微生物培養(yǎng)技術(shù)

1、關(guān)于微生物培養(yǎng)技術(shù)第1頁，共45頁，2022年，5月20日，14點58分，星期三微生物非細(xì)胞生物：病毒原核生物：細(xì)菌、放線菌、支原體、 立克次氏體真核生物：真菌（酵母菌、霉菌）第2頁，共45頁，2022年，5月20日，14點58分，星期三菌落：單個或少數(shù)細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上大量繁殖時，就會形成一個肉眼可見的，具有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細(xì)胞群體，叫做菌落。菌落是鑒定菌種的重要依據(jù)。第3頁，共45頁，2022年，5月20日，14點58分，星期三細(xì)菌的營養(yǎng)類型 根據(jù)細(xì)菌所利用的能源和碳源的不同，將細(xì)菌分為兩大營養(yǎng)類型。自養(yǎng)型:異養(yǎng)型: 腐生菌 寄生菌 光合自養(yǎng)型:光合細(xì)菌化能自養(yǎng)型:硝化細(xì)菌第4頁，共45頁

2、，2022年，5月20日，14點58分，星期三一、微生物的分離和純培養(yǎng)（3項技術(shù)1個案例） （一）培養(yǎng)基配制技術(shù)（二）無菌技術(shù)（三）接種技術(shù) 案例：大腸桿菌的分離和純培養(yǎng) 第5頁，共45頁，2022年，5月20日，14點58分，星期三1、培養(yǎng)基定義：（課本第2頁）2、營養(yǎng)構(gòu)成：環(huán)境條件：pH、氧氣、二氧化碳、滲透壓等 （一）培養(yǎng)基配制技術(shù)營養(yǎng)成分：水、無機鹽、碳源、氮源、生長因子第6頁，共45頁，2022年，5月20日，14點58分，星期三固體培養(yǎng)基用于菌種分離、鑒定菌落等半固體培養(yǎng)基可觀察微生物的運動液體培養(yǎng)基常用于發(fā)酵工業(yè)。（1）按物理狀態(tài)分：固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基。3.培養(yǎng)

3、基的分類第7頁，共45頁，2022年，5月20日，14點58分，星期三固體培養(yǎng)基平板培養(yǎng)基（課本第2頁）斜面培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基中需加入凝固劑，如瓊脂第8頁，共45頁，2022年，5月20日，14點58分，星期三半固體培養(yǎng)基無運動 有運動 半固體培養(yǎng)基中也需要加入凝固劑瓊脂，但加入量少于固體培養(yǎng)基。第9頁，共45頁，2022年，5月20日，14點58分，星期三液體培養(yǎng)基表面生長均勻混濁生長沉淀生長第10頁，共45頁，2022年，5月20日，14點58分，星期三選擇培養(yǎng)基（2）按功能分：選擇培養(yǎng)基和鑒別培養(yǎng)基加入青霉素的培養(yǎng)基:抑制細(xì)菌和放線菌的生長， 分離酵母菌、霉菌等真菌。 不加氮源的無氮培養(yǎng)基

4、: 分離固氮菌定義（課本第7頁）舉例：加入高濃度食鹽的培養(yǎng)基:分離金黃色葡萄球菌第11頁，共45頁，2022年，5月20日，14點58分，星期三鑒別培養(yǎng)基 根據(jù)微生物的代謝特點，在培養(yǎng)基中加入某種指示劑或化學(xué)藥品配制而成的，用以鑒別不同種類的微生物。 例如：在培養(yǎng)基中加入伊紅和美藍(lán)，可以用來 鑒別大腸桿菌。 如果有大腸桿菌，其代謝產(chǎn)物就與伊紅和美藍(lán) 結(jié)合，使菌落呈藍(lán)紫色，并帶有金屬光澤。 (課本15頁) 第12頁，共45頁，2022年，5月20日，14點58分，星期三 用化學(xué)成分已知的化學(xué)物質(zhì)配成的，因成分明確，常用于分類、鑒定等 合成培養(yǎng)基主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機鹽和其它一

