細(xì)胞工程7胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)課件

CELLENGINEERING細(xì)胞工程第一頁(yè)，共六十一頁(yè)。細(xì)胞工程7胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)第一章緒論4個(gè)學(xué)時(shí)

第二章實(shí)驗(yàn)室配置及基本技術(shù)2個(gè)學(xué)時(shí)

第三章植物細(xì)胞工程的理論(lǐlùn)基礎(chǔ)4個(gè)學(xué)時(shí)

第四章植物組織器官培養(yǎng)技術(shù)6個(gè)學(xué)時(shí)

第五章植物細(xì)胞培養(yǎng)及次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)3個(gè)學(xué)時(shí)

第六章原生質(zhì)體培養(yǎng)和體細(xì)胞雜交3個(gè)學(xué)時(shí)

第七章人工種子及植物種質(zhì)資源保存2個(gè)學(xué)時(shí)

第八章胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)2個(gè)學(xué)時(shí)第九章動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)4個(gè)學(xué)時(shí)

第十章動(dòng)物細(xì)胞融合與單克隆抗體4個(gè)學(xué)時(shí)

第十一章動(dòng)物組織與胚胎工程1個(gè)學(xué)時(shí)

第十二章試管動(dòng)物與克隆動(dòng)物1個(gè)學(xué)時(shí)

課程(kèchéng)初步安排：36學(xué)時(shí)

第二頁(yè)，共六十一頁(yè)。細(xì)胞工程7胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)第七章胚胎(pēitāi)干細(xì)胞培養(yǎng)干細(xì)胞是什么ES/EG細(xì)胞的培養(yǎng)及建系技術(shù)ES/EG細(xì)胞的體外誘導(dǎo)分化(fēnhuà)誘導(dǎo)分化細(xì)胞的永生化ES/EG細(xì)胞技術(shù)學(xué)在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用ES/EG細(xì)胞技術(shù)學(xué)面臨的問(wèn)題和研究趨勢(shì)第三頁(yè)，共六十一頁(yè)。細(xì)胞工程7胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)一、干細(xì)胞（stemcells）是什么(shénme)?具有無(wú)限的或延長(zhǎng)的自我更新(gēngxīn)能力的細(xì)胞?能產(chǎn)生至少一種類型的高度分化的細(xì)胞第四頁(yè)，共六十一頁(yè)。細(xì)胞工程7胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)

從具有的分化潛能(qiánnénɡ)上講：--專能干細(xì)胞--多能干細(xì)胞--全能干細(xì)胞第五頁(yè)，共六十一頁(yè)。細(xì)胞工程7胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)從組織(zǔzhī)發(fā)生即來(lái)源上講：

--胚胎性干細(xì)胞--成體干細(xì)胞/組織干細(xì)胞第六頁(yè)，共六十一頁(yè)。細(xì)胞工程7胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)胚胎性干細(xì)胞是一類(yīlèi)來(lái)自早期胚胎、原始生殖細(xì)胞等源于胚胎的干細(xì)胞，基本特征是有穩(wěn)定地在體外自我更新、穩(wěn)定地維持正常核型和發(fā)育全能或多能性、能夠分化為屬于三胚層范疇的各種類型分化細(xì)胞，甚至參與個(gè)體發(fā)育。--來(lái)自早期胚胎：胚胎干細(xì)胞（embryonicstemcells,ES）--來(lái)自胚胎生殖嵴中的原始生殖細(xì)胞：胚胎生殖細(xì)胞（embryonicgermcells,EG）--來(lái)自畸胎瘤組織：胚胎性癌細(xì)胞（embryonalcarcinomacells,EC）第七頁(yè)，共六十一頁(yè)。細(xì)胞工程7胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)－－1981年，Evens和Martin分別成功的分離和體外培養(yǎng)了小鼠的胚胎干細(xì)胞；－－1995年，Thomson等人分離建立了第一株靈長(zhǎng)類動(dòng)物的胚胎干細(xì)胞；－－1998年，Thomson等建立了第一株人類胚胎干細(xì)胞；－－1998年，Shamblott等建立了第一株人類生殖干細(xì)胞；－－2002年3月，美國(guó)麻省理工學(xué)院科學(xué)家宣布，他們首次利用人體胚胎干細(xì)胞培育出毛細(xì)血管，證明了胚胎干細(xì)胞技術(shù)在治療心血管疾病等領(lǐng)域(lǐnɡyù)的應(yīng)用潛力；－－目前已有報(bào)導(dǎo)，ES細(xì)胞在離體適當(dāng)條件下分化為心肌細(xì)胞，胰島細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞，肝細(xì)胞等。第八頁(yè)，共六十一頁(yè)。細(xì)胞工程7胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)成體干細(xì)胞（adultstemcells,AS），也叫作組織干細(xì)胞（tissuestemcells）是指一群分布在成體組織中處于尚未分化的、具有自我更新并負(fù)有構(gòu)建和補(bǔ)充某種組織的各種類型細(xì)胞潛能的干細(xì)胞。如骨髓的造血干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞；神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)干細(xì)胞；肝干細(xì)胞；骨骼肌干細(xì)胞等。--造血干細(xì)胞可分化為血液系統(tǒng)的各種細(xì)胞；小腸和皮膚中的干細(xì)胞具有分化、補(bǔ)充和更新小腸和皮膚組織的能力。--骨髓干細(xì)胞除了形成各種血細(xì)胞和衍生于間質(zhì)細(xì)胞的各類細(xì)胞外，還可被誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞、肌肉(jīròu)細(xì)胞、骨和肝細(xì)胞等不同分化細(xì)胞。第九頁(yè)，共六十一頁(yè)。細(xì)胞工程7胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)第十頁(yè)，共六十一頁(yè)。細(xì)胞工程7胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)二、ES/EG細(xì)胞的培養(yǎng)(péiyǎng)建系技術(shù)

