發(fā)生”過程中表達3-7。這些現(xiàn)象是現(xiàn)有的假說所無法解釋的。顯然，這些新的發(fā)現(xiàn)對現(xiàn)有的觀點提出了不可回避的挑戰(zhàn)。只有通過對這些基因表達特征及其功能的深入研究，我們才有可能真正從分子水平上逐步解釋莖端分生組織形成、活動及其終結的分子機理并從中逐步揭示莖端分生組織在植物形態(tài)建成中所扮演的

7、角色。 LFY類類基因正正是上述述基因中中的一種種。它的的突變導導致植物物表型發(fā)發(fā)生一系系列的變變化。在在野生型型植物體體中應發(fā)發(fā)育成花花的部位位，在llfy突突變體中中則發(fā)育育出花序序，或是是僅由萼萼片和花花瓣組成成的異常?；ā６襆FFY和AAPETTALAA1或AAPETTALAA2的雙雙重突變變體會導導致植物物的花完完全喪失失野生型型花所具具有的縮縮短節(jié)間間、頂端端有限生生長等特特點。根根據(jù)以上上種種現(xiàn)現(xiàn)象，當當LFYY類基因因從金魚魚草和擬擬南芥的的有關突突變體中中分離出出來時，被被認為其其在植物物發(fā)育中中控制莖莖端分生生組織從從花序分分生組織織轉變?yōu)闉榛ǚ稚M織2，88。但但隨

8、著該該基因的的同源序序列從其其他植物物中被陸陸續(xù)分離離，人們們發(fā)現(xiàn)在在煙草、鳳鳳仙花、豌豌豆、矮矮牽牛、水水稻、松松樹等植植物中，LFY類基因的表達并不局限于花分生組織，而是廣泛地存在于不同發(fā)育階段的莖端分生組織3-6，9，10。更重要的是，后來的研究表明，即使在擬南芥中，LFY基因實際上在其早期的發(fā)育階段，即在花序分生組織形成之前，已經(jīng)在莖端分生組織中表達11。同時，轉基因實驗表明，LFY基因表達量越大，植物開花越早12，13。因此，對該基因的功能又有了一種新的認識，即它不僅決定花序分生組織轉變?yōu)榛ǚ稚M織，而且還影響開花的早晚。 白書農(nóng)教教授等在在進行另另一種擬擬南芥突突變體eemf的的研

9、究中中，曾注注意到LLFY基基因在植植物早期期發(fā)育階階段表達達中的特特點，并并曾利用用LFYY:GGUS轉轉基因植植物為材材料，對對其在植植株“營養(yǎng)生生長”階段的的表達特特點進行行過系統(tǒng)統(tǒng)的研究究白書書農(nóng)等，未未發(fā)表資資料，119988。發(fā)發(fā)現(xiàn)LFFY基因因的啟動動子不僅僅在種子子萌發(fā)后后不同階階段的莖莖端分生生組織和和幼小的的器官原原基中表表達，而而且在早早期胚胎胎發(fā)生過過程中也也有表達達。最為為引人注注目的是是，LFFY基因因啟動子子的活動動與由根根外植體體再生植植株過程程中莖端端分生組組織的形形成及其其活動存存在直接接的相關關。據(jù)此此白書農(nóng)農(nóng)教授等等提出，LFY基因的表達很可能與莖端分生

10、組織的形成及其活動有關，而它表達量的增長水平和開花相關聯(lián)。 但是，有有研究表表明，以以GUSS等報告告基因所所顯示的的啟動子子活動模模式可能能并不一一定反映映該啟動動子對其其原有基基因表達達的時空空調(diào)節(jié)模模式。因因為基因因的表達達不單需需要啟動動子的活活動，還還和一些些其他因因子，例例如內(nèi)含含子等有有關。因因此，要要真正了了解LFFY基因因在分生生組織形形成與活活動過程程中的表表達特點點，還應應有對其其轉錄產(chǎn)產(chǎn)物即mmRNAA進行原原位檢測測的證據(jù)據(jù)。本課題即是是在本實實驗室過過去工作作的基礎礎上，試試圖從正正常植株株與組培培過程再再生植株株中LFFY啟動動子活動動方式的的檢測和和LFYY基因

11、轉轉錄產(chǎn)物物的直接接檢測兩兩個方面面，對LLFY類類基因早早期表達達特點及及其可能能的功能能等關鍵鍵問題進進行進一一步地探探討。本課題研究究中主要要涉及兩兩種基因因表達的的檢測技技術。當當研究LLFY啟啟動子活活動方式式時，我我們采用用報告基基因的表表達分析析方法。報報告基因因通常編編碼一個個在離體體條件下下易于檢檢測的酶酶，或者者編碼可可以在活活體條件件下進行行組織化化學定位位的蛋白白，這樣樣就可以以提供基基因表達達定量的的和定性性的信息息。guusA基基因是從從大腸桿桿菌（EEschheriichiia ccolii）中分分離出來來的，并并且目前前有一些些基因盒盒可以允允許在ggusAA基

