細(xì)胞工程-3 動物細(xì)胞培養(yǎng)(2)課件

1、動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)2（一）常用的培養(yǎng)方法懸滴培養(yǎng)Hangingdrop cultivation培養(yǎng)瓶培養(yǎng)旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)Rotate tube cultivation克隆培養(yǎng)法Cloning culture technique細(xì)胞同步化培養(yǎng)動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)（1）原代培養(yǎng)與傳代培養(yǎng) 取材TrypsinEDTAcollagenase取材部位是否準(zhǔn)確組織是否保持活性材料處理是否恰當(dāng)2 原代培養(yǎng)組織塊培養(yǎng)組織塊的培養(yǎng)一般傳代培養(yǎng)的步驟 (1) 吸出培養(yǎng)瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液。(2) 加入胰蛋白酶和EDTA混合液蓋滿瓶底。(3) 25分鐘后檢查，如有細(xì)胞間隙變大，細(xì) 胞質(zhì)回縮現(xiàn)象，終止消化。(4) 吸出消化液，加入PB

2、S液，輕輕轉(zhuǎn)動以 免細(xì)胞流失，洗去殘留的消化液。如果單 用胰蛋白酶，可直接加入培養(yǎng)液。(5) 用吸管輕輕吹打瓶壁，使細(xì)胞脫落制成懸 液，計(jì)數(shù)后記錄其濃度。（6）重新接種培養(yǎng)。（二）建立細(xì)胞系過程（1）取材食管癌患者的手術(shù)標(biāo)本（2）原代培養(yǎng)1）食管腫物組織放入含青霉素和鏈霉素的 RPMI 1640培養(yǎng)液內(nèi)，于4下靜置2小 時。2） 然后將組織剪切成1-2mm3的小塊。用含 青霉素和鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液洗 滌后，接種于預(yù)先涂有鼠尾膠原的玻璃培 養(yǎng)瓶中。3） 于37、CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2小時后，再 補(bǔ)加含20%的小牛血清的RPMI 1640培 養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。（3）建系過程組織塊在接種1

3、周后，上皮細(xì)胞從組織塊周圍向外迅速遷移和生長，相互連接成片。2周后，可以見到成纖維細(xì)胞生長。8周后，上皮細(xì)胞生長開始明顯加快，并向周圍延伸。用胰蛋白酶消化法和刮脫法等手段除掉成纖維細(xì)胞。這樣處理后的細(xì)胞在傳代三次后，貼壁生長的細(xì)胞呈現(xiàn)上皮狀，核清晰可見核仁。2周后細(xì)胞形成群落。第4代后細(xì)胞開始呈單層生長，命名為ECA109。 ECA109 經(jīng)生物學(xué)特性分析后確定細(xì)胞系建立成功（三）細(xì)胞系和細(xì)胞株鑒定鑒定指標(biāo)：純度，細(xì)胞學(xué)特性，穩(wěn)定性，污染情況鑒定方法：細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察，繪制生長曲線，計(jì)算分裂指數(shù)，染色體組型和帶型分析，同工酶酶譜檢測檔案資料及管理使用：美國標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞庫ATCC,人遺傳突變細(xì)胞庫HG

4、MR,細(xì)胞衰老細(xì)胞庫CAR細(xì)胞計(jì)數(shù)四角大方格內(nèi)細(xì)胞數(shù)平均，若壓中線者，只計(jì)算壓左線和上線邊的細(xì)胞。細(xì)胞密度個/ml平均細(xì)胞數(shù)x103x稀釋倍數(shù)2. 臺盼藍(lán)法活細(xì)胞不被染色，死細(xì)胞染成藍(lán)色，用活細(xì)胞占細(xì)胞中的百分比表示細(xì)胞活力 3 四唑鹽（MTT）比色法四唑鹽（MTT）商品名為噻唑藍(lán)，原理：活細(xì)胞中脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶干水的藍(lán)紫色產(chǎn)物（formazan)，并沉淀在細(xì)胞中，而死細(xì)胞沒有這種功能。二甲亞砜（DMSO）能溶解沉積在細(xì)胞中藍(lán)紫色結(jié)晶物，溶液顏色深淺與所含的formazan量成正比。再用酶標(biāo)儀測定OD值 MTT法簡單快速準(zhǔn)確，廣泛應(yīng)用于新藥篩選、細(xì)胞毒性試驗(yàn)、腫瘤放射敏感性實(shí)驗(yàn)等。

5、（1）單細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板；103-104 細(xì)胞/孔，每孔培養(yǎng)基總量200ul（96孔培養(yǎng)板每孔容積370ul），37、5CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一段時間（根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康臎Q定培養(yǎng)時間） （2）加入2mgml的MTT液（50ul孔）；繼續(xù)培養(yǎng)3小時。 （3）吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液后，加入DMSO液（150ul孔），將培養(yǎng)板置于微孔板扳蕩器上振蕩10分鐘，使結(jié)晶物溶解。 （4）酶標(biāo)儀檢測各孔OD值（檢測波長570nm），記錄結(jié)果，繪制生長曲線。操作步驟:（四）細(xì)胞凍存和復(fù)蘇細(xì)胞低溫冷凍貯存是細(xì)胞室的常規(guī)工作。細(xì)胞凍存與細(xì)胞傳代保存相比可以減少人力、經(jīng)費(fèi)，減少污染，減少細(xì)胞生物學(xué)特性變化。液氮罐慢凍程序標(biāo)準(zhǔn)

