zj基因工程第5章(目的基因的合成完全版)課件

1、第五章 目的基因的獲得基因工程主要是通過人工的方法分離、改造、擴增并表達生物的特定基因，從而深入開展核酸遺傳研究或者獲取有價值的基因產(chǎn)物。通常將那些已被或者準備要被分離、改造、擴增或表達的特定基因或DNA片段，稱為目的基因。因目的基因片段需插入載體，導(dǎo)入宿主細胞內(nèi)復(fù)制，所以對宿主細胞DNA而言，又稱它為外源性基因。目的基因用途 研究該基因的全貌與內(nèi)涵，如詳細分析其結(jié)構(gòu)、功能及調(diào)控。與正?；?qū)Ρ?，尋找異?；虻漠惓｜c，進而探索疾病發(fā)生的分子生物學(xué)機理及治療對策。研究生物種系進化與相關(guān)同源性。應(yīng)用某種基因大量表達，生產(chǎn)所需要的蛋白質(zhì)或多肽（如胰島素、干擾素等藥物）。在農(nóng)、林、牧、副、漁業(yè)中，改造

2、某些目的基因，以改良品種，促進經(jīng)濟發(fā)展。建立基因治療院，選用某種正?；?，引入患者體內(nèi)，對某些先天性遺傳疾病進行治療。挑出所要群落得到純系轉(zhuǎn)殖菌株大量培養(yǎng)生產(chǎn)人類胰島素Human Insulin探針 Probe互補 DNA專一性抗體送入宿主細菌基因接入載體目標基因剪接Stryer (1995) Biochemistry, p. 119Kleismith & Kish (1995) Cell and Molecular Biology, p. 115 幾種生物的基因組比較病毒SV40 5.2 1 環(huán)狀大腸桿菌 4000 1 環(huán)狀酵母 17000 17 線狀人 5-7106 23 線狀 種類 大小

3、 （ Kb） 染色體數(shù) 形狀目的基因的獲取化學(xué)合成法 cDNA文庫基因組DNA文庫聚合酶鏈式反應(yīng)第一節(jié) 基因組文庫的構(gòu)建基因組文庫的概念 某種生物的基因組的全部遺傳信息通過克隆載體貯存在一個受體菌的群體之中，這個群體即為這種生物的基因組文庫。若這個群體中只貯存某種生物基因組的部分遺傳信息，則稱為部分基因組文庫。1.1 基因組文庫構(gòu)建的基本步驟 細胞染色體大分子DNA的提取和大片段的制備；載體DNA的制備；載體與外源大片段的連接；體外包裝及基因組DNA文庫的擴增；重組DNA的篩選和鑒定。限制性內(nèi)切酶基因組DNA基因重組轉(zhuǎn)化細菌體外包裝1.3 載體和受體的選擇出于壓縮重組克隆的數(shù)量，用于基因組文庫

4、構(gòu)建的載體通常選裝載量較大的-DNA或考斯質(zhì)粒；對于大型基因組（如動植物和人類）需使用YAC或BAC載體由于絕大多數(shù)真核生物的mRNA小于10 kb，因此用于cDNA文庫構(gòu)建的載體通常選質(zhì)粒上述幾種載體的最大裝載量如下： 質(zhì)粒 15 kb -DNA 25 kb 考斯質(zhì)粒 45 kb BAC 300 kb YAC 400 kb用于基因文庫構(gòu)建的受體則根據(jù)載體使用大腸桿菌或酵母菌1.4 重組DNA分子的構(gòu)建 一般選擇10uL的連接反應(yīng)體系，其中DNA片段與載體臂之間的摩爾數(shù)比為2：11.5 重組DNA分子導(dǎo)入受體細胞一般采用噬菌體顆粒的形式將重組DNA分子導(dǎo)入大腸桿菌細胞中，以提高建立基因文庫的效

