紫外可見分光光度計課件

1、紫外分光光度計的使用原理和方法講解人：李梓番2015.6紫外分光光度計的使用原理和方法講解人：李梓番 所依據(jù)的光譜是分子或離子吸收入射光中特定波長的光而產(chǎn)生的吸收光譜按所吸收光的波長區(qū)域不同，分為紫外分光光度法和可見分光光度法，合稱為紫外-可見分光光度法。 物質(zhì)對光的選擇性吸收 物質(zhì)的吸收光譜與測定條件有密切的關(guān)系。測定條件（溫度、溶劑極性、pH等）不同，吸收光譜的形狀、吸收峰的位置、吸收強度等都可能發(fā)生變化。pH值溶劑 ： 盡量選用低極性溶劑；能很好地溶解被測物，并且形成的溶液具有良好的化學和光化學穩(wěn)定性；溶劑在樣品的吸收光譜區(qū)無明顯吸收。溫度 在室溫范圍內(nèi)，溫度對吸收光譜的影響不大。 影響

2、因素：2、紫外-可見吸收光譜 物質(zhì)的吸收光譜與測定條件有密切的關(guān)系。測定條件（溫度、 吸光度和透光度 設(shè)入射光強度為I0，吸收光強度為Ia,透射光強度為 It，反射光強度為Ir，則 I0= Ia+ It+ Ir由于反射光強度很弱，其影響很小，上式可簡化為： I0= Ia+ I 吸光度和透光 為透光度倒數(shù)的對數(shù)，用A表示，即 A=lg1/T=lgI0/It透光度：透光度為透過光的強度It與入射光強度I0之比，用T表示： 即 T= It/I 為透光度 朗伯-比爾定律 朗伯-比爾定律：當一束平行單色光通過含 有吸光物質(zhì)的稀溶液時，溶液的吸光度與 吸光物質(zhì)濃度、液層厚度乘積成正比，即 A= cl式中比

3、例常數(shù)與吸光物質(zhì)的本性，入射 光波長及溫度等因素有關(guān)。c為吸光物質(zhì)濃 度，l為透光液層厚度。3、朗伯-比爾定律 朗伯-比爾定律3、朗伯-比爾定 吸光系數(shù)當l以cm，c以g/L為單位，稱為吸光系數(shù)，用 a表示。A= a cla的單位為L/(g cm)3、朗伯-比爾定律 吸光系數(shù)當l以cm，c以g/L 表示。示。 的單位為L/(mol cm)，它表示物質(zhì)的濃度為1mol/L，液層厚度為1cm時，溶液的吸光度。3、朗伯-比爾定律 l為1cm時的吸光度值，用 表示。3、朗伯-比爾定律 偏離朗伯-比耳定律的因素（1）入射光為非單色光（2）溶液的不均性。 實際樣品的混濁，加入的保護膠體，蒸餾水中的微生物，

4、存在散射以及共振發(fā)射等，均可吸光質(zhì)點的吸光特性變化大。（3）光程的不一致性。 光源不是點光源，比色皿光徑長度不一致，光學元件的缺陷引起的多次反射等，均造成光徑不一致，從而與定律偏離。3、朗伯-比爾定律 偏離朗伯-比耳定律的因素（1） 主要部件的性能與作用基本結(jié)構(gòu):光源單色器吸收池檢測器信號顯示系統(tǒng)樣品 主要部 光源 在紫外可見分光光度計中，常用的光源有兩類：熱輻射光源和氣體放電光源熱輻射光源用于可見光區(qū)，如鎢燈和鹵鎢燈；氣體放電光源用于紫外光區(qū)，如氫燈和氘燈。4、紫外-可見分光光度計 光源 在紫外可見分光光度計中， 單色器單色器的主要組成：入射狹縫、出射狹縫、色散元件和準直鏡等部分。 單色器質(zhì)

5、量的優(yōu)劣，主要決定于色散元件的質(zhì)量。色散元件常用棱鏡和光柵。4、紫外-可見分光光度計 單色器單色器的主要組成：入射狹 吸收池 吸收池又稱比色皿或比色杯，按材料可分為玻璃吸收池和石英吸收池，前者不能用于紫外區(qū)。吸收池的種類很多，其光徑可在0.110cm之間，其中以1cm光徑吸收池最為常用。4、紫外-可見分光光度計 吸收池 吸收池又稱比色皿或比色 檢測器檢測器的作用是檢測光信號，并將光信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘枴，F(xiàn)今使用的分光光度計大多采用光電管或光電倍增管作為檢測器。5 信號顯示系統(tǒng)常用的信號顯示裝置有直讀檢流計，電位調(diào)節(jié)指零裝置，以及自動記錄和數(shù)字顯示裝置等。4、紫外-可見分光光度計 檢測器4、紫外-可

6、見分光光度計 紫外-可見分光光度計的類型按其光學系統(tǒng)可分為單波長分光光度計和雙波長分光光度計。4、紫外-可見分光光度計 紫外-可見分光光度計的類型按其1 單波長單光束分光光度計特點：使用時來回拉動吸收池 移動誤差對光源要求高比色池配對4、紫外-可見分光光度計1 單波長單光束分光光度計特點：4、紫外-可見分光光度計2 單波長雙光束分光光度計特點：不用拉動吸收池，可以減小移動誤差對光源要求不高可以自動掃描吸收光譜 4、紫外-可見分光光度計2 單波長雙光束分光光度計特點：4、紫外-可見分光光度計3 雙波長分光光度計特點：利用吸光度差值定量消除干擾和吸收池不匹配引起的誤差4、紫外-可見分光光度計3 雙