6、程序： 當(dāng)溫度在-25 以上時， 12 /min 當(dāng)溫度達(dá)-25 以下時， 510 /min 當(dāng)溫度達(dá)-100時，可迅速放入液氮中細(xì)胞凍存器簡易程序： 將冷凍管（管口要朝上）放入紗布袋內(nèi)，紗布袋系以線繩，通過線繩將紗布袋固定于液氮罐罐口，按每分鐘溫度下降12 的速度，在40分鐘內(nèi)降至液氮表面，停30分鐘后，直接投人液氮中。低溫保護(hù)劑的應(yīng)用在細(xì)胞凍存時加入溫保護(hù)劑，能大大提高凍存效果。常用的低溫保護(hù)劑是DMSO，它是一種滲透性保護(hù)劑，可迅速透入細(xì)胞，提高胞膜對水的通透性，降低冰點(diǎn)，延緩凍結(jié)過程，能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內(nèi)冰晶，從而減少冰晶對細(xì)胞的損傷。細(xì)胞復(fù)蘇方法

7、（l）從液氮中取出冷凍管，迅速投入37 38 水浴中，使其融化（1分鐘左右）。（2）5分鐘內(nèi)用培養(yǎng)液稀釋至原體積的10倍 以上。（3）低速離心10分鐘。（4）去上清，加新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)剛復(fù)蘇的細(xì) 胞。1 基本流程分批式batch，流加式fed-batch，半連續(xù)式semicontinuous，連續(xù)式，灌流式perfusion（五）動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)2 生物反應(yīng)器系統(tǒng)（1）生物反應(yīng)器設(shè)計(jì)依據(jù)除了以人工誘變?yōu)槟康牡呐囵B(yǎng)外，用于動物細(xì)胞培養(yǎng)的生物反應(yīng)器的設(shè)計(jì)原則應(yīng)該是盡量模擬培養(yǎng)物在生物體內(nèi)的生長環(huán)境。由于動物細(xì)胞生長的特殊性，如貼壁、脆弱等，與微生物細(xì)胞培養(yǎng)不同，需要特別注意反應(yīng)器結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)以及特殊載

8、體的選擇。（2）分類一般有微載體式、中空纖維式、灌注培養(yǎng)式、旋轉(zhuǎn)壁式等幾種新型的反應(yīng)器等。分批式操作：早期采用的方式，是其它操作方式的基礎(chǔ)。機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器，一次性將擴(kuò)大的細(xì)胞和培養(yǎng)液投入，在培養(yǎng)過程中其體積不變，不添加其它成份，待細(xì)胞增長和產(chǎn)物積累到適當(dāng)時間，一次性對細(xì)胞，產(chǎn)物和培養(yǎng)基進(jìn)行收獲。流加式操作：主流優(yōu)勢。機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器，懸浮培養(yǎng)細(xì)胞或以微載體培養(yǎng)貼壁細(xì)胞，細(xì)胞初始接種的培養(yǎng)基體積一般為終體積的1/31/2，在培養(yǎng)過程中，根據(jù)細(xì)胞對營養(yǎng)物質(zhì)的不斷消耗和需求及時補(bǔ)充新的營養(yǎng)成份，使細(xì)胞持續(xù)生長。細(xì)胞或產(chǎn)物達(dá)到所需指標(biāo)后終止培養(yǎng)，一次性回收整個反應(yīng)體系，分離純化產(chǎn)品。半連續(xù)式

9、操作：又稱為重復(fù)批式培養(yǎng)或換液培養(yǎng)，采用機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器，懸浮培養(yǎng)形式。每隔一定的時間去除部分培養(yǎng)物，再用新的培養(yǎng)液補(bǔ)足到原有體積，使反應(yīng)器內(nèi)的總體積不變，并使細(xì)胞呈指數(shù)生長，可長時期進(jìn)行生產(chǎn)，反復(fù)收獲產(chǎn)品。連續(xù)式操作：采用機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器，將細(xì)胞接種到一定的培養(yǎng)基后，為了防止衰退期的出現(xiàn)，在細(xì)胞達(dá)到最大密度之前以一定速度向生物反應(yīng)器連續(xù)添加新鮮培養(yǎng)基，同時含有細(xì)胞的培養(yǎng)物以相同的速度連續(xù)從反應(yīng)器流出，培養(yǎng)體積恒定。灌流式操作：把細(xì)胞和培養(yǎng)基一起加入反應(yīng)器后，在細(xì)胞增長和產(chǎn)物形成的過程中，不斷將部分條件培養(yǎng)基取出，同時又不斷地灌注新地培養(yǎng)基?？刹捎脭嚢枋缴锓磻?yīng)器懸浮培養(yǎng)細(xì)胞和固定床或