12、因的的附近插插入啟動動子區(qū)，產(chǎn)產(chǎn)生轉錄錄融合基基因或翻翻譯融合合基因。我我們實驗驗所用的的Plffy:GUSS擬南芥芥和Pllfy:GUUS煙草草、Pnnfl:GUUS煙草草即是在在gussA基因因前插入入LFYY或NFLL基因的的啟動子子（Pllfy或或Pnffl），當當Plffy或Pnffl活動動時，帶帶動guusA表表達，利利用一個個簡單的的組織化化學檢測測就可以以精確地地分析ggusAA融合基基因的時時空表達達模式。用用5-溴溴-4-氯-33-吲哚哚葡糖苷苷酸（XX-gluuc）作作為底物物可以精精確地進進行GUUS活性性的定位位，這一一反應分分兩步進進行：首首先是切切割葡糖糖醛酸部部

13、分，產(chǎn)產(chǎn)生無色色的吲哚哚氧基中中間產(chǎn)物物，隨后后吲哚氧氧基中間間產(chǎn)物氧氧化成為為不溶的的藍色沉沉淀。用用GUSS進行這這類實驗驗有如下下優(yōu)點：（1）在在大多數(shù)數(shù)植物組組織中GGUS活活性的本本底低；（2）反反應產(chǎn)物物不擴散散，在表表達基因因的植物物細胞內(nèi)內(nèi)積累；（3）通通過簡單單的擴散散或真空空滲入，底底物易被被植物細細胞吸收收。當然然，也存存在一些些缺點：（1）組組織化學學染色后后植物失失去繼續(xù)續(xù)培養(yǎng)的的可能，這這樣不能能跟蹤檢檢測同一一株植物物不同時時期的基基因活動動情況；（2）由由于酶和和產(chǎn)物非非常穩(wěn)定定，因而而不能真真實的反反映出GGUS替替代的那那個蛋白白在穩(wěn)定定狀態(tài)下下的豐度度；（

14、33）人們們發(fā)現(xiàn)在在GUSS表達水水平很高高的組織織中會發(fā)發(fā)生無色色反應中中間產(chǎn)物物滲漏的的現(xiàn)象，但但是，這這可以通通過在底底物溶液液中加入入氧化劑劑高鐵氰氰化鉀或或亞鐵氰氰化鉀或或者二者者都加（終終濃度為為5mmmol/L），來來使這種種滲漏減減至最少少（Sttompp 19990; Maasarrenhhas和和Hammiltton 19992）；（4）同同所有的的組織化化學方法法一樣，其其檢測結結果不是是定量的的。而且且，最致致命的缺缺點是，啟啟動子的的分析不不一定總總能反映映基因的的真實活活動情況況（如前前文所述述），這這是在運運用報告告基因方方法進行行基因表表達特征征分析時時必須注注

15、意的一一個問題題。當檢測LFFY基因因的轉錄錄產(chǎn)物時時，我們們用到了了原位雜雜交 （in situ Hybridization, 簡稱ISH）技術。該技術最早是由Gall和Pardue (1 969)及John等 (1 969)獨立發(fā)明的。其基本原理是根據(jù)核酸分子堿基互補配對的原則 （A-T, C-G）,將有放射性或非放射性標記的外源核酸 (探針：Probe )與染色體上經(jīng)過變性后的單鏈DNA互補配對 ,結合成專一的核酸雜交分子 ,再經(jīng)一定的檢測手段 ,將待測核酸在染色體上的位置顯示出來。我們采用的的mRNNA水平平的原位位雜交技技術，是是將含有有目的基基因cDDNA的的質粒分分別用限限制性內(nèi)

16、內(nèi)切酶從從目的片片斷的兩兩端單切切，使質質粒線性性化。然然后從兩兩端用不不同的轉轉錄酶按按照A-U, C-GG的互補補配對原原則合成成一段RRNA片片斷，其其中UTTP上標標記地高高辛，這這標記上上的RNNA片斷斷即為探探針。當當目的基基因表達達時，mmRNAA能和反反義探針針特異性性結合，在在底物的的作用下下顯色。而而正義探探針為負負對照。由由于 RRNA原原位雜交交技術能能夠精確確確定基基因表達達的時空空分布，而而植物基基因的時時空表達達研究是是探討植植物生長長發(fā)育機機制的重重要手段段，所以以在以研研究植物物發(fā)育機機制為主主的本實實驗室，原原位雜交交成為一一項主要要的并十十分關鍵鍵的技術術

17、。 目目前植物物研究中中，原位位雜交得得到了越越來越廣廣泛的應應用，主主要有 3種方方法 :一是常常規(guī)組織織切片RRNA原原位雜交交，廣泛泛適用于于各種組組織 ;二是大大量細胞胞的整體體RNAA原位雜雜交 ,已應用用于花粉粉管和藻藻類合子子;三是是微量細細胞的整整體RNNA原位位雜交 ,用于于分離胚胚囊。我我所使用用的整體體原位雜雜交技術術，是一一種較新新的組織織RNAA原位雜雜交方法法。該方方法的實實驗材料料是具有有完整形形態(tài)結構構的植物物器官或或其組合合，如花花、花序序等。該該技術能能夠直接接從整體體結構上上觀察到到基因表表達的空空間特征征，具有有易操作作、周期期短等特特點，并并避免了了一

