微生物學實驗1口腔微生物的染色觀察與顯微鏡油鏡的使用;細菌的革蘭氏染色

微生物學實驗應當掌握1、微生物的觀察方法（制片、染色、油鏡的使用）2、微生物的培養(yǎng)方法（培養(yǎng)基配制、分裝、包扎、滅菌）3、無菌操作技術（火焰滅菌、倒平板、劃線、涂平板、接種）第一頁，共三十二頁。本課程的成績考核：基礎實驗：60%由單個實驗的成績相加組成。每次實驗由實驗指導老師根據(jù)出勤、實驗操作、實驗報告等進行評定，具體比例為：實驗出勤及實驗態(tài)度占20％；實際操作30％；實技能考核30％；實驗報告占20％。自主設計實驗：40%設計實驗方案實驗操作總結第二頁，共三十二頁。實驗一

細菌的革蘭氏染色

實驗目的

實驗原理

實驗材料

實驗方法實驗結果

注意事項

實驗報告

思考題微生物學實驗-1第三頁，共三十二頁。1.了解革蘭氏染色法的原理及其在細菌分類鑒定中的重要性。2.學習并掌握革蘭氏染色技術，進一步熟練光學顯微鏡油鏡的使用技術。實驗目的第四頁，共三十二頁。革蘭氏染色法（Gramstaining）是微生物學中常用的一種染色方法，該染色法由丹麥醫(yī)生（ChristianGram）于1884年創(chuàng)立，故名。實驗原理第五頁，共三十二頁。G+細菌G-細菌第六頁，共三十二頁。革蘭氏染色機理

G+細菌由于細胞壁較厚、肽聚糖含量較高和其分子交聯(lián)度較緊密，故在用乙醇洗脫時，肽聚糖網(wǎng)孔會因脫水而明顯收縮，因不含脂類，故乙醇處理不能在壁上溶出縫隙，因此，結晶紫與碘復合物仍牢牢阻留在其細胞內，使其呈現(xiàn)紫色。

G-細菌因其壁薄、肽聚糖含量低和交聯(lián)松散，故遇乙醇后，肽聚糖網(wǎng)孔不易收縮，加上它的類脂含量高，所以當乙醇把類脂溶解后，在細胞壁上就會出現(xiàn)較大的縫隙，結晶紫與碘的復合物極易被溶出細胞壁，因此，通過乙醇脫色后，細胞又呈無色。這時再經番紅復染，就使G-細菌染成紅色，而G+細菌仍呈紫色。第七頁，共三十二頁。結晶紫初染全部細胞紫色碘液媒染全部細胞紫色乙醇脫色G-菌無色G+菌紫色

番紅復染G-菌紅色G+菌紫色革蘭氏染色各步驟時細菌的外觀第八頁，共三十二頁。結晶紫初染碘液媒染乙醇脫色番紅復染結晶紫碘液乙醇番紅第九頁，共三十二頁。菌種大腸桿菌（Escherichiacoli）金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）試劑：

蒸餾水；草酸銨結晶紫染液；盧戈氏碘液95%乙醇；番紅復染液；香柏油；二甲苯光學顯微鏡實驗材料第十頁，共三十二頁。革蘭氏染色操作步驟水洗干燥鏡檢（油鏡）涂片滴水取菌火焰固定結晶紫染色1分鐘水洗碘液1分鐘乙醇脫色（20~30秒） 水洗番紅1分鐘水洗實驗方法自然干燥第十一頁，共三十二頁。第十二頁，共三十二頁。E.coliS.aureus混合菌涂片方法示意圖第十三頁，共三十二頁。第十四頁，共三十二頁。分辨率D=——數(shù)值孔徑NA＝n×sin—an=1.515空氣n=1λ2NA2a第十五頁，共三十二頁。電源電源第十六頁，共三十二頁。顯微鏡油鏡的使用與保護插上電源插頭，打開顯微鏡電源開關。調節(jié)顯微鏡光源。先用低倍鏡、高倍鏡查找標本視野，下降載物臺約2cm，加香柏油一滴于標本的待檢部位，換用油鏡觀察。換用油鏡后，眼睛從側面注視油鏡頭，緩慢上升載物臺至油圈不再擴大為止，此時鏡頭幾乎與裝片接觸，但不可壓及裝片。觀察標本時，雙眼同時掙開，左眼觀察，右眼畫圖。油鏡用畢，轉動粗調將載物臺下降，取下標本，用擦鏡紙沾少許二甲苯將鏡頭擦凈，然后再用擦鏡紙擦去二甲苯。7.使各部分還原，物鏡鏡頭呈八字形，光源強度調至最暗，關閉電源，罩上防塵罩，收拾干凈臺面。第十七頁，共三十二頁。第十八頁，共三十二頁。金黃色葡萄球菌(G+)大腸桿菌(G-)實驗結果第十九頁，共三十二頁。大腸桿菌(G-)和金黃色葡萄球菌(G+)第二十頁，共三十二頁。注意事項1.涂片不宜過厚，以免脫色不完全造成假陽性；自然干燥后再進行火焰固定（以玻片不燙手為宜）。2.染色過程中勿使染色液干涸。3.乙醇脫色是革蘭氏染色操作的關鍵環(huán)節(jié)，脫色不足陰性菌被誤染成陽性菌；脫色過度，會使陽性菌被誤染成陰性菌。4.選用培養(yǎng)18~24h菌齡的細菌為宜。若菌齡太老，由于菌體死亡或自溶常使會使革蘭氏陽性菌轉成陰性反應。第二十一頁，共三十二頁。實驗報告Escherichiacoli

10×100Staphylococcusaureus

10×100混合菌10×100第二十二頁，共三十二頁。1．通過本實驗你認為哪些環(huán)節(jié)會影響革蘭氏染色結果的正確性？其中最關鍵的環(huán)節(jié)是什么？思考題第二十三頁，共三十二頁。實驗二

口腔微生物的染色觀察與顯微鏡油鏡的使用

實驗目的

實驗原理

實驗材料

實驗方法實驗結果

注意事項

實驗報告

思考題微生物學實驗-1第二十四頁，共三十二頁。學習并初步掌握細菌的單染色法。了解口腔內微生物的種類。掌握油鏡的使用方法。實驗目的第二十五頁，共三十二頁。細菌的單染色法是微生物學中常用的一種染色方法。人體口腔中特別是在牙垢中，有細菌、真菌、支原體、口腔原蟲、病毒等數(shù)量眾多的微生物，用無菌牙簽刮取少許牙垢，涂片染色后用顯微鏡下即可觀察到各類微生物的形態(tài)。實驗原理第二十六頁，共三十二頁。試劑：

蒸餾水；石碳酸復紅染液；香柏油；二甲苯光學顯微鏡、滅菌牙簽、載玻片實驗材料第二十七頁，共三十二頁?？谇晃⑸锶旧僮鞑襟E干燥鏡檢（油鏡）涂片滴水刮取牙垢火焰固定革蘭氏染色或復紅染色1分鐘水洗實驗方法自然干燥第二十八頁，共三十二頁。實驗結果第二十九頁，共三十二頁。第三十頁，共三十二頁。第三十一頁，共三十二頁。注意事項1