1SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量報(bào)告

SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、了解電泳技術(shù)的主要內(nèi)容2、掌握SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的基本原理與實(shí)驗(yàn)操作技術(shù)3、學(xué)會(huì)用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的方法測(cè)定蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量實(shí)驗(yàn)原理聚丙烯酰胺凝膠是一種多孔凝膠可用來(lái)檢測(cè)蛋白質(zhì)混合樣品，主要是根據(jù)蛋白組分的分子大小和形狀以及所帶靜電荷多少等因素所造成的電泳遷移率的差異。在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中加入陰離子去污劑十二烷基硫酸鈉(SDS),與SDS結(jié)合的蛋白質(zhì)帶有一致的負(fù)電荷，電泳時(shí)蛋白質(zhì)分子的遷移率主要取決于其相對(duì)分子質(zhì)量,而與蛋白質(zhì)自身形狀及所帶電荷無(wú)關(guān)。蛋白質(zhì)的分子量與電泳遷被率間的關(guān)系，可用下式表示：MW=K(10-bm)(1)IgMW=lgk-bmR=Kl-bmR(2)式中MW為蛋白質(zhì)分子量,K、K1為常數(shù),b為斜率,mR為相對(duì)遷移率。將相對(duì)分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白的遷移率對(duì)其分子量的對(duì)數(shù)作圖，可得到一條標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，根據(jù)未知蛋白質(zhì)樣品相對(duì)遷移率直接在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上查出其分子量。實(shí)驗(yàn)材料與用品1、材料:牛血清白蛋白、低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白(14.4~94.0kD)、吸水紙、浮漂2、試劑：丙稀酰胺、10%十二烷基硫酸鈉(SDS)、IMpH6.8的Tris-HCI緩沖液、1.5MPH8.8的Tris-HCI緩沖液、10%過(guò)硫酸鏤、TEMED(N,N,N,N'-四甲基乙二胺)、Tris-甘氨酸電泳緩沖液(25mMTris.250inM甘氨酸(pH8.3)、0.1%SDS).染色液(0.1%考馬斯亮藍(lán)R-250、40%甲醇、10%冰醋酸)、脫色液(10%甲醇、10%冰醋酸)、3、儀器：電泳儀，電泳槽裝置、脫色搖床、移液器、恒溫水浴、15cm培養(yǎng)皿、槍頭、1.5ml離心管。實(shí)驗(yàn)步驟組裝玻璃板玻璃洗凈,最后用雙蒸水沖洗、吹干安裝在制膠架上2、SDS聚丙稀酰氨凝膠的灌制(1)依順序加入各組分配制別離膠溶液。注意一旦加入TEMED,馬上開(kāi)始聚合，故應(yīng)快速操作。3%別離膠溶液的配制：溶液成分總體積10mL、雙蒸水2.97mL、30%g丙稀酰胺4.33mL>1.5MTris-HCl(pH8.8)2.5mL、10%SDS0.1mL、10%過(guò)硫酸胺0.1mL、TEMED0.004mL(2)在玻璃板的間隙中灌注配制好的別離膠液,留出灌注濃縮膠所需的空間，即在膠面上小心注入一層雙蒸水(約2?3mm)高，以阻止氧氣進(jìn)入凝膠溶液。⑶待別離膠聚合完全后，傾出覆蓋水層,再用濾紙吸凈殘留水。(4)依順序加入制備濃縮膠。4%濃縮膠溶液的配制：溶液成分總體積5mL、雙蒸水3.56mL、30%g丙稀酰胺0.67mL、1.5Mtris-HCl(pH6.8)0.63mL、10%SDS0.05mL、10%過(guò)硫酸胺0.05mL、TEMED0.005mL(5)在聚合的別離膠上直接灌注濃縮膠，至短玻璃板上緣l~2mm處，立即在濃縮膠溶液中插入干凈的梳子。小心防止混入氣泡,再加入濃縮溶液以充滿(mǎn)梳子之間的空隙,將凝膠垂直放置于室溫下。(6)等待濃縮膠聚合時(shí)，可同時(shí)對(duì)樣品進(jìn)行處理。以使蛋白質(zhì)變性。在樣品中按1:1體積比加入樣品處理液,在100℃沸水浴中保溫3min,取出冷卻后加樣。