單克隆抗體制備技術課件

單克隆抗體制備技術2008年11月6日雜交瘤技術的基本原理雜交瘤技術的基本原理1：HAT選擇培養(yǎng)基：次黃嘌呤(hypoxanthine,H)氨基蝶呤(aminopterin,A)胸腺嘧啶核苷(thymidine,T).2：細胞的DNA合成一般有兩條途徑：A：由糖和氨基酸合成核苷酸，進而合成DNA，葉酸作為重要的輔酶參與反應。B：在次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在下，經(jīng)次黃嘌呤磷酸核糖轉化酶(HGPRT)或胸腺嘧啶核苷激酶(TK)的催化下合成DNA。免疫程序與檢測方法的建立免疫程序建立檢測方法檢測免疫效果免疫程序

取6-8周齡Balb／C雌鼠，首免，每只鼠用0.5mL含50μg的重組蛋白與10%體積的ISA15AVG佐劑混勻，頸背部皮下多點注射；間隔3w進行二免，免疫原、劑量和方法同上；再間隔2w進行三免，免疫原不含佐劑，腹腔注射，劑量同上。細胞融合前3d加強免疫，腹腔注射0.5mL含50-100μg純化的蛋白。3-5天后用于融合。

免疫程序

免疫時是否采用佐劑和事先處理抗原，要依抗原性的強弱而定。一般來講可溶性抗原用完全佐劑效果較好?？乖客瑯优c抗原強弱有關，以IgG為例，第一次為100g，第二次為50g，免疫途徑第一次可經(jīng)腹腔注射。對于細胞性抗原不用佐劑，每次腹腔注射1×l06-1×107。檢測方法的建立及免疫效果的評價A：建立成熟的檢測方法是關鍵，一般有以下幾種方法：ELISAIPMA免疫熒光B：免疫效果的評價一般于三免疫后一周，通過尾靜脈采血檢測抗體產(chǎn)生情況，一般以稀釋1000倍仍為陽性判為免疫成功。SP2/0細胞的準備SP2/0細胞在融合前應先用含8-氮鳥嘌呤的培養(yǎng)基作適應培養(yǎng)，使生存的細胞對HAT呈均一的敏感性。融合前24-48h將SP2/0細胞分瓶擴大培養(yǎng)，融合前6h，棄去瓶中培養(yǎng)液，換上新液。融合時，選擇形態(tài)良好、呈對數(shù)生長的SP2/0細胞，將其從瓶壁上輕輕吹下，收集于15mL離心管內，1000rpm離心5min，用5mL無血清的1640懸浮沉淀，再離心一次，然后用無血清的1640培養(yǎng)液重新懸浮，細胞計數(shù)，取107細胞懸液備用。免疫脾細胞的制備加強免疫3-5天后小鼠眼球采血（作為陽性對照，盡量多的采血，否則脾中紅細胞較多，影響融合），然后拉頸處死，浸泡在75%酒精內，5min。用無菌剪刀剪開皮膚，無菌鑷子撕開皮膚，暴露腹膜；再用無菌剪刀剪開腹膜，暴露脾臟；無菌取脾臟，無血清1640洗一次，去除結締組織；無菌注射器吸取1640培養(yǎng)液，將脾細胞吹出；1000rpm離心5min，細胞用1640培養(yǎng)液洗1次，細胞計數(shù)，取5×107-1×108脾細胞懸液備用。培養(yǎng)天數(shù)脾細胞骨髓瘤細胞飼養(yǎng)細胞雜交瘤細胞0良好良好良好可見融合細胞1-2開始死亡銳減良好成2-3個亮細胞3-4大部死亡幾乎完全死亡良好成簇3-5，10個細胞5-7死亡死亡變形100個左右細胞呈小島7-14死亡死亡變形1/3-1/5孔底面積融合后各種細胞的情況換液：融合之后5d換液，吸出150μL，加入200μLHT營養(yǎng)液。融合過程中注意事項SP2/0細胞與免疫脾細胞數(shù)比例適當。兩種細胞要處于較好的狀態(tài)，吹吸細胞時要輕柔。PEG融合之后，加營養(yǎng)液中和時要緩慢，以免將破壞融合細胞。陽性雜交瘤的篩選雜交瘤細胞長到孔底1/5-1/10時可以進行檢測，一般情況下10d即可；還可以當營養(yǎng)液發(fā)黃時檢測。取樣：無菌取雜交瘤培養(yǎng)上清，然后在原孔中加入HT培養(yǎng)液。應用已經(jīng)建立起的檢測方法篩選陽性孔，以制備PCV2-Cap單抗為例：用重組PCV2-Cap蛋白和野生型桿狀病毒包被ELISA板進行平行檢測，每孔加入50μL雜交瘤細胞培養(yǎng)上清液（如果同時檢測項目繁多，可以統(tǒng)一稀釋2-5倍進行檢測）。重組PCV2-Cap蛋白檢測為陽性而野生型桿狀病毒為陰性的的雜交瘤細胞轉入24孔板進行擴大培養(yǎng)（HT培養(yǎng)液），長至80%單層時再檢測一次，如果仍然為陽性則立即進行進行亞克隆。陽性雜交瘤的篩選過程中注意事項檢測雜交瘤細胞的時機很重要，早了抗體產(chǎn)生量少，不易檢出；晚了細胞死亡較多，不利于后續(xù)培養(yǎng)及亞克隆。從96孔板中取樣品之后應立即補上HT培養(yǎng)液，利于細胞保持較好的狀態(tài)。取樣時做好標記，以免造成錯誤。雜交瘤細胞的亞克隆原則對于檢測抗體陽性的雜交克隆應盡早進行克隆化，否則抗體分泌的細胞會被抗體非分泌的細胞所抑制，因為抗體非分泌細胞的生長速度比抗體分泌的細胞生長速度快，二者競爭的結果會使抗體分泌的細胞丟失。即使克隆化過的雜交瘤細胞也需要定期的再克隆，以防止雜交瘤細胞的突變或染色體丟失，從而喪失產(chǎn)生抗體的能力。亞克隆過程中注意事項亞克隆之前可以制備飼養(yǎng)層細胞，促進雜交瘤細胞生長；如果細胞狀態(tài)好，也可以不用飼養(yǎng)層細胞。在細胞計數(shù)前應該將雜交瘤細胞做適當?shù)南♂?，稀釋倍?shù)根據(jù)細胞量而定，10-100倍不等。細胞計數(shù)時將細胞控制在2-10×104/mL，這樣計數(shù)時即快又準。第一次亞克隆時，為了確保成功，可以取200個細胞進行亞克隆。如果細胞生長不良，可以中途換液，把細胞吹散。細胞的凍存與復蘇單抗的制備是一個較長的過程，中途可能會發(fā)生污染而前功盡棄，所以要及時進行細胞的凍存：各個時期的陽性孔雜交瘤細胞都要凍存。將生長狀態(tài)良好的細胞吹起后，1000rpm離心5min，棄上清，用凍存液將細胞重懸，之后凍存，程序如下：4℃放置1h，-20℃放置4h，-80℃過夜，然后置液氮中保存。細胞的復蘇：從液氮中取出細胞，迅速置于37℃水浴鍋中迅速融化細胞，營養(yǎng)液稀釋后1000rpm離心5min，棄上清，用營養(yǎng)液將細胞重懸之后常規(guī)培養(yǎng)。單克隆抗體的鑒定抗體特異性的鑒定McAb的Ig類與亞類的鑒定Western-blot分析McAb中和活性的鑒定McAb識別抗原表位的鑒定McAb親和力的鑒定

