染色體顯微操作技術(shù)

關(guān)于染色體顯微操作技術(shù)第1頁(yè)，共61頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)32分，星期五引言：在大部分人類腫瘤和某些特定人類遺傳病中存在染色體重排。腫瘤特定的染色體異常會(huì)導(dǎo)致原癌基因產(chǎn)物的激活、腫瘤特異融合蛋白的產(chǎn)生或腫瘤抑制基因的失活。一個(gè)癌細(xì)胞的染色體共104條，包括許多異常的染色體第2頁(yè)，共61頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)32分，星期五Ph染色體示9；22易位（9q34;22q11）;→fi22q-;▲示9+Burkitt淋巴瘤的14q+染色體8q24;14q32易位第3頁(yè)，共61頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)32分，星期五一些腫瘤常見的染色體異常病名染色體異常慢性粒細(xì)胞白血病Burkitt淋巴瘤急性非淋巴細(xì)胞白血病

慢性淋巴細(xì)胞白血病急性淋巴細(xì)胞白血病

惡性淋巴瘤小細(xì)胞肺癌卵巢乳頭狀腺癌神經(jīng)母細(xì)胞瘤腦膜瘤Wilms瘤睪丸癌畸胎瘤Ph,即t(9;22)t(8;14),t(2;8),t(8;22)+8;7q,5q或-5t(8;21),t(15;17),t(9;22)；t(11;14),+12t(?;11),t(1;9),t(7;12),t(9;14)t(8;14),t(4;11),+21t(4;11),+1214q+,+12del(3)(p14-23)t(6;14)del或t(1;?)(p32-36;?)13q-22,22q11p1(12p)1(12p)第4頁(yè)，共61頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)32分，星期五

染色體顯帶技術(shù)的建立，腫瘤非隨機(jī)性染色體異常的細(xì)胞遺傳學(xué)分析已成為許多人類腫瘤診斷和預(yù)后不可或缺的指標(biāo)，但常規(guī)顯帶染色體分析不能確定所有的細(xì)胞遺傳學(xué)染色體重排。第5頁(yè)，共61頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)32分，星期五

