細胞生物學(xué)-5細胞研究技術(shù)課件

照明方式通常為落射式，即光源通過物鏡投射于樣品上；2.

光源為紫外光，波長較短，分辨力高于普通顯微鏡；3.

有兩個特殊的濾光片，光源前的用以濾除可見光，目鏡和物鏡之間的用于濾除紫外線，用以保護人目。第五章細胞研究的細胞生物學(xué)技術(shù)暗視野顯微鏡

暗視野顯微鏡（darkfieldmicroscope）的聚光鏡中央有擋光片，使照明光線不直接進人物鏡，只允許被標本反射和衍射的光線進入物鏡，因而視野的背景是黑的，物體的邊緣是亮的。利用這種顯微鏡能見到小至4-200nm的微粒子，分辨率可比普通顯微鏡高50倍。第五章細胞研究的細胞生物學(xué)技術(shù)倒置顯微鏡

組成和普通顯微鏡一樣，只不過物鏡與照明系統(tǒng)顛倒，前者在載物臺之下，后者在載物臺之上，用于觀察培養(yǎng)的活細胞，通常具有相差物鏡。

在裝配設(shè)計上趨于采用組合方式，集普通光鏡加相差、熒光、暗視野、DIC、攝影裝置于一體，從而操作靈活，使用方便。第五章細胞研究的細胞生物學(xué)技術(shù)物鏡弧光燈熒光濾光鏡聚焦光圈目鏡濾光鏡激光器檢測針孔光源針孔光電倍增管熒光顯微鏡的工作原理激光掃描共聚焦顯微鏡的工作原理濾光鏡物鏡熒光濾光鏡第五章細胞研究的細胞生物學(xué)技術(shù)激光共聚焦掃描顯微鏡既可以用于觀察細胞形態(tài)，也可以用于細胞內(nèi)生化成分的定量分析、光密度統(tǒng)計以及細胞形態(tài)的定量。第五章細胞研究的細胞生物學(xué)技術(shù)激光共聚焦顯微鏡的應(yīng)用單、雙、三,四色標記檢測。精確的一、二、三、四維觀察。高品質(zhì)的熒光成像、透射成像、物體表面反射成像。靜態(tài)和動態(tài)觀察(CA2+,pH,膜電位,膜流動性等)。定性以及定量分析。特殊的光反應(yīng)(FREP,FRAP,CAGED-UNCAGED等)。第五章細胞研究的細胞生物學(xué)技術(shù)細胞內(nèi)自由基的變化第五章細胞研究的細胞生物學(xué)技術(shù)細胞內(nèi)NO的變化第五章細胞研究的細胞生物學(xué)技術(shù)原子力顯微鏡利用原子之間的范德華力（VanDerWaalsForce）作用來呈現(xiàn)樣品的表面特性。

第五章細胞研究的細胞生物學(xué)技術(shù)

第五章細胞研究的細胞生物學(xué)技術(shù)二、顯微操作技術(shù)

顯微操作技術(shù)（micromanipulationtechnique）是指在高倍復(fù)式顯微鏡下，利用顯微操作器進行細胞或早期胚胎操作的一種方法。顯微操作器是用以控制顯微注射針在顯微鏡視野內(nèi)移動的機械裝置。

第五章細胞研究的細胞生物學(xué)技術(shù)三、圖像分析系統(tǒng)主要用于照片、實物、組織切片、細胞爬片等組織化學(xué)取圖和灰度分析。免疫組織化學(xué)檢測細胞內(nèi)源MAPKp42蛋白表達E

第五章細胞研究的細胞生物學(xué)技術(shù)三、激光顯微切割技術(shù)

第五章細胞研究的細胞生物學(xué)技術(shù)第四節(jié)細胞培養(yǎng)技術(shù)一、細胞培養(yǎng)的基本條件無菌操作室、超凈工作臺（生物安全柜）、倒置顯微鏡、CO2培養(yǎng)箱、消毒設(shè)備、超聲清洗儀、烤箱、離心機、蒸餾水器（超純水）、液氮罐、冰箱、濾器以及天平等。相關(guān)設(shè)備：流式細胞儀、微板測試系統(tǒng)。二、細胞培養(yǎng)的基本知識培養(yǎng)細胞的基本概念原代培養(yǎng)：直接從活體組織中分離出細胞，在培養(yǎng)條件下傳1至10代的培養(yǎng)方法。原代培養(yǎng)一般不能傳代太多，否則培養(yǎng)細胞會走向衰老死亡。傳代培養(yǎng)：經(jīng)過一定處理，細胞適應(yīng)在體外條件下連續(xù)傳代的培養(yǎng)方法。第五章細胞研究的細胞生物學(xué)技術(shù)

細胞株（cellline）：一般可傳40至50代的細胞。

細胞系（cellstrain

）：細胞株經(jīng)過轉(zhuǎn)化后可傳50代以上或無限傳代的細胞。第五章細胞研究的細胞生物學(xué)技術(shù)原代培養(yǎng)細胞的生命歸宿

原代培養(yǎng)期

傳代期

衰退期第五章細胞研究的細胞生物學(xué)技術(shù)第五章細胞研究的細胞生物學(xué)技術(shù)三、細胞系建立的方法原代培養(yǎng)的方法（1）組織塊培養(yǎng)法（2）消化培養(yǎng)法細胞純化的方法（1）自然純化（2）人工純化酶消化法、差速貼壁法、機械鏟除法、克隆法、培養(yǎng)基限定法以及流式細胞儀分離法。第五章細胞研究的細胞生物學(xué)技術(shù)五、細胞檢測

計數(shù)血細胞計數(shù)器：手工計數(shù)細胞Coulter計數(shù)儀：人工計數(shù)第五章細胞研究的細胞生物學(xué)技術(shù)細胞克隆形成率實驗

單個細胞在體外增殖6代以上，其后代所組成的細胞群體形成肉眼可見的克隆?？寺⌒纬勺溆脕肀硎炯毎脑鲋衬芰Α?/p>

克隆形成率比＝克隆形成數(shù)／接種細胞數(shù)

缺點：操作繁瑣

優(yōu)點：精確、可靠

臺盼藍法

活細胞不被染色，死細胞染成藍色，用活細胞占細胞中的百分比表示細胞恬力。

第五章

細胞研究的細胞生物學(xué)技術(shù)第五章細胞研究的細胞生物學(xué)技術(shù)

四唑鹽（MTT）比色法

四唑鹽（MTT）商品名為噻唑藍。四吐鹽比色法的原理：活細胞中脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶干水的藍紫色產(chǎn)物（formazan)，并沉淀在細胞中，而死細胞沒有這種功能。二甲亞砜（DMSO）能溶解沉積在細胞中藍紫色結(jié)晶物，溶液顏色深淺與所含的formazan量成正比。再用酶標儀測定OD值

MTT法簡單快速、準確，廣泛應(yīng)用于新藥篩選、細胞毒牲試驗、腫瘤放射敏感性實驗等。第五章細胞研究的細胞生物學(xué)技術(shù)六、細胞凍存和復(fù)蘇

凍存和復(fù)蘇的原則：慢凍快融

當細胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細胞器脫水，細胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細胞內(nèi)形成冰晶。如果緩慢冷凍，可使細胞逐步脫水，細胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶；相反．結(jié)晶就大，大結(jié)晶會造成細胞膜、細胞器的損傷和破裂。復(fù)蘇過程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