18、般在在切片上上原位雜雜交所需需的三維維重構步步驟。材料和方法法實驗材料 植物材料料野生型擬南南芥種子子（Coolummbiaa）Plfy:GUUS轉基基因擬南南芥種子子（由DDetllef Weiigell提供）野生型煙草草種子（Nicotiana tabacun var. Wisconsin 38）Plfy:GUUS轉基基因煙草草種子（由由本實驗驗室畢業(yè)業(yè)博士生生劉復權權構建、提提供） 菌種和質質粒大腸桿菌DDH5質粒：Pnnfl:GFFP (Kaan RR )Plfy:anntiLLFY(Kann R )PDW1224-LLFY (Ammp RR )以上質粒均均由本實實驗室已已畢業(yè)博博士生

19、劉劉復權構構建，本本實驗室室保存。 分子生物物學和生生化試劑劑各種限制性性內(nèi)切酶酶購自TTaKaaRa 公司，PPCR試試劑購自自鼎國生生物公司司，原位位雜交地地高辛標標記RNNA探針針試劑盒盒及雜交交液（DDIG eassy HHyb）購購自Roochee生物公公司，各各種激素素和抗生生素以及及x-GGlucc購自北北京經(jīng)科科生物工工程公司司，其他他試劑均均為國產(chǎn)產(chǎn)分析純純。 PCR引引物 以GGFP基基因為模模板的PPCR引引物由本本人設計計，上海海生工生生物工程程公司合合成。 5GFFP (21bbp):5-GGTT GAAA GGGT GATT GCCA AACA TACC-3 3GF

20、PP (118bpp):55-GGAA AGGG GCCA GGAT TGTT GTTG-33 1.55 x-Gluuc 染染色液(1mLL) N、N二甲甲基甲酰酰胺 50uL x-GGlucc 0.55mg 1000mM 磷酸緩緩沖液 pH77.0 9980uuL 5mMM 鐵氰氰化鉀 10uuL 5mMM 亞鐵鐵氰化鉀鉀 110uLL Triitonn x-1000 1uuL 1.66 植物物葉綠素素透明液液 乙醇醇：乙酸酸=9：1 1.77 培養(yǎng)養(yǎng)基 1.7.11 擬南南芥、煙煙草組織織培養(yǎng)基基 MS (含3%的蔗糖糖和0.75%的瓊脂脂，調(diào)ppH=55.8)愈傷組織誘誘導培養(yǎng)養(yǎng)基（CC

21、alllus-Indduciing Meddiumm, CCIM）: B55+0.5mgg/L 2,44-D + 00.055mg/L KKIN (含2%的蔗蔗糖和00.755%的瓊瓊脂，調(diào)調(diào)pH=5.55)生芽培養(yǎng)基基（Shhoott-Innduccingg Meediuum, SIMM）: B55+0.15mmg/LL IAAA + 5mmg/LL2ipp (含2%的蔗蔗糖和00.755%的瓊瓊脂，調(diào)調(diào)pH=5.55) 1.7.22 細菌菌培養(yǎng)基基 LB培養(yǎng)養(yǎng)基：每每升培養(yǎng)養(yǎng)基含55克酵母母提取物物，100克蛋白白胨，110克氯氯化鈉，pH=7.5，固體培養(yǎng)基含1%瓊脂 1.8 原原位雜交

22、交所需試試劑 PBBS: 0.113M NaCCl, 0.0007MM Naa2HPOO4 ,00.0003M NaHH2 POO4 , 0.227mMM KCCl, pH 7.44 PBBT: PBSS+0.1% Tweeen 20 固定定液 (FB): PPBT+0.008M EGTTA, 5%多多聚甲醛醛, 110% DMSSO (pH 7.44) NTTE: 5000mM NaCCl, 10mmM TTriss-HCCl (pH77.5), 11mM EDTTA 封阻阻液 (BS): PPBT+ 2% BSSA 滲入入液 (SB): 1100mmM NNaCll, 550mMM Mgg

23、Cl22 , 1000mM Triis-HHCl (pHH9.55), 0.11% TTweeen 220 停止止?jié)B入液液 (SSSB): PPBT+20mmM EEDTAA 主要方法2.1 質質粒載體體構建部部分2.1.11 原質質粒的酶酶切將Plfyy:aantiiLFYY，Pnffl:GFPP用XbaaI和SaccI雙切切，得到到Plffy-載載體和GGFP片片斷。2.1.22 從凝凝膠中分分離純化化DNAA片段(1) 切切下含有有DNAA片段的的膠塊，轉轉移到11.5 ml 離心管管中, 于700溫育直直至膠完完全融化化. 加11 mll 樹脂脂(reesinn), 混合220秒.(2