分離(fēnlí)囊胚的內(nèi)細(xì)胞群與成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)，ES細(xì)胞非分化(fēnhuà)增殖分離胚胎生殖腺細(xì)胞胚胎干細(xì)胞的鑒定定向誘導(dǎo)分化功能細(xì)胞第十一頁(yè)，共六十一頁(yè)。細(xì)胞工程7胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)第十二頁(yè)，共六十一頁(yè)。細(xì)胞工程7胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)1、ES/EG細(xì)胞(xìbāo)的來(lái)源(1)發(fā)育良好的囊胚，從中分離ICM，進(jìn)一步分離培養(yǎng)ES細(xì)胞(2)從胚胎生殖腺中分離出EG細(xì)胞從畸胎瘤中分離出EC細(xì)胞治療性克隆(kèlónɡ)即體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移（SCNT）途徑分離培養(yǎng)ES細(xì)胞

第十三頁(yè)，共六十一頁(yè)。細(xì)胞工程7胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)第十四頁(yè)，共六十一頁(yè)。細(xì)胞工程7胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)第十五頁(yè)，共六十一頁(yè)。細(xì)胞工程7胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)2、ES/EG細(xì)胞(xìbāo)的分化抑制培養(yǎng)目前常用(chánɡyònɡ)的細(xì)胞分化抑制物主要有三種:--飼養(yǎng)層細(xì)胞(feederlayer)--特殊細(xì)胞的條件培養(yǎng)液(conditionedmedium),如BRL(Buffaloratliver)細(xì)胞條件培養(yǎng)液--分化抑制因子(differentiationinhibitoryfactor,DIF),如白血病抑制因子(leukemiainhitoryfactor,LIF)第十六頁(yè)，共六十一頁(yè)。細(xì)胞工程7胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)飼養(yǎng)(sìyǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)法：常用的飼養(yǎng)層細(xì)胞有下列兩種：（1）MEF細(xì)胞(mouseembryonicfibroblast)，取自各種品系小鼠的12dpc胚胎。經(jīng)剪碎和胰蛋白酶消化，常規(guī)分散細(xì)胞培養(yǎng)為單層散布的成纖維細(xì)胞。（2）STO細(xì)胞，來(lái)自SIM小鼠(S)胚胎的對(duì)硫代鳥嘌呤(T)和烏本苷(O)有抗性的成纖維細(xì)胞系，能分泌(fēnmì)干細(xì)胞生長(zhǎng)因子(stemcellfactor,SCF)以及白血病抑制因子(leukemiainhibitoryfactor,LIF)。第十七頁(yè)，共六十一頁(yè)。細(xì)胞工程7胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)無(wú)飼養(yǎng)(sìyǎng)層培養(yǎng)法：飼養(yǎng)層細(xì)胞的制備在一定程度上使ES/EG細(xì)胞培養(yǎng)顯得較繁雜。近來(lái)以添加LIF生長(zhǎng)因子或某些特定細(xì)胞的條件培養(yǎng)液至含F(xiàn)CS的正常培養(yǎng)液，借此替代飼養(yǎng)層細(xì)胞：（1）直接在ES細(xì)胞基礎(chǔ)(jīchǔ)培養(yǎng)液中加入重組LIF（2）Buffalo大鼠肝細(xì)胞條件培養(yǎng)液(BRL-CM)（3）2～3周幼年大鼠心肌細(xì)胞條件培養(yǎng)液(RH-CM)第十八頁(yè)，共六十一頁(yè)。細(xì)胞工程7胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)3、ES/EG細(xì)胞系的特性(tèxìng)和鑒定（1）形態(tài)學(xué)特征(tèzhēng)（2）發(fā)育全能性和分化潛能(qiánnénɡ)鑒定（3）嵌合體動(dòng)物第十九頁(yè)，共六十一頁(yè)。細(xì)胞工程7胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)（1）形態(tài)學(xué)特征(tèzhēng)

