基因工程-2課件

1、基因工程技術(shù)曹月青重慶大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院1第三章 基因工程的常用載體2主要內(nèi)容載體的功能及特征質(zhì)粒（plasmid）噬菌體 M13噬菌體考斯質(zhì)粒（cosmid）與噬菌粒人造染色體載體3作用一：作為運(yùn)載工具，將外源基因轉(zhuǎn)移 到受體細(xì)胞中去。作用二：為外源基因提供復(fù)制能力或整合 能力作用三：為外源基因的擴(kuò)增或表達(dá)提供必 要的條件（一）載體的作用4作為運(yùn)載體必須具備哪些條件？1）能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定地保存。2）高效率的進(jìn)入宿主細(xì)胞3）具多個(gè)單一限制酶切點(diǎn)，以便與外源基因連接。4）具有較高的外源DNA的載裝能力。5）具有某些標(biāo)記基因，便于進(jìn)行篩選。6）容易從宿主細(xì)胞分離出來，便于后續(xù)體外操作5細(xì)胞

2、內(nèi)獨(dú)立的能夠自我增殖的結(jié)構(gòu)單位為復(fù)制子；包括與復(fù)制控制有關(guān)的結(jié)構(gòu)和與復(fù)制控制無關(guān)的 結(jié)構(gòu)； 細(xì)菌的染色體是一個(gè)復(fù)制子，而真核生物染色體是 多個(gè)復(fù)制子的復(fù)合體。7可自然形成超螺旋，大小在2-300kb。還有開環(huán)（ocDNA）和線狀兩種狀態(tài)。質(zhì)粒的存在與否對(duì)宿主細(xì)胞生存沒有決定性作用（不同于線粒體）。 是基因工程最常用的運(yùn)載體。8 抗藥性包括：氯霉素（Cm），氨芐（Ap） 氯霉素（Cm）；卡那（Km）；鏈霉素（Sm）對(duì)金屬離子抗性砷（As3+），汞（Hg2+），鎳（Ni2+）銀（Ag+）10（1）自主復(fù)制性 是能獨(dú)立復(fù)制的復(fù)制子。質(zhì)粒DNA復(fù)制的質(zhì)粒可隨宿主的分裂傳給下一代。 3、質(zhì)粒的基本特征1

3、1 根據(jù)復(fù)制的控制和每個(gè)細(xì)胞中的拷貝數(shù)多寡，質(zhì)?？煞譃閮纱髲?fù)制類型：嚴(yán)緊型復(fù)制控制的質(zhì)粒（stringent plasmid ）：復(fù)制與宿主的繁殖相耦聯(lián)，受寄主復(fù)制起始蛋白控制， 1 - 3 拷貝松弛型復(fù)制控制的質(zhì)粒（relax plasmid ）： 復(fù)制不與宿主的繁殖相耦聯(lián)，幾十至幾百拷貝（2）可擴(kuò)增性12 兩種含有不同復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，在復(fù)制時(shí)各受自己的拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，致使兩種質(zhì)粒的最終拷貝數(shù)恒定，因此在經(jīng)過若干復(fù)制周期和細(xì)胞分裂周期后仍能共處于同一細(xì)胞內(nèi)，其中拷貝數(shù)多的質(zhì)粒在以后的細(xì)胞分裂周期中更具優(yōu)勢。14 革蘭氏陰性菌的質(zhì)?？煞殖蓛纱箢悾航雍闲唾|(zhì)粒能在天然條件下自發(fā)地從一個(gè)

4、細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞（接合作用），如含F(xiàn)因子質(zhì)粒等； 非接合型質(zhì)粒不能在天然條件下獨(dú)立地發(fā)生接合作用； 目前在基因工程實(shí)驗(yàn)室中常用的質(zhì)粒屬于此類。（4）可轉(zhuǎn)移性154、質(zhì)粒改造構(gòu)建 天然質(zhì)粒往往存在不同程度的缺陷，因而不適合用作 基因工程的載體必須對(duì)之進(jìn)行改造構(gòu)建： （1）具有復(fù)制起始點(diǎn) 具有復(fù)制子的功能，且起始區(qū)域沒有所需的酶切位點(diǎn)。 （2）加入合適的選擇標(biāo)記基因 如兩個(gè)以上，易于用作選擇。 （3）增加或減少合適的酶切位點(diǎn)，便于重組 17（4） 分子量盡可能小 縮短長度，切去不必要的片段，提高導(dǎo)入效率， 增加裝載量（5） 改變復(fù)制子，變嚴(yán)緊為松弛，變少拷貝為多拷貝 （6） 應(yīng)為非傳遞性質(zhì)粒1