24、) 去去掉注射射器上的的推進器器，將MMiniicollumnn安上。(3) 將將樹脂/DNAA混合液液移入注注射管中中，慢慢慢插入推推進器，輕輕輕將懸懸浮液推推進Miiniccoluumn中中。(4) 從從Minnicoolummn去掉掉注射器器，取出出推進器器。再安安注射管管于Miiniccoluumn上上。加22m1的的80%異丙醇醇于注射射管中洗洗Minnicoolummn。插插入推進進器，緩緩慢將異異丙醇推推過Miiniccoluumn。(5) 去去掉注射射器，將將Minnicoolummn放在在1.55ml離離心管中中，離心心2分鐘鐘，使樹樹脂/DDNA干干燥。(6) 將將Minn

25、icoolummn移入入一個新新的離心心管，加加50uul水或或TE，放放置1分分鐘，離離心200秒，溶溶下DNNA片段段。(7) 仍仍掉Miiniccoluumn.純化的的DNAA儲藏于于4或-220。2.1.33 連接接在冰上建立立如下連連接體系系: 2*TT4 DDNA連連接酶BBufffer 5uuL PPlfyy-載體 11uL GGFP 33uL TT4 DDNA連連接酶 11uL輕輕混勻后后，4連接過過夜。 2.11.4 大腸桿桿菌DHH5感受態(tài)態(tài)細胞的的制備(1) 從從LB平板板上挑取取E.ccolii DHH5單菌落落接種于于2mLL LBB液體培培養(yǎng)基中中，377振蕩培培養(yǎng)

26、過夜夜，取1100-2000uL菌液于于2mLL LBB中，337振蕩培培養(yǎng)2-3小時時后全部部轉入1100LLB中，337振蕩培培養(yǎng)2-3小時時至對數(shù)數(shù)生長期期(ODD6000=0.4左右右)。 (2) 無菌條條件下轉轉入1.5mLL Epppenndorrf，冰冰浴100minn。(3) 4 40000rrpm 8miin，回回收細胞胞。(4) 用用4000uL冰冰預冷的的CaCCl2 (00.1MM)重懸懸沉淀，置置于冰上上15-30mmin。(5) 4 40000rrpm 8miin，回回收細胞胞。(6) 用用1000uL冰冰預冷的的CaCCl2 (00.1MM)重懸懸沉淀，備備用。

27、2.11.5 轉化(1) 1100uuL感受受態(tài)細胞胞中加入入1.55uL質質粒，輕輕輕旋轉轉，混勻勻內(nèi)容物物，冰上上 置300minn。 (2) 42水浴900s，不不要擺動動試管。 (3) 快速將將試管轉轉移至冰冰上，冷冷卻2mmin。 (4) 每管加加入2000uLL LBB，377振蕩455minn1hhr。 (5) 涂板(KKan)。 (6) 至液體體完全吸吸收后，倒倒置平板板，377培養(yǎng)。 2.1.66 提質質粒 用用小量堿堿法提取取質粒：取1.5mmL菌液液轉移至至Epppenddorff管，于于4，1220000rpmm離心330”。(2)吸去去上清，空空氣干燥燥沉淀。沉沉淀懸

28、浮浮于1000ull溶液中（225mMM Trris-HCll pHH8.00, 110mMM EDDTA, 500mM葡葡萄糖）中中，振蕩蕩混勻室室溫放置置5分鐘鐘。(3)假如如2000ul溶液液（0.22M NNaOHH, 11%SDDS），放放冰浴中中5分鐘鐘。(4)再加加入1550ull溶液（3M NaAAc, pH44.8），放放冰浴中中5-110分鐘鐘，1220000rpmm 4離心55分鐘。取取上清加加等量酚酚：氯仿仿，振蕩蕩，4，1220000rpmm 2分分鐘。(5)取上上清加22倍體積積乙醇，振振蕩，置置2分鐘鐘。(6)4，1220000rpmm 2分分鐘，吸吸去上清清，瀝

29、干干。(7)加11mL 70%乙醇洗洗滌2次次。(8)用550ull TEE溶解（加加入1uul RRnasse）。 2.1.77 酶切切鑒定及及PCRR鑒定 所所用限制制性內(nèi)切切酶及PPCR引引物如前前2.11.1及及1.44所述。 2.2 GGUS活活性的組組織化學學定位部部分 2.2.1 組織培培養(yǎng)(1)將植植物長出出兩周的的主根切切下成55-100mm的小小段，轉轉移至CCIM中中誘導其其長愈傷傷。(2)三周周后，將將愈傷組組織轉移移至SIIM中誘誘導其長長芽。(3)設未未轉基因因植物作作負對照照，對照照和處理理之間的的培養(yǎng)條條件要完完全一致致。(4)不論論在CIIM中還還是在SSIM