抗體特異性的鑒定除用免疫原(抗原)進行抗體的檢測外，還應用與其抗原成分相關的其它抗原進行交叉試驗，方法可用ELISA、IFA、IPMA等法。Western-blot分析以抗PCV2的單抗為例：取純化的PCV2病毒進行SDS分析，然后將其轉印到硝酸纖維素膜（NC）上，與篩選到的5株單抗進行Western-blot，以SP2/0培養(yǎng)上清作為對照，HRP-GoatAnti-MouseIgG(H+L)為二抗，用3，3′-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）底物溶液顯色、拍照。McAb中和活性的鑒定以抗PCV2單抗為例，用固定病毒稀釋抗體的方法進行病毒中和試驗用于檢測單抗的中和活性。將雜交瘤細胞培養(yǎng)上清液和腹水按1:2系列稀釋，分別與含有200個TCID50的PCV2/LG株等體積混合，置37℃感作3h；同設PCV2陽性血清、SP2/0細胞培養(yǎng)上清作為陽性和陰性對照。病毒接種細胞培養(yǎng)至72h，固定細胞，用PCV2陽性血清進行IPMA檢測各孔病毒抗原反應，將能夠抑制50%病毒增殖的抗體最高稀釋倍數(shù)定為抗體中和效價。

McAb識別抗原表位的鑒定采用間接ELISA法相加試驗，計算相加指數(shù)（AI）來分析單抗決定簇，具體做法如下：在包被好抗原的ELISA板中分別加入各種單抗（均為稀釋5倍）各100μL，以及各單抗兩兩組合各50μL，37℃孵育1h，后序步驟與常規(guī)ELISA相同。根據(jù)下列公式計算AI，A1，A2分別為各株單抗的A值，A1+2為兩兩組合的混合單抗的A值。AI大于10%表示兩株單抗針對不同抗原表位，具有相加效應；AI小于10%則表示兩株單抗針對抗原表位相同或相近。AI=（A1+2-A1）/A2×100%溶液的配制HAT選擇培養(yǎng)液：

76mL1640營養(yǎng)液20mLFBS（PAA）2mLHAT（Sigma，50X）2mL5.6%碳酸氫鈉溶液100mLHAT選擇培養(yǎng)液

1640營養(yǎng)液pH=8.1310%FBS1640營養(yǎng)液pH=7.8120%FBS1640營養(yǎng)液pH=7.62（溶液較黃，所以用5.6%碳酸氫鈉溶液調pH為7.8左右）

溶液的配制HT培養(yǎng)液77mL1640營養(yǎng)液20mLFBS（PAA）