體外培養(yǎng)小鼠ES/EG細(xì)胞在抑制(yìzhì)分化培養(yǎng)中呈現(xiàn)一個(gè)或幾個(gè)核仁、且核質(zhì)比高的圓形或卵圓形細(xì)胞，彼此均呈單層或多層緊密堆積而形成島狀或巢狀群體生長(zhǎng)形態(tài)，組成克隆的細(xì)胞彼此界限不清楚，粘連性強(qiáng)。

人ES與EG細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征有所不同，與小鼠ES/EG也有所不同。單層培養(yǎng)時(shí)，人體ES細(xì)胞呈扁平狀群落，且細(xì)胞界限(jièxiàn)清楚。第二十頁(yè)，共六十一頁(yè)。細(xì)胞工程7胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)（2）發(fā)育全能性和分化(fēnhuà)潛能鑒定

小鼠和包括人在內(nèi)的靈長(zhǎng)類動(dòng)物全能或多能性胚胎性干細(xì)胞，具有特有的表達(dá)標(biāo)志(biāozhì)以及在體內(nèi)外的分化特點(diǎn)。第二十一頁(yè)，共六十一頁(yè)。細(xì)胞工程7胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)干細(xì)胞標(biāo)記鼠類EC鼠類ES鼠類EG人類EC人類ES人類EGSSEA-1+++--+SSEA-3---+++SSEA-4---+++TRA-1-60---+++TRA-1-80---+++AKP++++++Oct-4++++？+小鼠與人類多能干細(xì)胞標(biāo)記(biāojì)蛋白表達(dá)譜第二十二頁(yè)，共六十一頁(yè)。細(xì)胞工程7胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)SSEAs(stage-specificembryonicantigen):時(shí)期專一性胚胎抗原TRA-1-60、TRA-1-81:腫瘤排斥抗原AKP：堿性磷酸酶在小鼠及靈長(zhǎng)類的ES細(xì)胞中活性較高，在已分化細(xì)胞中活性明顯降低；

Oct-4:是生殖系專一性轉(zhuǎn)錄因子。作為和胚胎發(fā)育全能/多能性相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，Oct-4通過(guò)多種調(diào)控機(jī)制激活或抑制不同(bùtónɡ)靶基因的轉(zhuǎn)錄，在細(xì)胞的全能/多能性及未分化狀態(tài)的調(diào)控和維持中發(fā)揮重要作用。端粒酶(telomerase):一類核糖核蛋白，與維持真核細(xì)胞染色體末端的端粒長(zhǎng)度和控制細(xì)胞壽命有關(guān)。人ES細(xì)胞的端粒酶活性高，而分化細(xì)胞一般難以檢測(cè)到；胚胎(pēitāi)干細(xì)胞的特異性表達(dá)標(biāo)志：第二十三頁(yè)，共六十一頁(yè)。細(xì)胞工程7胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)ES/EG細(xì)胞在體外被刺激分化為各種類型細(xì)胞是其最基本的屬性;ES/EG細(xì)胞接種于同一品系的小鼠或免疫缺陷小鼠腹股溝、眼窩、腹腔等可以形成(xíngchéng)由內(nèi)胚層、中胚層和外胚層細(xì)胞構(gòu)成的畸胎瘤。胚胎(pēitāi)干細(xì)胞的體內(nèi)、外分化特點(diǎn)：第二十四頁(yè)，共六十一頁(yè)。細(xì)胞工程7胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)