30、中中，培養(yǎng)養(yǎng)基要每每1-22周續(xù)代代一次，及及時更新新。(5)注意意大量培培養(yǎng)，在在由CIIM轉移移至SIIM的同同時，應應保留一一部分材材料作CCIM續(xù)續(xù)代，以以此作為為SIMM培養(yǎng)下下的處理理的另一一種對照照。(6)實驗驗過程中中特別要要注意無無菌操作作！ 2.22.2 GUSS活性檢檢測(1)當植植物的根根在CIIM中培培養(yǎng)時，每每隔2-3天作作一次GGUS組組織化學學染色進進行跟蹤蹤監(jiān)測。(2)當愈愈傷組織織在SIIM中培培養(yǎng)時，每每隔一周周左右作作一次檢檢測。等等到長出出再生芽芽和再生生根時，切切下芽和和根分別別作檢測測。(3)未轉轉基因的的對照必必須和處處理始終終同步進進行。(4)

31、設置置重復，至至少3-5次。(5)具體體方法：無菌操作，將將要檢測測的植物物部位小小心切下下來，轉轉入GUUS染液液，使材材料和染染液的體體積比1:55。真空處理22-100分鐘。放入37恒溫箱箱中溫育育12-16小小時。待GUS滲滲入材料料中后，材材料轉入入透明液液中透明明，放置置于室溫溫下3小小時。 22.2.3觀察察和照像像 經(jīng)透明明處理后后的植物物材料在在Mottic 解剖鏡鏡下觀察察，有GGUS表表達的部部位顯 現(xiàn)穩(wěn)穩(wěn)定、不不溶于透透明液的的藍色。解解剖鏡上上接理光光XR-X 220000相機照照相， 相片片通過AAcerr SccanPPrissa 6640UU型掃描描儀輸入入電腦

32、，由由Adoobe Phootosshopp 6.0 作適適當處理理。2.3 整整體原位位雜交2.3.11 探針針標記 限制性性內(nèi)切酶酶消化質質粒LFY：aantiisennse BaamH11Sensee KpnnI(1)377C 消消化2小小時，電電泳檢查查線性化化是否完完全；(2)加等等體積酚酚-氯仿仿，混勻勻；(3)1220000轉離心心10分分鐘，收收集上清清，(4)加22倍體積積無水乙乙醇（預預冷），混混勻，-20CC，300分鐘；(5)1220000轉離心心10分分鐘，棄棄上清，(6)加770%乙乙醇（預預冷），棄棄上清，(7)真空空干燥，沉沉淀溶于于10微微升無菌菌水中；(8)

33、電泳泳檢測。體外轉錄(1)每個個反應體體系內(nèi)含含：模板4微升升，5*緩沖液液4微升升，DTTT2微微升，RRNA Bloock 1uLL，5*NTPP 4微升升，Poolymmeraase 2微升升，DEEPC-H2OO 3微微升。337C 2小時時。LFY： anttiseensee T33Sensee T7(2)Dnnasee I 于377C處理理15分分鐘以除除去模板板，每個個體系加加 2.5微升升的3MM NaaAc和和75微微升的預預冷的無無水乙醇醇，-220C 過夜，(3)4CC 下離離心155分鐘，1130000轉；(4)700%預冷冷的乙醇醇沉淀一一次，吹吹干后溶溶于500微升

34、DDEPCC-trreatted H2OO。堿性水解(1)500微升探探針加550微升升碳酸緩緩沖液，660C 水解，LFY45分鐘， 每管加10微升5%乙酸，置冰上；(2)每管管加111微升的的3MnnaAcc，2000微升升預冷無無水乙醇醇，-220C 過夜；(3)4CC 下離離心155分鐘，1120000轉；(4)700%預冷冷的乙醇醇沉淀一一次，吹吹干后溶溶于500微升甲甲酰胺。2.3.22 原位位雜交(1)固定定FB 330miin甲醇 22次 55minn乙醇 4次 55minn(2)雜交交預處理理乙醇 2次次 2mmin1:1 乙乙醇:二甲苯苯 330miin乙醇 2次 5mii

35、n甲醇 2次次 55minn1:1 甲甲醇:PPBT 100minnPBT+55%甲醛醛 30mminPBT 3次 22minnPBT+440ugg/mLL 蛋白白酶K 110-115miinPBT+00.2% 甘氨氨酸 5miinPBT 2次 22minnPBT+55% 甲甲醛 30mminPBT 4次 2miin1:1 PPBT:HS 110miinHS 2次 22minn預雜交 22hr 60(3)雜交交400uLL HSS + 3uLL RNNA pprobbe + saalmoon ttestts DDNA (1000ugg/mLL)（探針和ssalmmon tessts DNAA預

36、先885變性55minn）16-200hr 60(4)雜交交后處理理HS 22次 330miin 551:1 HHS:NNTE 600minnNTE 600minnNTE 2mminNTE+440ugg/mLL Rnnasee A 45mmin 37NTE 15mmin 37NTE 55次 15mmin1:1 NNTE:PBTT 200minnPBT 2mminBS 至少330miin(5)檢測測anti-DIGG抗體處處理等量混合固固定后的的和新鮮鮮材料+少量冰冰冷900%丙酮酮，液氮氮中磨成成細粉加入更多990%丙丙酮，使使勁混合合均勻，44儲存過過夜13,0000g 5miin離心心，棄