5、85、質(zhì)粒的分類 人工構(gòu)建的質(zhì)粒根據(jù)其功能和用途可分成如下幾類：高拷貝質(zhì)粒 突變拷貝數(shù)控制基因 拷貝數(shù)1000-3000 擴(kuò)增基因低拷貝質(zhì)粒 來自pSC101 拷貝數(shù)小于10 表達(dá)某些毒性基因測序質(zhì)粒 含有測序通用引物互補(bǔ)序列和多酶接頭polylinker整合質(zhì)粒 裝有整合促進(jìn)基因及位點(diǎn)便于外源基因的整合穿梭質(zhì)粒 裝有針對(duì)兩種不同受體的復(fù)制子便于基因克隆表達(dá)質(zhì)粒 裝有強(qiáng)化外源基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄翻譯、純化的元件探針質(zhì)粒 裝有報(bào)告基因，便于啟動(dòng)子等元件的克隆篩選196、實(shí)驗(yàn)室常用質(zhì)粒優(yōu)點(diǎn)：1、分子量較小，為4363bp，不僅利于自身DNA的純化，可容納的外源DNA也較大。2、具有兩種抗菌素抗性基因可供

6、轉(zhuǎn)化子的選擇記號(hào)。3、具有較高的拷貝數(shù)，經(jīng)過氯霉素?cái)U(kuò)增后，每個(gè)細(xì)胞中可累積1000-3000個(gè)拷貝，為重組體DNA的制備提供了極大的方便。pBR32220 特點(diǎn)： 1）分子量小，容納外源DNA量增大；具有更高的拷貝數(shù)（不用氯霉素?cái)U(kuò)增，每個(gè)細(xì)胞含500-700個(gè)拷貝）。 2）抗性和藍(lán)白篩選,易于 檢測。 3）多克隆位點(diǎn)區(qū)（MCS）.pUC系列21 半乳糖苷酶基因（lacZ 和lacZ） 半乳糖苷酶基因有1021 AAs。該蛋白質(zhì)可分為兩部分：鏈和鏈。前者負(fù)責(zé)四聚體裝配，后者具半乳糖苷酶活性；只有當(dāng)兩者都存在時(shí)，才會(huì)表現(xiàn)出酶活性，該作用稱之為-互補(bǔ)作用。 這兩個(gè)部分可獨(dú)立存在， 分別由兩個(gè)基因編碼

7、。為鏈編碼的基因稱之為lacZ(編碼145 AAs)。這兩個(gè)基因（LacZ和LacZ）均可作為標(biāo)記基因。 藍(lán)白篩選原理22半乳糖苷酶基因的優(yōu)點(diǎn): a.酶催化X-Gal水解為蘭色產(chǎn)物，檢測直觀 b. lacZ編碼5-端可容許很大的變化（如加入多克隆位點(diǎn)）而不影響酶活性 c. lacZ和鏈基因的分別表達(dá)可使載體小而容量大24pUC衍生載體T7和SP6啟動(dòng)子可進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄25T7 promoter：T7 特異性地由噬菌體DNA編碼的RNA聚合酶所識(shí)別，因此相應(yīng)的受體菌必須表達(dá)噬菌體RNA聚合酶，如：E.coli BL21（DE3）等。原核表達(dá)載體277、 質(zhì)粒DNA的分離純化 最常用的方法為堿裂解法

8、 原理：當(dāng)菌體在NaOH和SDS溶液中裂解時(shí)，蛋白質(zhì)與DNA發(fā)生變性，當(dāng)加入中和液后，質(zhì)粒DNA分子能夠迅速復(fù)性，呈溶解狀態(tài)，離心時(shí)留在上清中；蛋白質(zhì)與染色體DNA不變性而呈絮狀，離心時(shí)可沉淀下來。 用此方法制備的質(zhì)粒較純，收得率高，但繁瑣， 且質(zhì)粒中有開環(huán)現(xiàn)象。 28 圖1 圖2超螺旋環(huán)狀線狀29質(zhì)粒大小應(yīng)以線性狀態(tài)做判斷6kb 1 2 3 4 5 6 71、2、3、5：單一酶切位點(diǎn)4：兩個(gè)酶切位點(diǎn)7：未酶切質(zhì)粒30 分子量，拷貝數(shù)多 為內(nèi)切酶提供切點(diǎn)的機(jī)會(huì)小 容易提取質(zhì)粒載體的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn) 克隆片段小，小于10kb缺點(diǎn)31 噬菌體是一類非細(xì)胞微生物，能高效率高特異性地侵染宿主細(xì)胞，然后或自主