該技術(shù)的局限性阻礙了許多人類腫瘤，尤其是實(shí)體瘤核型的確定，但這種情況已被染色體顯微切割和FISH技術(shù)所彌補(bǔ)。染色體顯微切割已經(jīng)成為由細(xì)胞遺傳學(xué)分析快速過渡到分子檢測(cè)的有力工具。第6頁(yè)，共61頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)32分，星期五第7頁(yè)，共61頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)32分，星期五細(xì)胞核移植技術(shù)：就是將供體細(xì)胞核移入除去核的卵母細(xì)胞中，使后者不經(jīng)過精子穿透等有性過程即無(wú)性繁殖即可被激活、分裂并發(fā)育成新個(gè)體，使得核供體的基因得到完全復(fù)制。以供體核的來(lái)源不同可分為胚細(xì)胞核移植與體細(xì)胞核移植兩種。第8頁(yè)，共61頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)32分，星期五1切開卵母細(xì)胞透明帶2擠出卵母細(xì)胞細(xì)胞核3注入供體細(xì)胞核4電融合儀融合培養(yǎng)12345第9頁(yè)，共61頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)32分，星期五顯微操作儀第10頁(yè)，共61頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)32分，星期五嵌合體技術(shù)嵌合體(chimera)一詞源于古希臘神話，其意是指獅頭、羊身、龍尾等部分拼湊起來(lái)的怪獸。嵌合在生物學(xué)上是指同一個(gè)體中，基因型相異的細(xì)胞或組織混合存在的狀態(tài)。第11頁(yè)，共61頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)32分，星期五現(xiàn)代的胚胎工程技術(shù)中，也有一種叫胚胎嵌合的技術(shù)。它是將２個(gè)胚胎細(xì)胞（同種或異種動(dòng)物胚胎）合并，共同發(fā)育成１個(gè)胚胎，即“嵌合胚胎”，然后將這個(gè)胚胎移植給受體，讓其妊娠產(chǎn)仔。如果產(chǎn)下來(lái)的幼仔具有以上２種動(dòng)物胚胎的細(xì)胞，則稱其為“嵌合體動(dòng)物”。例如，用同一種類的黑鼠和白鼠胚胎嵌合，可生下黑白相間的花小鼠；不同種類的綿羊和山羊胚胎細(xì)胞嵌合，可生下綿山羊，它既有綿羊的特征，又有山羊的特征。第12頁(yè)，共61頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)32分，星期五1囊胚顯微注射法：用顯微操作技術(shù)將供胚的全部?jī)?nèi)細(xì)胞團(tuán)注入除去部分內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的受胚囊胚腔中，或?qū)⒐┡叩牟糠謨?nèi)細(xì)胞團(tuán)注入受胚的囊胚腔中，也可以向受胚囊胚腔中（或卵周間隙）注入16細(xì)胞至桑甚胚的卵裂球、胚胎干細(xì)胞或已分化的細(xì)胞，使其發(fā)育為嵌合胚胎的方法即為囊胚注入法。第13頁(yè)，共61頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)32分，星期五2.聚合法是指將去除透明帶的兩枚8細(xì)胞至桑葚期胚胎，或來(lái)自兩個(gè)不同胚胎的卵裂球，或卵裂球與胚胎聚合在一起的方法。第14頁(yè)，共61頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)32分，星期五胚胎移植1.概念:將雌性動(dòng)物的早期胚胎,或者通過其他方式得到的胚胎,移植到同種的.生理狀態(tài)相同的其他雌性動(dòng)物的體內(nèi),使之發(fā)育為新個(gè)體的技術(shù).供體：提供胚胎的個(gè)體。受體：接受胚胎的個(gè)體。第15頁(yè)，共61頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)32分，星期五第16頁(yè)，共61頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)32分，星期五第17頁(yè)，共61頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)32分，星期五

染色體顯微切割分手工切割和激光切割法，倒置顯微鏡上裝配切割臂，安上硅化玻璃針，找到分散良好的分裂相來(lái)切割所需染色體片段。第18頁(yè)，共61頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)32分，星期五顯微切割圖例第19頁(yè)，共61頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)32分，星期五1.染色體顯微切割技術(shù)的發(fā)展

染色體顯微切割最早起源于從一個(gè)特定的染色體區(qū)域分離出DNA標(biāo)記，并首先成功地應(yīng)用于果蠅多線染色體和小鼠染色體的研究。1981年，德國(guó)的歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室（EMBL）Scalenghe等切割了果蠅唾液腺多線期X染色體第3段的幾個(gè)片段，通過蛋白酶消化、酚抽提、EcoRI酶切進(jìn)行重組克隆。

第20頁(yè)，共61頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)32分，星期五多線染色體：第21頁(yè)，共61頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)32分，星期五第22頁(yè)，共61頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)32分，星期五1984年染色體顯微切割應(yīng)用小鼠；

1986年Bates等切割了人的2號(hào)染色體短臂。但當(dāng)時(shí)由于所切割的染色體DNA量少，通常要切割上百條染色體，且其文庫(kù)也只含幾百個(gè)微克隆。

由于無(wú)法直接擴(kuò)增染色體DNA，所以必須在顯微鏡下反復(fù)切割若干拷貝的染色體，才能滿足實(shí)驗(yàn)的要求這不僅費(fèi)力耗時(shí)，而且要求實(shí)驗(yàn)操作人員必須具備熟練的染色體分帶和鑒定經(jīng)驗(yàn)，才保證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。第23頁(yè)，共61頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)32分，星期五

顯微切割技術(shù)的突破在于它與PCR的結(jié)合，1989年Ludecke等切割了人類G顯帶染色體，結(jié)合PCR技術(shù)進(jìn)行體外擴(kuò)增，使其工作量大大減小。