37、上上清。在在少量990%丙丙酮中重重懸沉淀淀，將沉沉淀分散散于一濾濾紙上，風風干在30mgg干粉中中加入4400uuL BBS和220uLL annti-DIGG Faab ffraggmennt，室室溫黑暗暗中244hr10,0000離心心3miin信號檢測BS 1000uLL中加入入1uLL e中中上清，44過夜新鮮BS 110miinPBT 4次 60miinSB 2次 5mmin1mL中加加入8uuL RRochhe公司司的niitroo bllue tettrazzoliium chlloriide + 55-brromoo-4-chlloroo-3-inddolyyl-pphoss

38、phaate 5-660miin黑暗暗中顯色色顯色完畢后后用SSSB終止止反應 (6)觀察和和照像用甘油:PPBS 7:33 溶液液封片，在在OLYMMPUSS顯微鏡鏡下觀察察并照像像，相片片通過AAcerr SccanPPrissa 6640UU型掃描描儀輸入入電腦，由由Adoobe Phootosshopp 6.0作適適當處理理。 實驗結果擬南芥中LLFY啟啟動子活活動特點點的驗證證 白書農(nóng)農(nóng)教授等等早年曾曾利用PPlfyy:GGUS轉轉基因擬擬南芥為為材料，系系統(tǒng)檢測測過在植植物發(fā)育育早期的的SAMM中和以以根為外外植體的的植株再再生過程程中Pllfy的的活動特特點。我我首先重重復了該該

39、實驗，以以便熟悉悉各個步步驟和操操作，同同時也進進一步驗驗證該實實驗的可可重復性性。 實實驗方法法如2.2中所所述，結結果見圖圖1所示示。早在在幼苗長長出的第第二天，GUS活動就在SAM中表現(xiàn)出來（圖1-A）。而在莖的其他部位、成熟的葉片和根中，沒有Plfy的活動（圖1-B）。為了避免SSAM中中已存在在的GUUS活性性干擾，本本實驗以以無GUUS活動動的根為為外植體體進行植植株再生生。當將將根移入入CIMM中誘導導愈傷時時，第二二天就在在成熟根根外周區(qū)區(qū)域有細細胞分裂裂的地方方發(fā)現(xiàn)了了微弱的的GUSS表達（圖圖1-DD）。且且隨著愈愈傷的生生長，GGUS活活性逐漸漸提高（圖圖1-EE至圖11

40、-J）。本實驗的結結果再次次驗證了了在擬南南芥中，Plfy在早期即定位表達于SAM中，且在根外植體再生過程中有Plfy的活動。因為植株再生過程中涉及到SAM的重組，我們由以上兩點推測Plfy的表達與SAM的形成與活動直接相關，但這個假設尚需進一步的實驗結果驗證。通過本實驗，我熟練掌握了植物組織培養(yǎng)、GUS組織化學染色解剖觀察和照相等各項實驗技能，為進一步的工作打下了基礎。LFY啟動動子在煙煙草中與與在擬南南芥中有有相同的的活動特特點 為了了驗證PPlfyy在擬南南芥中的的上述表表達特點點是否具具有普遍遍性，我我又利用用Plffy:GUSS轉基因因煙草為為材料，用用與擬南南芥同樣樣的方法法分析P

41、Plfyy在早期期SAMM和根外外植體植植株再生生過程中中的活動動特點。實實驗結果果如圖22所示。與與擬南芥芥相似的的是，轉轉基因煙煙草的早早期SAAM（圖22-A、2-B）和再再生芽原原基（圖圖2-CC、2-D、2-E）以及及再生芽芽分生組組織區(qū)域域（圖22-F、2-G、22-H）中中都有明明顯的GGUS表表達，但但轉基因因煙草也也具有自自己的特特點，即即在莖尖尖中所檢檢測到的的GUSS染色水水平與同同時期的的擬南芥芥相比偏偏低，而而且用現(xiàn)現(xiàn)有的方方法，未未能檢測測到早期期愈傷中中的GUUS活動動。 這個個實驗證證明，LLFY基基因在植植物幼苗苗SAMM和葉原原基、芽芽原基中中的表達達特點是

42、具有普普遍性的的。而煙煙草早期期愈傷中中未能如如擬南芥芥那樣檢檢測到GGUS反反應活 性，估估計可能能因為PPlfyy在煙草草中活動動強度太太低，但但該推測測尚需進進一步的的實驗驗驗證。RNA水平平上的LLFY表表達特征征與GUUS檢測測結果相相同考慮到現(xiàn)有有的文獻獻中所述述現(xiàn)象，啟啟動子的的研究不不能完全全反映基基因的真真實表達達情況（詳詳見引言言部分），要要想清楚楚地研究究其功能能，我們們必須直直接檢測測該基因因的轉錄錄產(chǎn)物。所所以我試試圖用RRNA水水平整體體原位雜雜交的方方法，在在擬南芥芥不同發(fā)發(fā)育階段段SAMM中和根根外植體體植株再再生過程程中對LLFY基基因的轉轉錄產(chǎn)物物進行直直接