9、復(fù)制繁殖，或整合入宿主基因組中潛伏起來。 （二） 噬菌體1、噬菌體介紹32溫和噬菌體：既能進(jìn)入溶菌生命周期又能進(jìn)入溶源生命周期的噬菌體（雙鏈）烈性噬菌體：只有溶菌生長周期的噬菌體33 噬菌體是大腸桿菌的溫和型噬菌體 噬菌體由外殼包裝蛋白和-DNA組成-DNA全長48502個(gè)核苷酸-DNA上至少有61個(gè)基因（必要，非必要基因）2、 噬菌體生物結(jié)構(gòu)34 線狀雙鏈DNA分子，兩端各有一個(gè)12核苷酸的互補(bǔ)單鏈（粘性末端），稱為cos區(qū)。353、噬菌體感染周期36噬菌體的包裝374、 噬菌體的溶原狀態(tài) 噬菌體感染大腸桿菌后，除能裂解細(xì)胞外，也可能將其DNA直接整合到宿主細(xì)胞的染色體DNA上，并不產(chǎn)生子代

10、噬菌體顆粒，這種情況為溶原狀態(tài)。 人們可以根據(jù)需要改變-DNA或宿主細(xì)胞的性質(zhì)，使噬菌體或處于溶菌狀態(tài)。 DNA重組技術(shù)一般需要噬菌體進(jìn)入溶菌狀態(tài) 。 381）縮短長度2）刪除多余的酶切位點(diǎn)3）加裝選擇標(biāo)記4）構(gòu)建琥珀型密碼子突變體5、-DNA載體的構(gòu)建策略39插入型載體由于該類載體重組與否均可包裝，因而為區(qū)分重組子與非重組子必須攜帶標(biāo)記基因。DNA中缺失部分部分非必要基因，只含有一個(gè)供外源基因插入的酶切位點(diǎn)的DNA載體。40取代型載體* 36-51 kb為包裝的上下限 DNA的可替換片段兩端具有兩個(gè)酶切位點(diǎn)，酶切后替換片段與帶有所有必需基因的左右兩臂分開，由外源DNA片段取代。41選擇標(biāo)記

11、與質(zhì)粒不同，野生型-DNA上缺少合適的選擇標(biāo)記，因此加裝選擇標(biāo)記是-DNA克隆載體構(gòu)建的重要內(nèi)容。 -DNA克隆載體上的選擇標(biāo)記主要有下列兩類： 免疫功能類標(biāo)記 顏色反應(yīng)類標(biāo)記42 加裝選擇標(biāo)記imm434（免疫功能插入失活） imm434基因編碼一種阻止-噬菌體進(jìn)入溶菌循環(huán)的阻遏物。含有完整標(biāo)記基因的-載體進(jìn)入受體細(xì)胞后，建立溶原狀態(tài)，細(xì)菌生長緩慢，形成渾濁斑；當(dāng)外源DNA插入到標(biāo)記基因中，基因滅活， -重組分子便進(jìn)入溶菌循環(huán)，形成透明斑。這種形態(tài)學(xué)上的差異，為分離重組體提供了方便的標(biāo)志。43 插入失活：外源DNA克隆到插入型載 體上，會(huì)使噬菌體的某種生物功能喪失 效力，即所謂的插入失活效應(yīng)

12、。44lacZ（ -半乳糖苷酶插入失活） lacZ基因編碼-半乳糖苷酶，能催化無色的X-gal生成藍(lán)色化合物。當(dāng)外源基因插入到lacZ基因中，基因滅活，不能降解X-gal，不能合成藍(lán)色化合物，形成無色空斑；而空載 體-DNA則產(chǎn)生藍(lán)色透明斑。454）構(gòu)建琥珀型密碼子突變體 琥珀型突變（sup) ：是指由CAG（Gln）向UAG（stop）的突變。 將野生型-DNA上兩個(gè)頭部包裝蛋白的基因中的CAG密碼子突變成UAG。當(dāng)這種-DNA進(jìn)入一般的大腸桿菌菌株后，不能合成有活性的頭部蛋白，也就不能被包裝和裂解細(xì)菌，這樣就可以阻止有害重組體的生物污染及擴(kuò)散。 基因工程實(shí)驗(yàn)中用的菌株含有特異性的校正基因，