對(duì)于同一條染色體，只要切割和收集5～10個(gè)拷貝，通過PCR擴(kuò)增，即可滿足實(shí)驗(yàn)要求。從而極大地提高了實(shí)驗(yàn)技術(shù)的可行性和準(zhǔn)確性。第24頁(yè)，共61頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)32分，星期五

在1989年，Ludecke等建立了一個(gè)顯著提高克隆效率的方法。該方法首先用RsaI酶切顯微切割的DNA，連接到一個(gè)用SmaI酶切的pUC載體，然后用PCR擴(kuò)增插入位點(diǎn)兩側(cè)的載體序列。PCR擴(kuò)增第25頁(yè)，共61頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)32分，星期五

隨后的研究對(duì)該方法進(jìn)行完善，顯微切割DNA經(jīng)酶切后連接到一個(gè)由24堿基或20堿基的寡核苷酸組成的5，端突出連接頭。用20個(gè)堿基連接頭作為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增顯微切割的DNA，限制酶切擴(kuò)增產(chǎn)物并克隆到質(zhì)粒載體中去。第26頁(yè)，共61頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)32分，星期五替代方法：該方法用簡(jiǎn)并寡核苷酸引物直接用PCR擴(kuò)增顯微切割DNA。該方法在顯微切割的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增前增加了拓?fù)洚悩?gòu)酶I處理，大大簡(jiǎn)化了顯微切割的程序。優(yōu)點(diǎn)：通過減少顯微切割DNA的拷貝數(shù)降低顯微切割的操作時(shí)間和難度，同時(shí)也降低了外源性DNA污染的風(fēng)險(xiǎn)。第27頁(yè)，共61頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)32分，星期五2.染色體顯微切割的應(yīng)用2.1感興趣區(qū)域DNA克隆的構(gòu)建2.2FISH探針的制備2.3染色體重排的檢測(cè)2.4區(qū)域特異性cDNA的選擇第28頁(yè)，共61頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)32分，星期五2.染色體顯微切割的應(yīng)用2.1感興趣區(qū)域DNA克隆的構(gòu)建顯微切割在人類基因組計(jì)劃啟動(dòng)之前主要是分離填補(bǔ)物理作圖缺口的染色體區(qū)域特有的DNA標(biāo)記。定位克隆計(jì)劃已經(jīng)建立了幾個(gè)區(qū)域的特異文庫(kù)。2.2FISH探針的制備2.3染色體重排的檢測(cè)2.4區(qū)域特異性cDNA的選擇第29頁(yè)，共61頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)32分，星期五

物理作圖

要完成真核生物基因組測(cè)序的巨大工程，通常首先需要把基因組分解成為許多較小的DNA片段，然后分別測(cè)序，再綜合組裝。

物理作圖就是要把基因組分解成為許多較小的DNA片段，然后再把這些DNA片段連接起來(lái)，構(gòu)建一個(gè)由DNA片段重疊群組成的物理圖（physicalmap）。第30頁(yè)，共61頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)32分，星期五

物理圖譜：描繪DNA上可以識(shí)別的標(biāo)記的位置和相互之間的距離（以堿基對(duì)的數(shù)目為衡量單位，即物理距離），這些可以識(shí)別的標(biāo)記包括限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，分子標(biāo)記及功能基因等。構(gòu)建作圖文庫(kù)→→建立克隆重疊群→→重疊群長(zhǎng)度確定→→作圖片段錨定→→整合圖譜第31頁(yè)，共61頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)32分，星期五染色體DNA作圖文庫(kù)物理圖譜大分子DNA的提取大片段DNA的克隆物理作圖物理作圖的主要環(huán)節(jié)第32頁(yè)，共61頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)32分，星期五2.染色體顯微切割的應(yīng)用2.1感興趣區(qū)域DNA克隆的構(gòu)建2.2FISH探針的制備為了檢測(cè)以前不可辨認(rèn)的腫瘤和遺傳病的染色體異常，已普遍采用全染色體探針的熒光原位雜交技術(shù)。為滿足日益增多的高質(zhì)量染色體涂染探針的需求，染色體顯微切割已用于許多FISH探針的制備，包括所有人類的染色體涂染探針、染色體臂涂染探針和區(qū)帶特異性涂染探針。2.3染色體重排的檢測(cè)2.4區(qū)域特異性cDNA的選擇第33頁(yè)，共61頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)32分，星期五