如處理好的樣品暫時(shí)不用，可放入-20℃冰箱長(zhǎng)時(shí)間保存，使用前需在100℃沸水中重新加熱3min,以除去亞穩(wěn)態(tài)聚合。3、裝槽:濃縮膠聚合完全后，小心移出梳子。將凝膠固定于電泳裝置上，注意膠板上短玻璃一面口朝向負(fù)極(黑色)，上下槽各加入Tris甘氨酸電泳緩沖、液。設(shè)法排出凝膠底部?jī)刹ＡО逯g的氣泡。4、上樣電泳在制備濃縮膠后,不能進(jìn)行預(yù)電泳，因預(yù)電泳會(huì)破壞pH環(huán)境,如需要電泳只能在別離膠聚合后,并用別離膠緩沖液進(jìn)行。預(yù)電泳后將別離膠面沖洗干凈,然后才能制備濃縮膠。(1)按預(yù)定順序用微量進(jìn)樣器加樣,加樣量通常為10?20LiLo(2)將電泳裝置與電源相接，凝膠上所加電壓為60V/cmo當(dāng)染料前沿進(jìn)入別離膠后，把電壓調(diào)到120V/cm,繼續(xù)電泳直至濱酚藍(lán)到達(dá)別離膠底部上方約1cm然后關(guān)閉電源。(3)從電泳裝置上卸下玻璃板,用刮刀勺撬開(kāi)玻璃。在面對(duì)短玻璃板緊靠最左邊一孔凝膠下部切去一角以標(biāo)注凝膠的方位。5、染色和脫色染色時(shí)間:60min(視情況而定)，時(shí)間到后倒掉染色液，用去離子水沖洗2次終止染色，將膠塊置于脫色液中。脫色需1?2小時(shí)，期間應(yīng)屢次更換脫色液直至蛋白質(zhì)帶與背景清晰。脫色后，可將凝膠浸于水中,長(zhǎng)期封裝在塑料袋內(nèi)而不降低染色強(qiáng)度。6、結(jié)果與分析(1)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)將大培養(yǎng)皿放在一張坐標(biāo)紙上,量出加樣端距前沿染料中心的距離(cm)以及各蛋白質(zhì)樣品區(qū)帶中心與加樣端的距離(cm),計(jì)算相對(duì)遷移率并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的相對(duì)遷移率為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量為縱坐標(biāo)在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上作圖,可得到一條標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。根據(jù)未知蛋白質(zhì)樣品相對(duì)遷移率直接在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上查出其分子量。考前須知1、在不連續(xù)電泳體系中，預(yù)電泳只能在別離膠聚合后進(jìn)行。洗凈膠面后才制備濃縮膠。濃縮膠制備后，不能進(jìn)行預(yù)電泳，以充分利用濃縮膠的濃縮效應(yīng)。2、電泳時(shí)，電泳儀與電泳槽間正、負(fù)極不能接錯(cuò)，以免樣品反方向泳動(dòng)，電泳時(shí)應(yīng)選用合適的電流、電壓，過(guò)高或過(guò)低無(wú)可影響電泳效果。3、SDS純度:在SDS中，需高純度的SDS,市售化學(xué)純SDS需重結(jié)晶一次或兩次方可使用。4、用SDS處理蛋白質(zhì)樣品時(shí),每次都會(huì)在沸水溶中保溫3?5min,以免有57亞穩(wěn)聚合物存在。5、標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的相對(duì)遷移率最好在0.2?0.8之間均勻分布。值得指出的是，每次測(cè)定未知物分子量時(shí),都應(yīng)同時(shí)用標(biāo)準(zhǔn)蛋白制備標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),而不是利用過(guò)去的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。用此法測(cè)定的分子量只是它們的亞基或單條肽鏈的分子量,而不是完整的分子量。為測(cè)得精確的分子量范圍,最好用其他測(cè)定蛋白分子量的方法加以校正。此法對(duì)球蛋白及纖維狀蛋白的分子量測(cè)定較好,對(duì)糖蛋白,膠原蛋白等分子量測(cè)定差異較大。6、對(duì)樣品的要求:應(yīng)采納低離子強(qiáng)度的樣品。如樣品中離子強(qiáng)度高，那么應(yīng)透析或經(jīng)離子交換除鹽。加樣時(shí)，應(yīng)保持凹形加樣槽膠面平直。加樣量以10?1511L為宜,如樣品系較稀的液體狀,為保證區(qū)帶清晰,加樣量可增加，同時(shí)應(yīng)將樣品溶解液濃