13、其編碼產(chǎn)物校正tRNA能專一性地糾正這一突變。46 -DNA重組分子需在體外人工包裝成有感染 力的噬菌體重組顆粒，方可高效導(dǎo)入受體細(xì)胞。 用于體外包裝的蛋白質(zhì)可直接從感染了噬 菌體的大腸桿菌中提取，現(xiàn)已商品化。6、-DNA重組分子的體外包裝47 這些包裝蛋白通常分為相互互補(bǔ)的兩部分： 一部分缺少頭部的 E組份， 另一部分則缺少頭部的D組份。 包裝時(shí)，當(dāng)且僅當(dāng)這兩部分包裝蛋白與重組-DNA分子混合后，包裝才能有效進(jìn)行，任何一種蛋白包裝液被重組-DNA污染后，均不能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒，這也是基于安全而設(shè)計(jì)的。488、-DNA及其重組分子的分離純化 1. 大腸桿菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期 2. 加

14、入-噬菌體懸浮液， 37培養(yǎng)1小時(shí) 3. 用新鮮培養(yǎng)液稀釋，繼續(xù)培養(yǎng)4-12小時(shí) 4. 高速離心，沉淀噬菌體 5. 酚抽提，釋放-DNA 6. 乙醇或異丙醇沉淀DNA499、 -DNA作為載體的優(yōu)點(diǎn)：-DNA可在體外包裝成噬菌體顆粒，能高效轉(zhuǎn)染大腸桿菌-DNA載體的裝載能力為25 kb，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于質(zhì)粒的裝載量重組-DNA分子的篩選較為方便重組-DNA分子的提取較為簡便-DNA載體適合克隆和擴(kuò)增外源DNA片段，但不適合表達(dá)外源基因50 -DNA載體的裝載量最大為25 kb，但在很多情況下，往往需要克隆更大的外源DNA片段，柯斯質(zhì)粒載體的構(gòu)建就是為了進(jìn)一步提高噬菌體DNA的裝載量。 柯斯質(zhì)粒(cos

15、 site-carrying plasmid) 就是含有 -DNA兩端cos區(qū)和質(zhì)粒復(fù)制子的雜種質(zhì)粒載體。 （三）柯斯質(zhì)粒1、柯斯質(zhì)粒的定義51 由于-DNA包裝時(shí)，其包裝蛋白只識(shí)別粘性末端（cos）附近的一小段順序，均1.7kb長，通過特異切割體系，將多聯(lián)體分子切割，然后進(jìn)行包裝。 2、構(gòu)建柯斯質(zhì)粒載體的思路52 將噬菌體DNA中與包裝有關(guān)的序列與質(zhì)粒組裝在一起，既能最大限度地縮短載體的長度，同時(shí)又能保證重組DNA分子在體外仍被包裝成有感染力的顆粒，這便是構(gòu)建柯斯質(zhì)粒載體的思路。53 與噬菌體DNA不同的是：柯斯質(zhì)粒不能在體內(nèi)被包裝，更不能裂解細(xì)胞。相同的是：可體外包裝，具有感染性。 與質(zhì)粒相同的是：柯斯質(zhì)粒具有質(zhì)粒的復(fù)制子，能象質(zhì)粒一樣在宿主體內(nèi)進(jìn)行復(fù)制。它的制備與質(zhì)粒相同。不同的是兼有噬菌體的某些性質(zhì)。54 可以裝載比質(zhì)?；?-DNA大得多的外源DNA 片段，如cos區(qū)及附近順序長為1.7 kb，質(zhì)粒長 為3.3kb，則該考斯質(zhì)粒最大可裝載47kb的 外源DNA。裝載量大55 人類、動(dòng)物、植物的全基因組序列分析往往需要克隆數(shù)百甚至上千kb 的DNA片段， 此時(shí)柯斯質(zhì)粒和噬菌粒載體的裝載量也遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足需要