5、些輔助物質(zhì)。合成培養(yǎng)基:天然培養(yǎng)基：（3）按成分分：合成培養(yǎng)基和天然培養(yǎng)基 用化學(xué)成分不明確的天然物質(zhì)配成的，如血清、組織提取液等第13頁，共45頁，2022年，5月20日，14點58分，星期三稱量：準(zhǔn)確地稱取各種成分。牛肉膏比較黏稠， 可以用玻棒挑取，放在稱量紙上稱量。牛 肉膏和蛋白胨都容易吸潮，稱量時動作要 迅速，稱后要及時蓋上瓶蓋。4.培養(yǎng)基的配制步驟（第8頁）（1）.計算:根據(jù)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配方的 比例，計算配制100mL的培養(yǎng)基 時，各種成分的用量。 （參考課本83頁培養(yǎng)基配方）（以牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基為例）第14頁，共45頁，2022年，5月20日，14點58分，星期三（2）

6、.溶化：加水加熱熔化牛肉膏 將稱好的牛肉膏連同稱量紙一同放入燒杯加入少量的 水，加熱。當(dāng)牛肉膏溶化并與稱量紙分 離后，用玻棒 取出稱量紙。加入蛋白胨和氯化鈉，用玻棒攪拌，使其溶解；加入瓊脂；用蒸餾水定容到100mL。 整個過程不斷用玻棒攪拌，目的是防止瓊脂糊底而導(dǎo)致燒杯破裂。（3）.調(diào)節(jié)pH（4）.分裝、包扎（5）.滅菌（6）倒平板第15頁，共45頁，2022年，5月20日，14點58分，星期三待培養(yǎng)基冷卻到50 左右時，在酒精燈附近倒平板。倒平板在火焰旁右手拿錐形瓶，左手拔出棉塞；右手拿錐形瓶，使錐形瓶的瓶口迅速通過火焰；左手將培養(yǎng)皿打開一條縫隙，右手將培養(yǎng)基倒入培 養(yǎng)皿，立刻蓋上皿蓋。待平

7、板冷卻凝固后，將平板倒過來放置。第16頁，共45頁，2022年，5月20日，14點58分，星期三倒平板技術(shù)第17頁，共45頁，2022年，5月20日，14點58分，星期三（二）無菌技術(shù) 無菌操作泛指在培養(yǎng)微生物的操作中，所有防止雜菌污染的方法。、消毒（1）定義：使用較為溫和的物理或化學(xué)方法僅殺死物體 表面或內(nèi)部一部分對人體有害的微生物（不 包括芽孢和孢子）第18頁，共45頁，2022年，5月20日，14點58分，星期三A、煮沸消毒法:100煮沸5-6minB、巴氏消毒法：70-75 下煮30min 或 80 下煮15minC、化學(xué)藥劑消毒法:用酒精進行皮膚消毒; 氯氣消毒水源D、射線消毒法（2

8、）消毒的方法：第19頁，共45頁，2022年，5月20日，14點58分，星期三（1）定義：使用強烈的理化因素殺死物體內(nèi)外所有的 微生物，包括芽孢和孢子 。2、滅菌（2）滅菌的方法：A、灼燒滅菌第20頁，共45頁，2022年，5月20日，14點58分，星期三C、高壓蒸汽滅菌： 100kPa、121 下維持 15-30min.B、干熱滅菌： 160-170 下加熱1-2h。第21頁，共45頁，2022年，5月20日，14點58分，星期三（三）接種技術(shù)（課本第2頁）1.定義2.平板培養(yǎng)基上接種方法平板劃線法、稀釋涂布平板法、稀釋混合平板法 平板劃線的操作方法連續(xù)劃線法交叉劃線法第22頁，共45頁，2

9、022年，5月20日，14點58分，星期三第23頁，共45頁，2022年，5月20日，14點58分，星期三稀釋涂布平板法 將菌液進行一系列的梯度稀釋，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基的表面，進行培養(yǎng)。 在稀釋度足夠高的菌液里，聚集在一起的微生物將被分散成單個細(xì)胞，從而能在培養(yǎng)基表面形成單個的菌落。第24頁，共45頁，2022年，5月20日，14點58分，星期三第25頁，共45頁，2022年，5月20日，14點58分，星期三第26頁，共45頁，2022年，5月20日，14點58分，星期三1、微生物實驗室培養(yǎng)的基本操作程序（1）器具的滅菌 （2）培養(yǎng)基的配制（3）培養(yǎng)基的滅菌 （4）