7、波長分光光度計特點：4、紫外-可見分光光度計5、分析條件的選擇 1 適宜的吸光度范圍由朗伯-比爾定律可知： A=lg1/T=cl 微分后得： dlgT=0.4343dT/T= -ldc 或 0.4343T/T= -lc一 儀器測量條件的選擇5、分析條件的選擇 1 適宜的吸光度范圍一 儀器測量條件 c/c=0.4343T/TlgT要使測定的相對誤差c/c最小，求導取極小得出： lgT=-0.4343=A即當A=0.4343時，吸光度測量誤差最小。 最適宜的測量范圍為0.20.8之間。5、分析條件的選擇 入射光波長的選擇 通常是根據(jù)被測組分的吸收光譜，選擇最強吸收帶的最大吸收波長為入射波長。當最強

8、吸收峰的峰形比較尖銳時，往往選用吸收稍低，峰形稍平坦的次強峰或肩峰進行測定。 5、分析條件的選擇 入射光波長的選擇5、分析條件的 狹縫寬度的選擇 為了選擇合適的狹縫寬度，應以減少狹縫寬度時試樣的吸光度不再增加為準。一般來說，狹縫寬度大約是試樣吸收峰半寬度的十分之一。5、分析條件的選擇 狹縫寬度的選擇5、分析條件的選 顯色反應條件的選擇對多種物質(zhì)進行測定，常利用顯色反應將被測組分轉(zhuǎn)變?yōu)樵谝欢úㄩL范圍有吸收的物質(zhì)。常見的顯色反應有配位反應、氧化還原反應等。5、分析條件的選擇 顯色反應條件的選擇5、分析條件 1反應的生成物必須在紫外-可見光區(qū)有較強的吸光能力，即摩爾吸光系數(shù)較大；2反應有較高的選擇性

9、，即被測組分生成的化合物吸收曲線應與共存物質(zhì)的吸收光譜有明顯的差別；3. 反應生成的產(chǎn)物有足夠的穩(wěn)定性，以保證測量過程中溶液的吸光度不變；4. 反應生成物的組成恒定。5、分析條件的選擇 參比溶液的選擇測定試樣溶液的吸光度，需先用參比溶液調(diào)節(jié)透光度（吸光度為0）為100%，以消除其它成分及吸光池和溶劑等對光的反射和吸收帶來的測定誤差。5、分析條件的選擇 參比溶液的選擇測定試樣溶液的吸 試樣簡單、共存其它成分對測定波長吸收弱，只考慮消除溶劑與吸收池等因素； 2試樣參比 如果試樣基體溶液在測定波長有吸收，而顯色劑不與試樣基體顯色時，可按與顯色反應相同的條件處理試樣，只是不加入顯色劑。 5、分析條件的

10、選擇 如果顯色劑或其它試劑在測定波長有吸收，按顯色反應相同的條件，不加入試樣，同樣加入試劑和溶劑作為參比溶液。4. 平行操作參比 用不含被測組分的試樣，在相同的條件下與被測試樣同時進行處理，由此得到平行操作參比溶液。 5、分析條件的選擇 如果顯色劑或其它 單組分定量方法單組分是指樣品溶液中含有一種組分，或者是在混合物溶液中待測組分的吸收峰與其他共有物質(zhì)的吸收峰無重疊。其定量方法包括校準曲線法、標準對比法和吸收系數(shù)法。6、紫外-可見吸收光譜的應用 單組分定量方法6、紫外-可見吸 校準曲線法方法：配制一系列不同含量的標準溶液，選用適宜的參比，在相同的條件下，測定系列標準溶液的吸光度，作A-c曲線，

11、即標準曲線，也可用最小二乘數(shù)處理，得線性回歸方程。在相同條件下測定未知試樣的吸光度，從標準曲線上就可以找到與之對應的未知試樣的濃度。6、紫外-可見吸收光譜的應用 校準曲線法6、紫外-可見吸收光 標準對比法 即將待測溶液與某一標樣溶液，在相同的條件下，測定各自的吸光度，建立朗伯-比爾定律，解方程求出未知樣濃度與含量。 As=Kcs Ax=Kcx6、紫外-可見吸收光譜的應用 標準對比法6、紫外-可見吸收光 定性分析先用標準樣品掃描譜圖，在掃待測樣品的譜圖。拿兩者進行比較，可進行定性。但此方法誤差 比較大。 6、紫外-可見吸收光譜的應用 定性分析6、紫外-可見吸收光譜的三 純度的鑒定 用紫外吸收光譜

12、確定試樣的純度是比較方便的。 如蛋白質(zhì)與核酸的純度分析中，可用A280/A260或A230/A260的比值，鑒定其純度。蛋白質(zhì)濃度 1552A280757.3A260 (ug/ml)DNA濃度 62.9A26036.0A280 (ug/ml)蛋白質(zhì)濃度 183.0A23075.8A260 (ug/ml)DNA濃度 49.1A2603.48A230 (ug/ml) 6、紫外-可見吸收光譜的應用 三 純度的鑒定6、紫外-可見吸收光譜的應用 四 結(jié)構(gòu)分析紫外-可見吸收光譜一般不用于化合物的結(jié)構(gòu)分析，但利用紫外吸收光譜鑒定化合物中的共軛結(jié)構(gòu)和芳環(huán)結(jié)構(gòu)還是有一定價值。例如，某化合物在近紫外區(qū)內(nèi)無吸收，說明該