上海交通大學(xué)微生物實驗實驗七污水中噬菌體的分離與效價測定課件

實驗七污水中噬菌體的分離與效價測定

實驗?zāi)康恼莆帐删w分離的基本原理和方法學(xué)會觀察噬菌斑了解噬菌斑的效價測定方法大腸菌群的鑒定（EMB培養(yǎng)基上的典型菌落的革蘭氏染色）噬菌體是專性寄生物，必需寄生細菌才能繁殖，伴隨細菌的分布而分布，只要有細菌的地方，就有噬菌體噬菌體顆?？梢栽诃h(huán)境中獨立存活，但不能繁殖噬菌體對宿主的寄生通常具有特異性溫和噬菌體和烈性噬菌體烈性噬菌體在液體中，可以使渾濁的菌液變?yōu)槌吻辶倚允删w在固體瓊脂平板，可以形成透明的噬菌斑利用噬菌體斑的特征可以分離、純化、效價滴定基本原理噬菌斑的形成

在固體瓊脂培養(yǎng)基上，噬菌體感染細菌后，在宿主細胞內(nèi)進行核酸和蛋白質(zhì)的生物合成，最后裝配成噬菌體完整的顆粒，通過裂解宿主細胞釋放出來，使感染的細菌不能生長，從而形成肉眼可以觀察到的透明或渾濁的空斑，稱為噬菌斑。如何測定噬菌體的效價效價指1ml培養(yǎng)液中所含有活的噬菌體的數(shù)量采用雙層瓊脂平板法，進行噬菌斑的計數(shù)，計量單位為pfu，即plaqueformingunit(噬菌斑形成單位）。獲得的噬菌體濾液作10倍的倍比遞減稀釋取每個稀釋度噬菌體0.1ml加入0.9ml的指示菌，混勻后，加入到上層瓊脂，傾注平皿，選擇30－300個pfu的平皿計算每毫升未稀釋的噬菌體原液的效價。濾液收集在一個無菌的1.5mlEppendrof管中，獲得噬菌體的濾液培養(yǎng)指示菌大腸桿菌MC106118小時（已經(jīng)培養(yǎng)）LB培養(yǎng)基(在試管中)操作程序每組取4個1.5ml的Eppendrof離心管，分別標注

100、10-1、10-2

、10-3

。4個Eppendrof離心管分別各加900ulLB，從噬菌體裂解液中取100ul于100離心管中，混勻后，取100ul于10-1離心管中，依次類推10倍倍比遞減稀釋至10-3

。（一個移液槍頭用到底）另取4支無菌的Eppendrof離心管，分別標記10-3

、

10-2、10-1、100

（注意次序），從上述相對應(yīng)的各稀釋管中分別取300ul

噬菌體液，然后各管加200ul指示菌MC1061，CaCl2

50ul混勻后，37°C溫箱孵育20min。（每組可以使用3個移液槍頭，注意次序，不能混淆）37°C18小時觀察結(jié)果,結(jié)果觀察時間為明天11:30-12:30記錄噬菌斑的數(shù)量與先前的噬菌體裂解液的稀釋度相對應(yīng)，計算噬菌體的含量每個初次分離的噬菌斑可能含有多種噬菌體，要獲得單一的噬菌體，必需進行噬菌體的純化污水中大腸菌群的測定接種乳糖膽鹽發(fā)酵管產(chǎn)酸產(chǎn)氣的試管接種EMB培養(yǎng)基典型菌落的革蘭氏染色描述菌落和細菌的特征革蘭氏染色步驟乙醇脫色：滴洗至玻片下端剛不顯紫色止－水洗（關(guān)鍵）復(fù)染劑(如番紅)復(fù)染：番紅染液1分鐘－水洗－吸干－顯微鏡觀察。經(jīng)此方法染色后，細胞保留初染劑藍紫色的細菌為革蘭氏陽性菌；如果細胞中初染劑被脫色劑洗脫而使細菌染上復(fù)染劑的顏色(紅色)，該菌屬于革蘭氏陰性菌。實驗報告實驗?zāi)康膶嶒炘?/p>