5、率。1.6 基因文庫的完備性基因文庫的完備性是指：在構(gòu)建的基因文庫中任一基因存在的概率，它與基因文庫最低所含克隆數(shù)N之間的關(guān)系可用下式表示：N = ln ( 1 P ) / ln ( 1 f )其中： N：重組子的數(shù)量 P ： 任一基因被克?。ɑ虼嬖谟诨蛭膸熘校┑母怕?f ： 克隆片段的平均大小/ 生物基因組的大小 例如，人的單倍體DNA總長為2.9 x 109 bp，基因文庫中克隆片段的平均大小為15 kb，則構(gòu)建一個完備性為0.9的基因文庫至少需要45萬個克??；而當完備性提高到0.9999時，基因文庫至少需要180萬個克隆1.7 基因文庫的質(zhì)量標準 除了盡可能高的完備性外，一個理想的基因

6、文庫應(yīng)具備下列條件：重組克隆的總數(shù)不宜過大，以減輕篩選工作的壓力載體的裝載量最好大于基因的長度，避免基因被分隔克隆克隆與克隆之間必須存在足夠長度的重疊區(qū)域，以利克隆排序克隆片段易于從載體分子上完整卸下重組克隆能穩(wěn)定保存、擴增、篩選1.8 基因文庫的擴增、分裝及保存液體培養(yǎng)增殖法；影印濾膜培養(yǎng)法；制備轉(zhuǎn)導(dǎo)性裂解物；2.1 cDNA基因文庫構(gòu)建的步驟細胞總RNA的制備及mRNA的分離cDNA第一條鏈的合成雙鏈cDNA的合成cDNA與載體的連接噬菌體顆粒的包裝轉(zhuǎn)染或質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化mRNA cDNA 雙鏈cDNA 重組DNA分子 cDNA文庫 反轉(zhuǎn)錄酶 載體 受體菌 復(fù)制從cDNA文庫獲取目的基因 2.1

7、.2 從mRNA制備cDNA逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶mRNAcDNA雜化雙鏈cDNA第一鏈的合成cDNA第二鏈的合成自身引導(dǎo)法：獲得的雙鏈cDNA 5端會有幾對堿基缺失cDNA第二鏈的合成置換合成法：獲得的雙鏈cDNA 5端也會有幾對堿基缺失cDNA第二鏈的合成引導(dǎo)合成法：獲得的雙鏈cDNA 能保留完整的5端序列 雙鏈平頭的cDNA通?？梢允褂孟铝腥N方法克隆入載體中： 平頭末端直接與載體連接，但插入的片段無法回收 平頭兩端分別接同聚物尾，最好是AT同聚物尾，這樣重組分子可通過加熱局部變性和S1核酸酶處理回收插入片段 加裝人工接頭引入酶切口，以便插入片段回收2.1.3 雙鏈cDNA的克隆2.2 cDNA

8、克隆的主要優(yōu)點cDNA克隆以mRNA為材料，特別適用于某些RNA病毒等的基因組結(jié)構(gòu)研究及有關(guān)基因的克隆分離。cDNA基因文庫的篩選比較簡單易行。每一個cDNA克隆都含有一種mRNA序列，這樣在目的基因的選擇中出現(xiàn)假陽性的概率就會比較低，因此陽性雜交信號一般都是有意義的，由此選擇出來的陽性克隆將會含有目的基因。cDNA克隆可用于在細菌中能進行表達的基因的克隆，直接應(yīng)用于基因工程操作。cDNA克隆還可用于真核細胞mRNA的結(jié)構(gòu)和功能研究。2.3 cDNA克隆的主要的缺點cDNA文庫所包含的遺傳信息要遠遠少于基因組DNA文庫，并且受細胞來源或發(fā)育時期的影響。cDNA基因文庫雖能反映mRNA的分子結(jié)構(gòu)

9、和功能信息，但不能直接獲得基因的內(nèi)含子序列和基因編碼區(qū)外大量的調(diào)控序列的結(jié)構(gòu)與功能方面的信息。在cDNA基因文庫中，相應(yīng)于高豐度mRNA的cDNA克隆所占的比例比較高，分離起來比較容易，而相應(yīng)于低豐度mRNA的cDDNA克隆所占的比例則比較低，因此分離也就比較困難。 第三節(jié) 目的基因的獲得3.1 應(yīng)用核酸探針分離克隆的目的基因 當把基因文庫轉(zhuǎn)移到尼龍膜或硝酸纖維素膜上后，就可以同特異性的核酸探針進行菌落或噬菌斑雜交，以便篩選出具有目的基因的陽性克隆。這個過程叫做克隆基因的分離或篩選。從基因文庫中篩選目的基因從cDNA文庫釣取目的基因需要解決的問題：1、核酸探針的來源；2、寡核苷酸探針的人工合成