43、檢測測和定位位。如果果LFYY基因確確實在RRNA水水平上存存在與啟啟動子相相同的表表達特點點，則表表明啟動動子分析析結果是是可靠和和有意義義的，從從而進一一步驗證證了我們們關于LLFY基基因功能能的假說說。否則則，則表表明過去去啟動子子分析的的結果未未能反應應實際基基因表達達的狀況況。詳細流程如如實驗方方法中所所述。首首先，要要想取得得好的原原位雜交交結果，先先需要一一個高質質量的探探針。我我用BaamHII和KpnnI雙切切pDWW1244-LFFY質粒粒，切出出LFYY基因，檢檢測了該該質粒的的正確性性。然后后用BaamHII和KpnnI分別別從兩端端單切，使使質粒線線性化。結結果如圖圖

44、1.11所示。轉轉錄后結結果見11.2，水水解后結結果見11.3所示示。 圖1：探針針制備電電泳圖譜譜1.1: 質粒酶酶切圖譜譜Lane 1: DL220000 DNNA MMarkker Lanne 22: LLFY/BammHI+KpnnI ，小小片段即即為切出出的LFFY基因因 Laane 3: LFYY/KppnI，已已線性化化完全 Lanne 44: LLFY/BammHI，已已線性化化完全 Lanne 55: LLFY質質粒對照照2: 轉錄錄后電泳泳圖譜（未未經(jīng)Dnnasee處理）Lane 1: LFYY/KppnI （T7轉錄錄酶） Lanne 22: LLFY/BammHI（T

45、3轉錄錄酶） Lanne 33: CConttroll 箭頭頭所示為為轉錄出出的RNNA條帶帶3: 水解解后電泳泳圖譜Lane 1: DL220000 DNNA MMarkker LLanee 2: LFFY/KKpnII Laane 3: LFYY/BaamHII Lanne 44: CConttroll 箭頭頭所示為為水解后后的RNNA小片片段 雜雜交結果果見圖版版3。AA-D顯顯示的是是擬南芥芥發(fā)育過過程中的的LFYY基因表表達狀況況。7天天大小、114天大大小的擬擬南芥幼幼苗以及及花序中中，LFFY基因因的表達達定位于于莖端分分生組織織和葉原原基、花花芽原基基中，而而在莖的的其他部部分

46、、花花梗、成成熟的葉葉片中，檢檢測不到到LFYY的表達達信號。 同同樣以無無LFYY活動的的根為外外植體進進行植株株再生，現(xiàn)現(xiàn)已檢測測到在CCIM中中培養(yǎng)44天的根根外植體體細胞分分裂旺盛盛的部位位中的LLFY表表達信號號（圖44-E、圖44-F）。后后續(xù)的檢檢測工作作正在進進一步進進行。 值值得注意意的是，用用原位雜雜交和用用GUSS組織化化學染色色檢測的的結果顯顯示，LLFY的的活動和和LFYY啟動子子的活動動確實是是一一對對應的（至至少現(xiàn)有有的結果果說明了了這一點點），這這初步證證明了過過去取得得的Pllfy活活動結果果具有一一定的可可靠性。Plfy:GFFP載體體的構建建 在在Plff

47、y:GUSS擬南芥芥根外植植體植株株再生過過程中，愈愈傷組織織中可發(fā)發(fā)現(xiàn)明顯顯的GUUS活動動，至于于有GUUS活動動的部位位是否會會出芽，目目前還不不得而知知，因為為組織化化學染色色將殺死死細胞，失失去繼續(xù)續(xù)培養(yǎng)、跟跟蹤觀察察的可能能。也就就是說在在莖端分分生組織織形成之之前，我我們觀察察到了LLFY的的活動；在莖端端分生組組織形成成之后，我我們又觀觀察到了了LFYY基因的的特異表表達。但但是莖端端分生組組織的這這團細胞胞是否來來自莖端端分生組組織形成成前有LLFY活活動的細細胞，目目前還沒沒有直接接的證據(jù)據(jù)。針對對這一問問題，我我打算構構建Pllfy:GFFP載體體并將其其轉入擬擬南芥，從

48、從而能在在熒光下下跟蹤檢檢測Pllfy的的活動。如如果Pllfy活活動部位位和出芽芽部位確確有一致致性，則則為我們們的假設設提供了了一個有有力的證證據(jù)。 目目前手頭頭上已具具有Pllfy:anntiLLFY和和Pnffl:GFPP質粒，在在anttiLFFY和GFPP兩側均均有XbbaI和和SaccI的酶酶切位點點，我用用這兩種種限制性性內(nèi)切酶酶將這兩兩種質粒粒切開，從從瓊脂糖糖凝膠上上準確切切下載體體-Pllfy片片斷和GGFP片片斷，再再將二者者進行連連接。 首首先，我我用酶切切的方法法和PCCR的方方法檢測測了Pllfy:anntiLLFY和和Pnffl:GFPP兩個質質粒的正正確性。對