10、倒平板（5）微生物接種 （6）恒溫箱中培養(yǎng)（7）菌種的保存（四）案例：大腸桿菌的分離和純培養(yǎng)第27頁，共45頁，2022年，5月20日，14點58分，星期三 （1）制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基2、大腸桿菌的分離和純培養(yǎng)步驟第28頁，共45頁，2022年，5月20日，14點58分，星期三（2)配制培養(yǎng)基：計算稱量；熔化； 調(diào)PH；分裝； 滅菌； 倒平板 （3）接種：平板劃線法；稀釋涂布平板法。（4）培養(yǎng)： 倒置，37恒溫箱，12和24h。（5）純化培養(yǎng)：倒置，37恒溫箱，24h。（6）菌種保藏：臨時、長期保存法。第29頁，共45頁，2022年，5月20日，14點58分，星期三菌種的保存 1、臨時保藏：

11、接種到固體斜面培養(yǎng)基，菌落長成后置于4冰箱保存。 2、長期保存：甘油冷凍管藏法-20 冷凍箱保存第30頁，共45頁，2022年，5月20日，14點58分，星期三二、培養(yǎng)基對微生物的選擇作用第31頁，共45頁，2022年，5月20日，14點58分，星期三（一）、基礎(chǔ)知識1、纖維素與纖維素酶【案例】分解纖維素的微生物的分離纖維素是一種多糖纖維素酶是一種復(fù)合酶纖維素纖維二糖葡萄糖C1酶、Cx酶葡萄糖苷酶第32頁，共45頁，2022年，5月20日，14點58分，星期三（二）、篩選1、方法：剛果紅染色法原理：剛果紅（CR）可以與纖維素形成紅 色復(fù)合物，當(dāng)纖維素被纖維素酶分 解后，紅色復(fù)合物無法形成，出現(xiàn)

12、 以纖維素分解菌為中心的透明圈， 我們可以通過是否產(chǎn)生透明圈來篩 選纖維素分解菌。第33頁，共45頁，2022年，5月20日，14點58分，星期三常用的剛果紅染色法有兩種方法一：在長出菌落的培養(yǎng)基上，覆蓋1mg/mL的CR 溶液，1015min后，倒去CR溶液，加入 1mol/L的NaCl溶液，15min后倒掉NaCl溶液。方法二：配制質(zhì)量濃度為10mg/mL的CR溶液，滅菌 后，按照每200mL培養(yǎng)基加入1mL的比例加入 CR溶液，混勻后倒平板。一種是先培養(yǎng)微生物，再加入剛果紅進行顏色反應(yīng)，另一種是在倒平板時就加入剛果紅第34頁，共45頁，2022年，5月20日，14點58分，星期三（1）土

13、壤取樣 （2）選擇培養(yǎng)（可省略） （3）梯度稀釋 （4）涂布培養(yǎng) （5）挑選產(chǎn)生透明圈的菌落（6）微生物培養(yǎng)（純培養(yǎng)）（三）、實驗流程第35頁，共45頁，2022年，5月20日，14點58分，星期三三、測定微生物的數(shù)量第36頁，共45頁，2022年，5月20日，14點58分，星期三（一）測定微生物數(shù)量的方法1.直接計數(shù)法最常用：顯微鏡直接計數(shù)法 （方法、優(yōu)點、缺點、適用條件）一、基礎(chǔ)知識第37頁，共45頁，2022年，5月20日，14點58分，星期三2、間接計數(shù)法：最常用的是稀釋平板計數(shù)法稀釋平板法稀釋涂布平板法稀釋混合平板法第38頁，共45頁，2022年，5月20日，14點58分，星期三（一

14、）測定飲用水中大腸桿菌的數(shù)目配制培養(yǎng)基倒平板接種（濾膜法）培養(yǎng)觀察記錄二、實踐案例第39頁，共45頁，2022年，5月20日，14點58分，星期三1、土壤取樣（二）土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計數(shù)2、配制培養(yǎng)基尿素瓊脂培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基第40頁，共45頁，2022年，5月20日，14點58分，星期三第41頁，共45頁，2022年，5月20日，14點58分，星期三3、樣品稀釋細(xì)菌：一般選用104 、105 、106倍的稀釋液進行培養(yǎng)放線菌：一般選用103 、104 、105倍的稀釋液真菌：一般選用102 、103 、104倍的稀釋液4、取樣及平板接種（涂布平板或混合平板）第42頁，共45頁，2022年，5月20日，14點58分，星期三 在以尿素為惟一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑，指示劑變紅，就可以準(zhǔn)確的鑒定該種細(xì)菌能夠分解尿素。5、培養(yǎng)與觀察：細(xì)菌：30370C的溫度下培養(yǎng)12d；放線菌：25280C的溫度下培養(yǎng)57d；霉菌：25280C的溫度下培養(yǎng)34d。第43頁，共45頁，2022年，5月20日，14