10、；（1）所合成的探針必須嚴格地只能同目的基因的cDNA序列互補；（2）遺傳密碼的簡并問題；3、假陽性克隆的克服；3.2 應(yīng)用差別雜交或扣除雜交法分離克隆的目的基因 3.2.1 差別雜交（differential hybridization)；又叫差別篩篩選（differential screening)，適用于分離經(jīng)特殊處理而被誘發(fā)表達的mRNA的cDNA克隆。 3.2.2 扣除雜交(subtractive hybridization )；又叫(subtractive cDNA cloning)，它是通過構(gòu)建 扣除文庫得以實現(xiàn)的。 差異分離程序利用兩組細胞mRNA種類的差異，分離克隆差異mRN

11、A所對應(yīng)的cDNA，因而這種程序較適用于分離克隆新基因例如：正常的大鼠FR3T3成纖維細胞中，有些新基因是不能自發(fā)表達的，需在多瘤病毒感染之后方可轉(zhuǎn)錄。任務(wù)是要分離克隆這些新基因，進而研究其生物學(xué)功能3.3 應(yīng)用mRNA差別顯示技術(shù)分離克隆的目的基因生物個體發(fā)育的不同階段，或是在不同的組織或細胞中發(fā)生的不同基因按時間、空間進行有充的表達方式，叫做基因的差別表達。mRNA差別顯示PCR（mRNA differential display reverse trnscription polymerase chain reaction)，簡稱DDRT-PCR原理：使用5-T11MN或T12MN的錨定引

12、物，以及5端的隨機引物來進行RT-PCR，從而整個mRNA群體在cDNA水平上，分成大致相等的但序列結(jié)構(gòu)不同的12份亞群。分別在標準測序膠上進行電泳即可分開差別表達的mRNA。3.4 應(yīng)用表達文庫分離克隆的目的基因?qū)DNA插入表達載體中，在大腸桿菌中得以表達后，使用特異性抗體為探針與表達產(chǎn)物進行反應(yīng)后篩選。 3.5 目的基因的化學(xué)合成全基因 化學(xué)合成目的基因的前提條件是基因的DNA序列已知，有三種戰(zhàn)略：小片段粘接法： 根據(jù)目的基因全序列，分別合成12-15堿基長的單鏈DNA小片段補釘延長法：根據(jù)目的基因兩條互補鏈全序列，分別合成12-15堿基長的單鏈DNA小片段以及20-30堿基長的單鏈DN

13、A中片段大片段酶促法：根據(jù)目的基因的全序列，分別合成40-50堿基長的單鏈DNA片段DNA化學(xué)合成的用途合成天然基因如生長激素釋放抑制素基因、腦啡肽基因、胰島素基因、干擾素基因等修飾改造基因如組織型纖溶酶原激活劑基因、尿激酶原基因等設(shè)計新型基因制備探針、引物、接頭化學(xué)合成法獲取目的基因由已知氨基酸序列推測可能的DNA序列 探針等寡聚核苷酸合成在某些情況下，往往只知道目的基因編碼產(chǎn)物的部分氨基酸序列，而基因序列未知，此時需要從已知的氨基酸序列推測為其編碼的DNA序列，然后合成探針，篩選由鳥槍法或cDNA法得到的重組子，最終獲得含有目的基因的目的重組子由于大多數(shù)氨基酸擁有簡并密碼子，故在探針序列的設(shè)計時必須考慮下列問題：生物體對簡并密碼子的偏愛性，合成系列探針探針應(yīng)具有足夠的長度，通常在17-20個核苷酸之間探針內(nèi)部不應(yīng)出現(xiàn)可能的互補區(qū)域探針等寡聚核苷酸合成化學(xué)合成的單元操作化學(xué)合成DNA的實質(zhì)是按照序列要求將脫氧核苷酸單體一個個接上去，每接一個單體就是一個循環(huán)反應(yīng)，包括：基團保護、分離、縮合、分離、去保護五大操作單元。從反應(yīng)機理上來講，DNA化學(xué)合成有磷酸二酯法