組織和器官的細(xì)胞由含有兩個(gè)或兩個(gè)以上基因型構(gòu)建而成的完整個(gè)體(gètǐ)稱為嵌合體動(dòng)物（chimaera）。把ES/EG細(xì)胞注入胚泡或與桑椹胚聚集，使其與正常胚胎結(jié)合在一起，并參與宿主胚胎發(fā)育，可形成嵌合體動(dòng)物的各種組織和器官，包含生殖系嵌合體動(dòng)物可通過(guò)毛色、皮膚顏色等外觀指標(biāo)進(jìn)行判定或是取器官組織進(jìn)行同功酶檢測(cè)(3)嵌合體動(dòng)物(dòngwù)第二十五頁(yè)，共六十一頁(yè)。細(xì)胞工程7胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)三、ES/EG細(xì)胞(xìbāo)的體外誘導(dǎo)分化第二十六頁(yè)，共六十一頁(yè)。細(xì)胞工程7胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)1、基本原理細(xì)胞誘導(dǎo)分化是一個(gè)細(xì)胞與其微環(huán)境相互間復(fù)雜而又精密協(xié)調(diào)的分子細(xì)胞學(xué)過(guò)程，是胚胎正常發(fā)育(fāyù)過(guò)程中重要而基本的現(xiàn)象；

ES細(xì)胞(xìbāo)是體外研究誘導(dǎo)分化的較理想模型，在體外被誘導(dǎo)分化的途徑可能與在體胚胎細(xì)胞(xìbāo)的不完全相同；在體胚胎的細(xì)胞分化(fēnhuà)過(guò)程中，誘導(dǎo)作用的結(jié)果不只是決定于各種誘導(dǎo)物質(zhì)的性質(zhì)和專一性，同時(shí)也決定于被誘導(dǎo)細(xì)胞的反應(yīng)能力(competence)。后者受遺傳、發(fā)育潛能等內(nèi)在因素的限制；第二十七頁(yè)，共六十一頁(yè)。細(xì)胞工程7胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)

ES細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)中，所用誘導(dǎo)物質(zhì)繁多，誘導(dǎo)模式不盡相同，按其作用機(jī)理(jīlǐ)大致分為兩類：--使被誘導(dǎo)細(xì)胞可逆性輕度損傷，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞分化無(wú)機(jī)物、有機(jī)酸、醇、亞甲基鹽、硫氫化物等--誘導(dǎo)物通過(guò)其與被誘導(dǎo)細(xì)胞表面的受體結(jié)合而誘導(dǎo)細(xì)胞分化類固醇激素、維甲酸衍生物、多肽生長(zhǎng)因子等

同一種誘導(dǎo)物可以誘導(dǎo)出不同類型細(xì)胞(xìbāo)或變化多端的構(gòu)造，不僅涉及誘導(dǎo)劑的濃度差別、誘導(dǎo)作用模式和微環(huán)境的未知因素等，而且可能與被誘導(dǎo)細(xì)胞(xìbāo)本身的發(fā)育潛能和對(duì)誘導(dǎo)劑的反應(yīng)性等差別有關(guān)。第二十八頁(yè)，共六十一頁(yè)。細(xì)胞工程7胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)

ES細(xì)胞(xìbāo)體外誘導(dǎo)分化途徑可分為：--譜系分化（lineagedifferentiation），有利于認(rèn)識(shí)組織譜系細(xì)胞分化機(jī)理和全過(guò)程。ES細(xì)胞譜系祖細(xì)胞譜系定型細(xì)胞終末分化細(xì)胞--定向分化（committeddiffereniation），需設(shè)法控制導(dǎo)向產(chǎn)生單一類型的分化細(xì)胞。對(duì)ES細(xì)胞轉(zhuǎn)染細(xì)胞專一的轉(zhuǎn)錄因子、標(biāo)志基因、細(xì)胞分化因子結(jié)合報(bào)告基因和誘導(dǎo)條件選擇等手段，探索定向誘導(dǎo)分化途徑第二十九頁(yè)，共六十一頁(yè)。細(xì)胞工程7胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)第三十頁(yè)，共六十一頁(yè)。細(xì)胞工程7胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)第三十一頁(yè)，共六十一頁(yè)。細(xì)胞工程7胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)2、ES細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化(fēnhuà)的基本方法單層ES細(xì)胞培養(yǎng)和誘導(dǎo)(yòudǎo)分化：較難分化為單一類型的細(xì)胞ES細(xì)胞擬胚體形成和誘導(dǎo)分化：相對(duì)誘導(dǎo)分化細(xì)胞類型較單一,具體方法有：（1）軟瓊脂培養(yǎng)（2）懸滴培養(yǎng)