染色體涂染技術(shù)

染色體涂染技術(shù)即將整條染色體、某條染色體臂（長(zhǎng)臂或短臂）或者染色體某個(gè)片斷的DNA制備成探針，然后用熒光原位雜交的方法，將探針雜交到中期分裂相染色體上，在熒光顯微鏡下觀察熒光素在染色體上標(biāo)記的顏色，從而分析和研究染色體的重組、畸變以及同源基因等的一種新技術(shù)。第34頁(yè)，共61頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)32分，星期五染色體涂染第35頁(yè)，共61頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)32分，星期五第36頁(yè)，共61頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)32分，星期五第37頁(yè)，共61頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)32分，星期五

染色體涂染技術(shù)1.染色體DNA探針的制備2.熒光原位雜交①流式細(xì)胞分類法；②克隆基因庫(kù)或體細(xì)胞雜交株；③染色體顯微切割和PCR擴(kuò)增等途徑。第38頁(yè)，共61頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)32分，星期五1.染色體DNA探針的制備①流式細(xì)胞分類法（flowcytometry）

該法用一種或多種熒光染料將懸浮液中的中期分裂相染色體染色。由于染色體大小、形態(tài)、組成和結(jié)構(gòu)的不同，所染色的特征有其特異性，從而可以通過流式細(xì)胞術(shù)將特定的染色體收集起來(lái)。

局限性：如果受試物的染色體形態(tài)單一、數(shù)目較多,僅根據(jù)染色體的形態(tài)和大小很難將所有的染色體準(zhǔn)確地區(qū)分開來(lái)。第39頁(yè)，共61頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)32分，星期五

局限性：如果受試物的染色體形態(tài)單一、數(shù)目較多，如牛(2n=60)和狗(2n=78)的所有常染色體及綿羊(2n=54)和馬(2n=64)的大部分常染色體都是端位著絲點(diǎn)，因此，僅根據(jù)染色體的形態(tài)和大小很難將所有的染色體準(zhǔn)確地區(qū)分開來(lái)。第40頁(yè)，共61頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)32分，星期五1.染色體DNA探針的制備②克隆基因庫(kù)或體細(xì)胞雜交株

通過特定的克隆基因文庫(kù)或者特異性的體細(xì)胞雜交細(xì)胞系制備某條染色體整個(gè)或部分DNA探針。該法特異性強(qiáng)，準(zhǔn)確性高，且可與功能遺傳學(xué)的研究結(jié)合起來(lái)，但對(duì)實(shí)驗(yàn)室要求較高，取材來(lái)源和研究范圍有所限制。

③染色體顯微切割和PCR擴(kuò)增

通過該方法制備的染色體DNA探針，相對(duì)而言，具有直接、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便和應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。第41頁(yè)，共61頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)32分，星期五2.熒光原位雜交（fluorescentinsituhybridazation,FISH）

原位雜交是基于DNA分子復(fù)制原理而發(fā)展起來(lái)的一種技術(shù)。用帶有標(biāo)記（放射性同位素、熒光染料等）的DNA或RNA片段作為核酸探針,與組織切片或細(xì)胞內(nèi)待測(cè)核酸(RNA或DNA）片段進(jìn)行雜交，然后用放射自顯影等方法予以顯示，在光鏡或電鏡下觀察目的mRNA或DNA的存在及定位。第42頁(yè)，共61頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)32分，星期五2.熒光原位雜交

熒光原位雜交是在20世紀(jì)80年代末在放射性原為雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種非放射性分子細(xì)胞遺傳技術(shù)，以熒光標(biāo)記取代同位素標(biāo)記而形成的一種新的原位雜交方法。探針首先與某種介導(dǎo)分子結(jié)合，雜交后再通過免疫細(xì)胞化學(xué)過程連接上熒光染料。第43頁(yè)，共61頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)32分，星期五

