分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)思考題答案

分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)思考題答案分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)思考題答案分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)思考題答案V:1.0精細(xì)整理，僅供參考分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)思考題答案日期：20xx年X月分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)思考題答案實(shí)驗(yàn)一、基因組DNA的提取為什么構(gòu)建DNA文庫(kù)時(shí)，一定要用大分子DNA?答、文庫(kù)的大小(即數(shù)目)取決于基因組的大小和片段的大小，片段大則文庫(kù)數(shù)目小一些也可以包含99%甚至以上的基因組。而文庫(kù)數(shù)目小則方便研究人員操作和文庫(kù)的保存。所以構(gòu)建文庫(kù)要用攜帶能力大的載體克隆盡量大的DNA片段.2、如何檢測(cè)和保證DNA的質(zhì)量？答、用凝膠電泳看，有沒(méi)有質(zhì)白質(zhì)和RNA等物質(zhì)的污染，還可以測(cè)OD，用OD260/280來(lái)判斷，當(dāng)OD260/OD280<1.8，表示蛋白質(zhì)含量較高當(dāng)OD260/OD280>2.0，表示RNA含量較高當(dāng)OD260/OD280=1.8～2.0，表示DNA較純。實(shí)驗(yàn)二、植物總RNA的提取RNA酶的變性和失活劑有哪些其中在總RNA的抽提中主要可用哪幾種

答、有DEPC,Trizol，氧釩核糖核苷復(fù)合物，RNA酶的蛋白抑制劑以及SDS，尿素，硅藻土等；在總RNA提取中用PEPC,Trizol怎樣從總RNA中進(jìn)行mRNA的分離和純化。答、、利用成熟的mRNA的末端具有polyA尾的特點(diǎn)合成一段oligo(dT)的引物，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，可將mRNA從總RNA中分離出來(lái)實(shí)驗(yàn)四、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備感受態(tài)細(xì)胞制備過(guò)程中應(yīng)該注意什么？答、A）細(xì)菌的生長(zhǎng)狀態(tài)：不要用經(jīng)過(guò)多次轉(zhuǎn)接或儲(chǔ)于4℃的培養(yǎng)菌，最好從-80℃甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細(xì)胞的菌液。細(xì)胞生長(zhǎng)密度以剛進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)為宜，可通過(guò)監(jiān)測(cè)培養(yǎng)液的OD600來(lái)控制。DH5α菌株的OD600為0.5時(shí)，細(xì)胞密度在5×107個(gè)/mL左右，這時(shí)比較合適。密度過(guò)高或不足均會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率。B）所有操作均應(yīng)在無(wú)菌條件和冰上進(jìn)行；實(shí)驗(yàn)操作時(shí)要格外小心，懸浮細(xì)胞時(shí)要輕柔，以免造成菌體破裂，影響轉(zhuǎn)化。C）經(jīng)CaCl2處理的細(xì)胞，在低溫條件下，一定的時(shí)間內(nèi)轉(zhuǎn)化率隨時(shí)間的推移而增加，24小時(shí)達(dá)到最高，之后轉(zhuǎn)化率再下降（這是由于總的活菌數(shù)隨時(shí)間延長(zhǎng)而減少造成的）；D）化合物及無(wú)機(jī)離子的影響：在Ca2+的基礎(chǔ)上聯(lián)合其他二價(jià)金屬離子（如Mn2+或Co2+）、DMSO或還原劑等物質(zhì)處理細(xì)菌，可使轉(zhuǎn)化效率大大提高（100-1000倍）；E）所使用的器皿必須干凈。少量的去污劑或其它化學(xué)物質(zhì)的存在可能大大降低細(xì)菌的轉(zhuǎn)化效率；感受態(tài)細(xì)胞制備可用在哪些研究和應(yīng)用領(lǐng)域？答、在基因工程中將質(zhì)粒導(dǎo)入受體細(xì)胞是如果受體細(xì)胞是細(xì)菌則將它用Ca2+處理變?yōu)楦惺軕B(tài)細(xì)胞質(zhì)粒進(jìn)入。實(shí)驗(yàn)五、質(zhì)粒在大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化和鑒定在熱激以后進(jìn)行活化培養(yǎng)，這時(shí)的培養(yǎng)基中為什么不加入抗生素？答、活化培養(yǎng)用的一般是SOC培養(yǎng)基，這種培養(yǎng)基比LB培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)，此時(shí)進(jìn)行的活化培養(yǎng)只是為了讓大腸桿菌迅速?gòu)?fù)蘇，恢復(fù)分裂活性，此時(shí)的細(xì)胞還不具抗性，加入抗生素會(huì)細(xì)胞會(huì)死亡。什么是質(zhì)粒根據(jù)在細(xì)菌中的復(fù)制，質(zhì)粒有幾種類型用于基因重組的主要用到哪些質(zhì)粒答、質(zhì)粒是細(xì)菌體內(nèi)的環(huán)狀DNA分子。

質(zhì)粒也是作為細(xì)菌遺傳載體的一部分，但通常其攜帶的基因?qū)?xì)菌而言必要性要比核內(nèi)DNA的小很多。比如，抗性基因，熒光蛋白基因等等。