第三十二頁(yè)，共六十一頁(yè)。細(xì)胞工程7胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)制備ES單細(xì)胞懸浮液培養(yǎng)皿蓋上接種20ul/滴，直徑10cm的培養(yǎng)皿蓋蓋上帶有懸浮細(xì)胞小滴的蓋子培養(yǎng)皿內(nèi)加PBS培養(yǎng)皿邊緣用膜封置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)3d后，轉(zhuǎn)移擬胚體至含細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑的培養(yǎng)皿或微孔板進(jìn)一步培養(yǎng)然后,移放入鋪有0.1%白明膠的培養(yǎng)皿或微孔板內(nèi)在培養(yǎng)液中再培養(yǎng)可被誘導(dǎo)分化為不同類型細(xì)胞ES細(xì)胞(xìbāo)體外懸滴培養(yǎng)第三十三頁(yè)，共六十一頁(yè)。細(xì)胞工程7胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)3、ES細(xì)胞體外誘導(dǎo)(yòudǎo)分化舉例造血細(xì)胞內(nèi)皮細(xì)胞與血管神經(jīng)細(xì)胞脂肪細(xì)胞心肌(xīnjī)和其他肌肉細(xì)胞軟骨細(xì)胞胰島細(xì)胞第三十四頁(yè)，共六十一頁(yè)。細(xì)胞工程7胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)小鼠ES細(xì)胞擬胚體在體外可以分化為類似于早期胚胎卵黃囊血島樣的結(jié)構(gòu)并分化產(chǎn)生(chǎnshēng)各種造血系統(tǒng)的細(xì)胞：①用胰蛋白酶消化小鼠ES細(xì)胞擬胚體成單個(gè)細(xì)胞，經(jīng)干細(xì)胞因子(SCF)、血小板生成素(TPO)和條件培養(yǎng)液處理，誘導(dǎo)其定向分化為造血干細(xì)胞；②用原代骨髓基質(zhì)細(xì)胞作飼養(yǎng)層和SCF及IL-6細(xì)胞因子處理可進(jìn)一步使ES細(xì)胞來(lái)源的造血干細(xì)胞分化為B淋巴細(xì)胞系。造血(zàoxuè)細(xì)胞第三十五頁(yè)，共六十一頁(yè)。細(xì)胞工程7胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞與血管(xuèguǎn)小鼠ES細(xì)胞擬胚體在體外可以分化為類似于早期胚胎卵黃囊血島樣的結(jié)構(gòu)，其中(qízhōng)也有內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)：①利用經(jīng)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)基因轉(zhuǎn)染的小鼠ES細(xì)胞在含RA培養(yǎng)液中經(jīng)懸滴培養(yǎng)形成擬胚體；②再繼續(xù)貼壁培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)擬胚體周圍呈輻射狀長(zhǎng)出許多血管樣結(jié)構(gòu)。將外源重組TGF-β1添加至培養(yǎng)液，同樣也能誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞組成的血管樣結(jié)構(gòu)。第三十六頁(yè)，共六十一頁(yè)。細(xì)胞工程7胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)心肌和其它肌肉(jīròu)細(xì)胞