基本原理：如果被檢測(cè)的染色體或DNA纖維切片上的靶DNA與所用的核酸探針是同源互補(bǔ)的，二者經(jīng)變性-退火-復(fù)性，即可形成靶DNA與核酸探針的雜交體。將核酸探針的某一種核苷酸標(biāo)記上報(bào)告分子如生物素、地高辛，可利用該報(bào)告分子與熒光素標(biāo)記的特異親和素之間的免疫化學(xué)反應(yīng)，經(jīng)熒光檢測(cè)體系在鏡下對(duì)待測(cè)DNA進(jìn)行定性、定量或相對(duì)定位分析。第44頁(yè)，共61頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)32分，星期五實(shí)驗(yàn)流程：

FISH樣本的制備→探針的制備→探針標(biāo)記→雜交→（染色體顯帶）→熒光顯微鏡檢測(cè)→結(jié)果分析。

第45頁(yè)，共61頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)32分，星期五

優(yōu)點(diǎn):

熒光試劑和探針經(jīng)濟(jì)、安全；探針穩(wěn)定，一次標(biāo)記后可在兩年內(nèi)使用；實(shí)驗(yàn)周期短、能迅速得到結(jié)果、特異性好、定位準(zhǔn)確；可定位長(zhǎng)度在1kb的DNA序列，其靈敏度與放射性探針相當(dāng)；多色FISH在同一個(gè)核中顯示不同顏色可同時(shí)檢測(cè)多種序列；既可以在玻片上顯示中期染色體數(shù)量或結(jié)構(gòu)的變化，也可以在懸液中顯示間期染色體DNA的結(jié)構(gòu)。

第46頁(yè)，共61頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)32分，星期五

缺點(diǎn)：不能達(dá)到100%雜交，特別是在應(yīng)用較短的cDNA探針時(shí)效率明顯下降。

第47頁(yè)，共61頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)32分，星期五染色體涂染技術(shù)的應(yīng)用

染色體涂染技術(shù)主要應(yīng)用于動(dòng)物分子細(xì)胞遺傳學(xué)、人類疾病、性染色體以及染色體進(jìn)化等研究。1995年以來(lái)，劍橋大學(xué)應(yīng)用這項(xiàng)技術(shù)進(jìn)行哺乳動(dòng)物的染色體比對(duì)，他們運(yùn)用了YAC等細(xì)胞的多種染色體作探針，以研究重組染色體的斷裂點(diǎn)。澳大利亞Latrobe大學(xué)以染色體涂染技術(shù)探討人的XY染色體的親緣關(guān)系。美國(guó)Ambady等人用顯微切割術(shù)和PCR擴(kuò)增建立了豬第6號(hào)染色體DNA文庫(kù)，尋找微星體，用于豬基因圖的研究。國(guó)外實(shí)驗(yàn)室主要研究不同種屬的動(dòng)物(包括人)或植物染色體(尤其是性染色體)的比較與進(jìn)化，研究過的動(dòng)物有雞、狗、狐、猴、貓、猿、鼠、兔、牛、羊、山羊以及其它鳥類、有袋類和哺乳類等。第48頁(yè)，共61頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)32分，星期五2.染色體顯微切割的應(yīng)用2.1感興趣區(qū)域DNA克隆的構(gòu)建2.2FISH探針的制備2.3染色體重排的檢測(cè)