49、對于Pllfy:anntiLLFY，Plffy是構構建新載載體需要要的片段段，anntiLLFY卻卻是要用用酶正確確切下以以便置換換的片段段，所以以圖3.1，3.22分別對對Plffy和anttiLFFY進行行了檢測測，切出出的Pllfy 1Kbb左右，aantiiLFYY 1.4Kbb左右，均均和預期期相符。而而對于PPnfll:GGFP，GFPP既是新新載體需需要片段段，又是是要用酶酶切下的的，而PPnfll并沒有有什么作作用，所所以只用用檢測GGFP就就夠了，這這里用了了酶切和和PCRR兩種方方法，切切出的GGFP 7500bp左左右，PPCR條條帶5000bpp左右，和和預期相相符。分

50、分別如圖圖3.33，3.44所示。由由圖可見見，這兩兩個質粒粒均是可可用的。 連連接后，對對重組載載體進行行篩選。圖圖3.55顯示酶酶切鑒定定Plffy的結結果，切切出的片片段大小?。?KKb左右右）與預預期相符符，而且且通過和和Plffy:anttiLFFY酶切切后的結結果并排排跑電泳泳，更充充分證明明了切出出的小片片段確實實是來自自于Pllfy:anntiLLFY的的Plffy。同同理，圖圖3.66，3.77通過與與Pnffl:GFPP并排作作酶切、跑跑電泳，證證明了切切出的小小片段是是來自于于Pnffl:GFPP的GFPP。Plffy:GFPP質粒構構建成功功。 圖3：質粒粒Plffy:

51、GFPP的構建建圖3.1: 檢測測Plffy:anttiLFFY (Plffy)Lane 1: DNAA/EccoRII+HiindIIII DNAA Maarkeer LLanee 2: Pllfy:anntiLLFY plaasmiid LLanee 3: Pllfy:anntiLLFY/EcooRI+XbaaI LLanee 4: Pllfy:anntiLLFY/EcooRI+XhooI LLanee 5: Pllfy:anntiLLFY/EcooRI+KpnnI LLanee 6: Pllfy:anntiLLFY/PsttI+XXbaII Laane 7: Plffy:anttiLFF

52、Y/PPstII+XhhoI Lanne 88: PPlfyy:aantiiLFYY/PsstI+KpnnI LLanee 9: DLL20000 DDNA Marrkerr圖3.2: 檢測測Plffy:anttiLFFY（anttiLFFY）Lane 1: DNAA/EccoRII+HiindIIII DNAA Maarkeer LLanee 2: Pllfy:anntiLLFY質質粒 LLanee 3: Pllfy:anntiLLFY/XbaaI+SSacII Laane 4: Plffy:anttiLFFY/XXhoII+SaacI Lanne 55: PPlfyy:aantiiLFYY

53、/KppnI+SaccI LLanee 6: Pllfy:anntiLLFY/XbaaI+BBamHHI LLanee 7: Pllfy:anntiLLFY/XhooI+BBamHHI LLanee 8: Pllfy:anntiLLFY/KpnnI+BBamHHI LLanee 9: DLL20000 DDNA Marrkerr圖3.3：檢測PPnfll:GGFP（GFPP）Lane 1: DL220000 DNNA MMarkker Lanne 22: PPnfll:GGFP/XbaaI+SSacII Laane 3: Pnffl:GFPP質粒圖3.4：檢測PPnfll:GGFP（GFPP）

54、Lane 1: 以無菌菌水為模模板的PPCR產(chǎn)產(chǎn)物（負負對照） Lane 2: 正對照 Lane 3: 以Pnfl:GFP為模板的PCR產(chǎn)物 Lane 4: DL2000 DNA Marker圖3.5: 新構構建的PPlfyy:GGFP酶酶切鑒定定（檢測測Plffy）Lane 1: Plffy:anttiLFFY質粒粒 Laane 2: 新構建建的Pllfy:GFFP質粒粒 Laane 3: Plffy:anttiLFFY/PPstII+XbbaI Lanne 44: PPlfyy:GGFP/PsttI+XXbaII Laane 5: Plffy:GFPP/PsstI+BammHI Lanne

55、 66: PPlfyy:aantiiLFYY/EccoRII+XbbaI Lanne 77: PPlfyy:GGFP/EcooRI+XbaaI LLanee 8: Pllfy:GFFP/EEcoRRI+BBamHHI LLanee 9: DLL20000 DDNA Marrkerr圖3.6: 新構構建的PPlfyy:GGFP酶酶切鑒定定（檢測測GFPP）Lane 1: Pnffl:GFPP質粒 LLanee 2: Pnnfl:GFFP/XXbaII+SaacI Lanne 33: PPlfyy:GGFP/XbaaI+SSacII Laane 4: Plffy:GFPP質粒圖3.7: 新構構建的PPlfyy:GGFP PCRR鑒定（檢檢測GFFP）Lane 1: DL220000 DNNA MMarkker Lanne 22: PPlfyy:GGFP PCRR產(chǎn)物 LLanee 3: Pnnfl:GFFP PPCR 產(chǎn)物 Lanne 44: 以以水為模模板的PPCR結結果 LLanee