懸浮或懸滴培養(yǎng)的小鼠ES細(xì)胞擬胚體在RA誘導(dǎo)條件下貼壁生長(zhǎng)數(shù)天，常出現(xiàn)某些分化細(xì)胞集落具有節(jié)律(jiélǜ)性自發(fā)收縮的現(xiàn)象，顯然是肌細(xì)胞：DMSO誘導(dǎo)ES細(xì)胞擬胚體可以形成心肌、平滑肌和骨骼肌等多種類型肌細(xì)胞，用肌肉(jīròu)專一性的調(diào)節(jié)因子MyoD基因轉(zhuǎn)染ES細(xì)胞并結(jié)合DMSO誘導(dǎo)處理，額外表達(dá)MyoD基因的ES細(xì)胞主要分化為骨骼肌且常融合成肌管。第三十七頁(yè)，共六十一頁(yè)。細(xì)胞工程7胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)ES細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化是至今仍未解決、正在探索中的問(wèn)題。根據(jù)國(guó)外少數(shù)報(bào)道和國(guó)內(nèi)的經(jīng)驗(yàn)，對(duì)ES細(xì)胞轉(zhuǎn)染細(xì)胞專一的轉(zhuǎn)錄因子、標(biāo)志基因或是(huòshì)有關(guān)細(xì)胞分化因子等遺傳操作，并結(jié)合誘導(dǎo)條件選擇等手段，是一條可能的探索ES細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化的途徑。第三十八頁(yè)，共六十一頁(yè)。細(xì)胞工程7胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)四、ES/EG細(xì)胞誘導(dǎo)(yòudǎo)分化細(xì)胞的永生化

尋找建立ES/EG細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生的分化細(xì)胞永生化途徑是目前(mùqián)ES/EG細(xì)胞研究領(lǐng)域待解決的問(wèn)題。第三十九頁(yè)，共六十一頁(yè)。細(xì)胞工程7胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)五、ES/EG培養(yǎng)與誘導(dǎo)(yòudǎo)分化的意義哺乳類發(fā)育(fāyù)的體外模型人體的基因和細(xì)胞(xìbāo)治療組織工程的種子細(xì)胞來(lái)源第四十頁(yè)，共六十一頁(yè)。細(xì)胞工程7胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)第四十一頁(yè)，共六十一頁(yè)。細(xì)胞工程7胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)哺乳動(dòng)物早期胚胎一般體積很小，又在宮內(nèi)發(fā)育，在體內(nèi)研究胚胎發(fā)育和各類細(xì)胞分化及其機(jī)理幾乎不可能；ES細(xì)胞具有完整的發(fā)育潛能性，而且對(duì)所有調(diào)節(jié)正常發(fā)育的信號(hào)具有應(yīng)答(yìngdá)能力。雖然ES細(xì)胞體外分化途徑和機(jī)制與在體胚胎不完全相同，但在分子水平有共同或相似之處，是研究特定類型細(xì)胞分化、某些前體細(xì)胞起源和細(xì)胞譜系演變較理想的實(shí)驗(yàn)體系；許多國(guó)家在法律上禁止以克隆或復(fù)制人為目的的前提下，已允許將人ES細(xì)胞類似于小鼠ES細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)一樣，用于研究人類胚胎發(fā)育、分化和調(diào)節(jié)信號(hào)等事件。哺乳類發(fā)育(fāyù)的體外模型第四十二頁(yè)，共六十一頁(yè)。細(xì)胞工程7胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)人體(réntǐ)的基因和細(xì)胞治療

這里的基因治療是指用遺傳改造過(guò)的人體細(xì)胞直接移植或輸入(shūrù)病人體內(nèi)，達(dá)到控制和治愈疾病為目的的治療手段，又稱細(xì)胞治療。第四十三頁(yè)，共六十一頁(yè)。細(xì)胞工程7胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)目前常說(shuō)的基因治療技術(shù)雖然能把編碼正常序列(xùliè)的基因?qū)胪蛔兗?xì)胞而使突變基因的功能得到糾正，但導(dǎo)入基因的整合和表達(dá)難以精確控制，特別是基因插入后對(duì)其他基因產(chǎn)生的效應(yīng)尚無(wú)法預(yù)知。更大問(wèn)題是，許多被用作基因操作的細(xì)胞在體外不易穩(wěn)定地被轉(zhuǎn)染和增殖傳代；ES細(xì)胞是基因治療的較理想的靶細(xì)胞，經(jīng)遺傳操作后一般仍能穩(wěn)定地在體外增殖傳代，克服了目前基因治療中需要大量靶細(xì)胞來(lái)源的主要問(wèn)題。第四十四頁(yè)，共六十一頁(yè)。細(xì)胞工程7胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)定向(dìnɡxiànɡ)誘導(dǎo)分化，選擇治療因子(yīnzǐ)基因表達(dá)