該方法最引人注目的特點(diǎn)之一是它可直接檢測(cè)任何細(xì)胞遺傳學(xué)上可見到的染色體重排的染色體結(jié)構(gòu)。該方法已用于分析不同的染色體重排，包括缺失、易位、小的環(huán)狀染色體和擴(kuò)增。常規(guī)顯帶記為簡(jiǎn)單末端缺失的畸變，通過用顯微切割方法重新分析，結(jié)果可清楚地顯示該缺失為中間缺失或易位。應(yīng)用顯微切割對(duì)包括同源染色區(qū)域和雙微小體的基因擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析顯示：這些區(qū)域通常是由多個(gè)染色體區(qū)段組成。2.4區(qū)域特異性cDNA的選擇第49頁(yè)，共61頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)32分，星期五FISH檢測(cè)（chromosomepainting)染色體易位第50頁(yè)，共61頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)32分，星期五圖染色體倒位圖（SISH顯示和電鏡下觀察）第51頁(yè)，共61頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)32分，星期五相互易位第52頁(yè)，共61頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)32分，星期五2.染色體顯微切割的應(yīng)用2.1感興趣區(qū)域DNA克隆的構(gòu)建2.2FISH探針的制備2.3染色體重排的檢測(cè)2.4區(qū)域特異性cDNA的選擇

從同源染色區(qū)域（HSR）顯微切割DNA技術(shù)的應(yīng)用，使得從顯微切割區(qū)域內(nèi)分離轉(zhuǎn)錄序列的方法得以建立。顯微切割結(jié)合選擇性雜交已用于鑒別骨肉瘤細(xì)胞系中12q11-q13.2HSR有關(guān)的基因。簡(jiǎn)單地說(shuō)，顯微切割DNA的PCR產(chǎn)物被固定在尼龍膜上，然后將從癌細(xì)胞系中用隨機(jī)引物法制備的cDNA與靶HSR進(jìn)行雜交。經(jīng)雜交和嚴(yán)格洗脫后，特異性雜交的cDNA克隆被洗脫并用PCR方法回收。第53頁(yè)，共61頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)32分，星期五3.染色體顯微切割策略染色體顯微切割用拓?fù)洚悩?gòu)酶I處理切割的DNA顯微切割DNA的擴(kuò)增熒光原位雜交（FISH）第54頁(yè)，共61頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)32分，星期五染色體顯微切割

用于顯微切割的中期染色體是用植物血球凝集素（PHA）刺激正常外周血淋巴細(xì)胞制備的，中期分裂相滴在干凈的蓋玻片上并進(jìn)行G顯帶，通常3~5個(gè)拷貝的靶染色體區(qū)域足以獲得高質(zhì)量探針。染色體顯微切割是用安裝在倒置顯微鏡上的顯微操作裝置控制一個(gè)玻璃針來(lái)完成的。顯微切割的染色體片段轉(zhuǎn)移到5微升含拓?fù)洚悩?gòu)酶I的收集液中。第55頁(yè)，共61頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)32分，星期五用拓?fù)洚悩?gòu)酶I處理切割的DNA

在PCR擴(kuò)增前，切割的DNA用拓?fù)洚悩?gòu)酶I處理，使得結(jié)構(gòu)非常緊密的DNA螺旋解旋。這種處理可以顯著提高被切割DNA序列的回收。收集到期望數(shù)量的被切割染色體區(qū)段后，顯微切割的DNA在37度條件下用拓?fù)洚悩?gòu)酶I處理1小時(shí)。第56頁(yè)，共61頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)32分，星期五顯微切割DNA的擴(kuò)增

擴(kuò)增被切割DNA最困難的問題是PCR反應(yīng)的有效啟動(dòng)。Taq聚合酶對(duì)啟動(dòng)PCR不是高效的，因?yàn)樗难由鞙囟仁?2度，而對(duì)部分簡(jiǎn)并引物的最佳退火溫度大約是30度。為了解決這個(gè)問題，在PCR第5~8個(gè)循環(huán)加入T7DNA聚合酶（測(cè)序酶），并且酶是在每個(gè)循環(huán)的退火溫度（30度）時(shí)加入。完成此種預(yù)擴(kuò)增后，接著用Taq聚合酶催化的常規(guī)PCR反應(yīng)完成。第57頁(yè)，共61頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)32分，星期五

T7DNA聚合酶最初具有5‘→3’聚合酶活性以及單鏈和雙鏈3‘→5’外切酶活性。當(dāng)T7DNA聚合酶用適當(dāng)方法處理后,可使3‘→5’外切酶活力明顯下降。改造后的T7DNA聚合酶又稱T7測(cè)序