10、流化床生物反應(yīng)器。細(xì)胞截留系統(tǒng)維持較高的細(xì)胞密度；連續(xù)灌流系統(tǒng)使細(xì)胞處于較好的營養(yǎng)環(huán)境，有害代謝物濃度降低；反應(yīng)速率易控制；產(chǎn)品在罐內(nèi)停留時間短，活性好。（3） 動物細(xì)胞培養(yǎng)的載體實(shí)現(xiàn)規(guī)模化急需解決的問題 問題一 細(xì)胞貼壁生長的載體微載體培養(yǎng)技術(shù)1967年，Van Wezel開發(fā)了微載體系統(tǒng)培養(yǎng)貼壁細(xì)胞。微載體是直徑60-250m的微珠。多用帶不同基團(tuán)的葡聚糖交聯(lián)成幾種大分子，使其帶有適當(dāng)電荷或介質(zhì)，以利于細(xì)胞的貼壁及生長。 *貼壁培養(yǎng)的載體材料 與生物反應(yīng)器系統(tǒng)主要有轉(zhuǎn)瓶、中空纖維、玻璃珠、微載體系統(tǒng)等。后者是一重要技術(shù)，包括微載體、多空載體、微囊 *一種微載體產(chǎn)品及孔狀的顯微結(jié)構(gòu)材料：生物

11、相容性，機(jī)械穩(wěn)定性熱穩(wěn)定性（4）生物反應(yīng)器培養(yǎng)系統(tǒng)與工藝問題二 系統(tǒng)構(gòu)建問題三 傳代技術(shù)問題四 培養(yǎng)工藝與微載體結(jié)合的生物反應(yīng)器系統(tǒng)（5）培養(yǎng)工藝連續(xù)灌注培養(yǎng)生長在載體上的動物細(xì)胞收獲細(xì)胞一個問題：怎樣實(shí)現(xiàn)接種傳代培養(yǎng)？球傳球技術(shù)（6）應(yīng)用舉例生物反應(yīng)器培養(yǎng)非洲綠猴腎細(xì)胞vero和狂犬病毒1 材料與方法（1）細(xì)胞：非洲綠猴腎細(xì)胞Vero細(xì)胞(ATCC): 150-180代。（2）培養(yǎng)基：DMEM(Dulbecco Modified Eagle Medium GIBCOL)，5%10%小牛血清和硫酸慶大 霉素，用碳酸氫鈉或鹽酸調(diào)至pH7.2。（3）微載體：CT-3微載體（4）反應(yīng)器：5LCell

12、Gen細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器 (NBS.CO.U.S.A.)，50LCellCul- 50A細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器2 培養(yǎng)過程以CelliGen5L細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器作為種子罐培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長到一定密度時，將細(xì)胞和新的微載體一起移入CellCul-50A細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器中 。自動控制：溫度370.1、溶解氧為50%空氣飽和度、轉(zhuǎn)速為2032rpm。細(xì)胞培養(yǎng)到一定密度后，接種狂犬病毒。第2天停止攪拌，抽出培養(yǎng)基，加病毒培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。病毒培養(yǎng)條件為pH7.4pH7.8、溶解氧為40%60%空氣飽和度、溫度為37.0。3 培養(yǎng)結(jié)果培養(yǎng)8天，細(xì)胞密度達(dá)1.1107cells/ml。細(xì)胞貼附在微載體上生長的電鏡照片見圖

13、。在整個培養(yǎng)過程中細(xì)胞形態(tài)飽滿光滑、長較快，細(xì)胞在較短的時間內(nèi)達(dá)到高密度，且可多層生長。接種病毒后10天，能產(chǎn)生較高的病毒量。 （六）動物細(xì)胞體外培養(yǎng)現(xiàn)狀與展望 存在的問題 （一）細(xì)胞密度低，產(chǎn)物濃度低。（二）細(xì)胞群體在大規(guī)模、長時間培養(yǎng)過程中分 泌產(chǎn)物能力易丟失，或產(chǎn)物活性易降低。（三）動物細(xì)胞培養(yǎng)基、培養(yǎng)設(shè)備以及培養(yǎng)用微 載體很昂貴。因此大多僅能在小規(guī)模范 圍內(nèi)研究，難以轉(zhuǎn)化為生產(chǎn)力。（四）目前對細(xì)胞代謝和生長動力學(xué)的研究比較 欠缺。（五）在線監(jiān)測水平技術(shù)不完善，限制了優(yōu)良培 養(yǎng)系統(tǒng)的開發(fā)。 今后應(yīng)重點(diǎn)開展的工作 （一）細(xì)胞培養(yǎng)過程代謝和產(chǎn)物形成機(jī)制等方面 的理論研究。（二）開發(fā)能高密度生長、大量分泌目標(biāo)產(chǎn)品的 細(xì)胞系。（三） 開發(fā)細(xì)胞生長性能優(yōu)良、細(xì)胞解離容易， 并能