根據(jù)質(zhì)粒隨細(xì)胞分裂而分裂的次數(shù)，將其分為兩類：一類是嚴(yán)緊型質(zhì)粒，當(dāng)細(xì)胞染色體復(fù)制一次時(shí)，質(zhì)粒也復(fù)制一次，每個(gè)細(xì)胞內(nèi)只有1～2個(gè)質(zhì)粒；另一類是松弛型質(zhì)粒，當(dāng)染色體復(fù)制停止后仍然能繼續(xù)復(fù)制，每一個(gè)細(xì)胞內(nèi)一般有20個(gè)左右質(zhì)粒。

常用于基因重組的質(zhì)粒是pBR322質(zhì)粒，因?yàn)槠浠驕y(cè)序已經(jīng)完成，而且它攜帶了兩個(gè)標(biāo)記基因，一個(gè)是氨芐青霉素抗性基因Apr，另一個(gè)是四環(huán)素抗性基因Tetr。實(shí)驗(yàn)六、質(zhì)粒DNA的分離純化和鑒定1、在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，加入的EDTA、SDS分別起什么作用?答、EDTA可以結(jié)合DNA酶等，可以抑制其活性；SDS主要是裂解細(xì)菌和沉淀蛋白。乙酸鉀在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中主要起什么作用?答、主要是在分離過(guò)程中起著中和PH的作用，DNA經(jīng)堿（NaoH)裂解后，染色體DNA氫鍵斷裂，雙螺旋解開(kāi)，質(zhì)粒DNA氫鍵斷裂，互補(bǔ)鏈不能完全分離，再經(jīng)乙酸鉀中和成中性后則復(fù)性離心就可以達(dá)到分離的效果。氯仿在核酸的提取過(guò)程中有何作用？答、克服酚的特點(diǎn)，加速有機(jī)層和液相的分層。最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中跡量酚。本實(shí)驗(yàn)整個(gè)過(guò)程中應(yīng)該注意些什么？答、1、提取過(guò)程應(yīng)盡量保持低溫；2、提取質(zhì)粒DNA過(guò)程中除去蛋白質(zhì)很重要，采用酚、氯仿去除蛋白質(zhì)要比單獨(dú)用酚或者氯仿要好，要將蛋白盡量除干凈需多次抽提。3、沉淀DNA一般使用冰乙醇，在低溫條件下放置時(shí)間稍長(zhǎng)可以使沉淀完全。沉淀DNA也可以使用異丙醇（一般使用等體積),且沉淀完全，速度快，但常把鹽沉淀，所以多數(shù)還是用乙醇。實(shí)驗(yàn)七、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)——一般原理和技術(shù)降低退火溫度對(duì)反應(yīng)有何影響？答、變性所需的加熱溫度取決于模板及PCR產(chǎn)物雙鏈DNA中的G+C含量。雙鏈DNA中的G+C的比率越高，則雙鏈DNA分離變性的溫度也就越高。變性所需的時(shí)間與DNA分子的長(zhǎng)度相關(guān)，DNA分子越長(zhǎng)，在特定的變性溫度下使雙鏈DNA分子完全分離所需的時(shí)間就越長(zhǎng)。若變性溫度太低或變性時(shí)間太短，則只能使DNA模板中富含AT的區(qū)域產(chǎn)生變性，當(dāng)PCR循環(huán)中的反應(yīng)溫度降低時(shí)，部分變性的DNA模板又重新結(jié)合成雙鏈DNA，從而導(dǎo)致PCR的失敗。非特異性條帶數(shù)增多。PCR循環(huán)次數(shù)是否越多越好？為何答、循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多。PCR技術(shù)可應(yīng)用與哪些方面？舉例。答、1、核酸的基礎(chǔ)研究：基因組克隆不對(duì)稱PCR制備單鏈DNA用于DNA測(cè)序3、反向PCR測(cè)定未知DNA區(qū)域4、反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）用于檢測(cè)細(xì)胞中基因表達(dá)水平、RNA病毒量以及直接克隆特定基因的cDNA5、熒光定量PCR用于對(duì)PCR產(chǎn)物實(shí)時(shí)監(jiān)控6、cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)7、檢測(cè)基因的表達(dá)8、醫(yī)學(xué)應(yīng)用：檢測(cè)細(xì)菌、病毒類疾??；診斷遺傳疾??；診斷腫瘤；應(yīng)用于法醫(yī)物證學(xué)實(shí)驗(yàn)八、DNA的限制性內(nèi)切酶酶切和鑒定1、寫出ECORI和Hind3兩種內(nèi)切酶消化產(chǎn)物的末端序列。答、G^AATTCEcoRI的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)，粘性末端即：AATTC-CTTAA^GG-HindⅢ的識(shí)別序列為：A^AGCTT“^”為切割位點(diǎn)，黏性末端為：AGCTT-A-什么是粘性末端和平末端？答、用限制酶切割后得到的末端齊平就是平末端，一長(zhǎng)一短就是粘性末端3、限制性內(nèi)切酶在基因工程中有什么作用？答、用同種限制酶對(duì)含目的基因的DNA分子和運(yùn)載體（如：HYPERLINK"/