人ES細(xì)胞(xìbāo)基因操作（克服免疫學(xué)障礙）

多種MHC組合的ES細(xì)胞庫(kù)

組織譜系干細(xì)胞（如造血干細(xì)胞）

功能性分化細(xì)胞（如神經(jīng)細(xì)胞）移植移植

不同類型疾病的宿主

基因組被改造的ES細(xì)胞異源性基因表達(dá)基因修飾

基因敲除、敲入定向誘導(dǎo)分化選擇

組織譜系干細(xì)胞或功能性分化細(xì)胞移植圖2-2-1用于基因和細(xì)胞治療的人ES細(xì)胞工程示意圖基本策略1第四十五頁(yè)，共六十一頁(yè)。細(xì)胞工程7胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基本(jīběn)策略2欲接受細(xì)胞治療(zhìliáo)患者的體細(xì)胞核導(dǎo)入去核卵細(xì)胞體外發(fā)育(fāyù)胚泡期專用ES細(xì)胞特化細(xì)胞分離培養(yǎng)體外誘導(dǎo)分化回輸?shù)谒氖?yè)，共六十一頁(yè)。細(xì)胞工程7胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞治療的臨床(línchuánɡ)應(yīng)用前景神經(jīng)系統(tǒng)疾病(jíbìng)骨和軟骨疾病血液病肝病第四十七頁(yè)，共六十一頁(yè)。細(xì)胞工程7胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)神經(jīng)系統(tǒng)(shénjīngxìtǒng)疾病

根據(jù)小鼠ES/EG細(xì)胞研究資料，由于各種類型神經(jīng)細(xì)胞因某種原因死亡而成熟神經(jīng)細(xì)胞又不能分裂、補(bǔ)充和替代(tìdài)死亡細(xì)胞引起的神經(jīng)系統(tǒng)疾病如Parkinson’s疾病，Alzheimer’s病、多發(fā)性硬化癥等，有望通過(guò)人ES/EG細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞治療。新近，產(chǎn)生多巴胺的神經(jīng)細(xì)胞已能從小鼠ES細(xì)胞衍生(yǎnshēnɡ)而來(lái)，為細(xì)胞治療Parkinson’s病的ES細(xì)胞來(lái)源問(wèn)題提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。第四十八頁(yè)，共六十一頁(yè)。細(xì)胞工程7胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)骨和軟骨(ruǎngǔ)疾病ES/EG細(xì)胞可能在體外被誘導(dǎo)為骨和軟骨，這些細(xì)胞被導(dǎo)入骨關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)軟骨損傷區(qū)域，或因骨折(gǔzhé)、手術(shù)而引起的較大骨隙中，這類從ES細(xì)胞衍生的骨和軟骨細(xì)胞在被移植部位自我修復(fù)的優(yōu)點(diǎn)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)現(xiàn)行的組織移植。第四十九頁(yè)，共六十一頁(yè)。細(xì)胞工程7胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)血液病ES和造血干細(xì)胞(xìbāo)研究有助于產(chǎn)生供細(xì)胞(xìbāo)移植用的、不含有鐮刀狀血球突變的血細(xì)胞。第五十頁(yè)，共六十一頁(yè)。細(xì)胞工程7胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)肝病利用肝干細(xì)胞移植治療肝病取得(qǔdé)了重要進(jìn)展。第五十一頁(yè)，共六十一頁(yè)。細(xì)胞工程7胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)

組織(zǔzhī)工程的種子細(xì)胞來(lái)源人體ES細(xì)胞技術(shù)(jìshù)學(xué)的發(fā)生和發(fā)展，有望解決目前組織或器官修復(fù)中的難題。第五十二頁(yè)，共六十一頁(yè)。細(xì)胞工程7胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)

設(shè)想是選擇與人體細(xì)胞兼容性較好的生物材料，按缺損組織或器官的要求設(shè)計(jì)制成模型或支架放在體外培養(yǎng)系統(tǒng)中，使ES細(xì)胞或其定向誘導(dǎo)分化細(xì)胞沿著(yánzhe)模型或支架不斷地生長(zhǎng)擴(kuò)增，構(gòu)建成新的組織或器官。但ES細(xì)胞定向分化和構(gòu)成組織和器官中細(xì)胞類型的復(fù)雜性等諸多問(wèn)題尚待解決；

目前工作是著重于從成年或幼年器官和組織的碎片中分離、培養(yǎng)和擴(kuò)增某一類型的組織干細(xì)胞，經(jīng)過(guò)體外培養(yǎng)擴(kuò)增有可能作為組織工程的種子細(xì)胞來(lái)源。例如，從骨髓分離和擴(kuò)增間質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemcell,MSC)，用作骨折愈合、肌腱韌帶修復(fù)、肌肉再生和造血重建等組織工程的種子細(xì)胞。第五十三頁(yè)，共六十一頁(yè)。細(xì)胞工程7胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)六、ES細(xì)胞研究面臨的問(wèn)題(wèntí)和研究趨勢(shì)--如何解決用于人類胚胎干細(xì)胞研究的胚胎來(lái)源問(wèn)題？--如何分離(fēnlí)、純化干細(xì)胞？--如何保持體外培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞的全能性，并控制定向誘導(dǎo)分化？--如何使ES細(xì)胞誘導(dǎo)分化產(chǎn)生的分化細(xì)胞永生化？--分化后的細(xì)胞是否有致瘤性？--如何使干細(xì)胞在體外發(fā)育成完整的器官？--如何克服分化細(xì)胞移植后仍有可能發(fā)生的免疫排斥？--有關(guān)倫理道德和法律以及商業(yè)應(yīng)用等問(wèn)題第五十四頁(yè)，共六十一頁(yè)。細(xì)胞工程7胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)--改善ES細(xì)胞的體外培養(yǎng)條件，建立更有效、更簡(jiǎn)便的獲得ES細(xì)胞的方法；--定向誘導(dǎo)分化成特定類型細(xì)胞，用于臨床疾病治療并解決免疫排斥和潛在的致腫瘤的問(wèn)題(wèntí)；--成體干細(xì)胞的橫向分化的能力以及與胚胎干細(xì)胞的比較：成體干細(xì)胞能否替代胚胎干細(xì)胞？第五十五頁(yè)，共六十一頁(yè)。細(xì)胞工程7胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)嵌合體一詞的英文是chimera，源于希臘神話，是指獅子頭、山羊(shānyáng)身和蛇尾的雌性怪物。有關(guān)嵌合體神話在各國(guó)文化中都有嵌合體的科學(xué)概念則是，任何由兩個(gè)或兩個(gè)以上遺傳上不同的組織構(gòu)成的機(jī)體。它可以是任何不同物種(wùzhǒng)的混合，但目前較關(guān)注的是動(dòng)物與人的嵌合體。嵌合體與雜合體（hybrid）不同。雜合體是由來(lái)自不同物種的兩個(gè)配子(pèizǐ)形成一個(gè)合子。一個(gè)雜合體的所有細(xì)胞來(lái)源于這一合子。第五十六頁(yè)，共六十一頁(yè)。細(xì)胞工程7胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)

最近美國(guó)政府封殺了斯坦福大學(xué)的一項(xiàng)向小鼠大腦植入人類神經(jīng)干細(xì)胞的研究，引起了國(guó)際學(xué)界和公眾的關(guān)注。這項(xiàng)研究是當(dāng)前干細(xì)胞研究前沿的一個(gè)重要方面，涉及到一個(gè)機(jī)體(jītǐ)擁有兩種不同物種的細(xì)胞或組織，這種嵌合體研究引起許多新穎的倫理問(wèn)題，激發(fā)了對(duì)這類研究應(yīng)該采取什么行動(dòng)的倫理爭(zhēng)論。第五十七頁(yè)，共六十一頁(yè)。細(xì)胞工程7胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)第一是為了建立動(dòng)物模型。

例如世界上首次克隆牛的華裔美籍科學(xué)家楊向中創(chuàng)造了兔子的人類心臟病模型，可以(kěyǐ)表達(dá)人類引致心臟病的基因；而原來(lái)用大鼠建立的模型不能表達(dá)人的基因，用大鼠模型試驗(yàn)的藥物對(duì)人體無(wú)用為什么要?jiǎng)?chuàng)建(chuàngjiàn)嵌合體呢？第五十八頁(yè)，共六十一頁(yè)。細(xì)胞工程7胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)干細(xì)胞移植到病人體內(nèi)后如何行為？它們?nèi)绾?/p>