人體外周血淋巴細胞染色體制備與觀察實驗方案

實驗方案實驗外周血淋巴細胞培養(yǎng)及染色體標本制備，染色體組型分析一、實驗目的了解動物細胞培養(yǎng)的方法。掌握人體外周血淋巴細胞培養(yǎng)與染色體標本制備。2、初步掌握人類染色體）帶的顯示方法及人類染色體 ）帶在染色體識別中的意義。3、熟悉人類染色體的鏡下檢查和核型分析方法。初步掌握人類染色體 G帶的特征及其識別。二、實驗原理所謂外周血培養(yǎng)即是將外周血接種在適當?shù)呐嗯囵B(yǎng)物中加入適量的秋水仙素，使紡錘體微管解聚，這樣細胞停留在中期，可以獲得大量的分裂細胞。用低滲鹽溶液（一般是0.075mol/L的KCl）處理，使其中的紅細胞及分裂相細胞膜和一部分細胞質(zhì)除去，最后以氣干法制片，可獲得較好的染色體養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。人類外周血細胞本來是終末分化細胞，一般沒有分裂能力，但經(jīng) PHA（植物血球凝集素）或 ConA等藥物刺激后，轉(zhuǎn)變成可分裂的轉(zhuǎn)化細胞。染色體顯帶是將染色體標本經(jīng)過一定程序處理，并用特定染料染色，使染色體沿其長軸顯現(xiàn)明暗或深淺相間的橫行帶紋――染色體帶，這種技術，稱為染色體顯帶技術。通過顯帶，人們可以準確地識別每一條染色體及染色體上的各個區(qū)段，并可發(fā)現(xiàn)染色體上較細微的結(jié)構(gòu)變化。在所有的顯帶技術中，G顯帶（Gbanding）是最常見的顯帶技術，它是將染色體標本用堿、胰蛋白酶或其它鹽溶液處理后，再用Giemsa染液染色，在普通顯微鏡下，可見深淺相間的帶紋，稱 G帶（Gband）。G顯帶方法簡便，帶紋清晰，染色體標本可以長期保存，因此被廣泛用于染色體病的診斷和研究。正常人類染色體的數(shù)目為46條（23對），1960年的Denver會議和1963年的London會議制定了統(tǒng)一的人類染色體命名體制：按照染色體的相對長度、臂比和著絲粒指數(shù)，將常染色體（22對）按大小用阿拉伯數(shù)字標記，順次排列為1?22號，性染色體用 X和Y標記；并按染色體大小和著絲粒位置，把人類染色體分為七個組，用大寫字母 A?G表示。染色體經(jīng)顯帶處理后，每條染色體都顯示出其特定的帶紋特征（見下表）。根據(jù)這些特征，可以準確地識別每條染色體，檢出染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)畸變。表1人染色體組型及其特征

組別染色體序號形態(tài)，大小著絲點位置次縊痕隨體A1~3取大中部著絲粒（1,3）亞中部著絲粒（2）1號染色體B4~5次大亞中部著絲粒C6~12X中等亞中部著絲粒9號染色體D13~15中等近端著絲粒有E16~18小中部著絲粒亞中部著絲粒16號染色體F19~20次小P中部著絲粒G21?22Y最小近端著絲粒有三、實驗試劑與器材試劑：抗凝劑：肝素溶液（500U/ml）;培養(yǎng)基：RPMI1640,按照說明書配制后抽濾、分裝，凍存?zhèn)溆?。小牛血清：市售，冰凍保存，用時在 56c水浴條件滅活。植物血球凝集素（PHA：市售，按說明書要求使用 5%NaHCO秋水仙素：已有，1ug/ml,根據(jù)需要量??！低滲溶液：0.075mol/L氯化鉀班上同意配制，我們組負責配！Carnoy固定液Giemsa染液：磷酸緩沖液（pH6.8）10ml加Giemsa原液0.3ml,用時配制。器材：光學顯微鏡1臺，離心機1臺，恒溫水浴箱1臺，恒溫箱1臺，離心管17支，量簡2個，燒杯2只，培養(yǎng)瓶2個，載玻片8張，玻片架2臺，注射器4支，槍頭2支，移液槍2支，膠塞2個，標簽紙1圈，碘酒和酒精棉球，酒精燈，1臺，天平1臺，普通冰箱1臺，立式染缸1個、染色架1個、鐐子3個，直頭小吸管14支、橡皮吸頭14個、吸水紙若干，香柏油，擦鏡紙，剪子1個，膠水。正常人類染色體G帶核型圖，核型報告紙四、實驗方法（一）培養(yǎng)液配制（在超靜工作臺內(nèi)無菌操作） ；每個培養(yǎng)瓶（容積30ml）中加入5ml培養(yǎng)液，其中含：RPMI16404ml滅活小牛血清1mlPHA2.5mg依次將上述試劑加入培養(yǎng)瓶中，反復吹打使其混合均勻，用 5%NaHC調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值至7.2-7.4。（二）采血與培養(yǎng)：先以碘酒和 75成醇消毒皮膚。用2ml滅菌注射器吸取約0.2ml肝素，作靜脈穿刺，抽取外周靜脈血1ml。轉(zhuǎn)動針筒以混勻肝素常規(guī)消毒后，立即將針頭插入滅菌小瓶內(nèi)，送入超凈工作臺，在火焰旁將血液滴入2?3個盛有5ml培養(yǎng)液的培養(yǎng)并S內(nèi)，每瓶0.2?0.3ml（6號針頭45度傾斜，約20滴），蓋上橡皮塞，輕輕搖動以混勻。貼好標簽，將培養(yǎng)瓶放在 37c恒溫箱內(nèi)靜置培養(yǎng)72h。（每天搖動培養(yǎng)瓶一次）（三）秋水仙素處理向經(jīng)恒溫培養(yǎng)68-72小時的外周血淋巴細胞培養(yǎng)液中加入秋水仙素，使其終濃度為0.4ug/ml,即每瓶（內(nèi)裝 5ml培養(yǎng)基）中用6號針頭傾斜45度角滴4滴，輕輕將液體搖勻，繼續(xù)恒溫培養(yǎng) 3-4小時。（四）標本的制備:1、終止培養(yǎng)后，將培養(yǎng)物混勻，倒人離心管內(nèi)，離心沉淀 10分鐘（1000r/min），棄去上清液。加入 37℃預溫的低滲液 8m1，輕輕打勻，置37℃水浴箱中 20分鐘。（使白細胞膨脹，染色體分散、紅細胞解體。）3、低滲處理完畢后，直接加入新配的固定液 1m1進行預固定，混勻后，離心 10分鐘（2000r/min）。4、棄去上清液，沿離心管壁緩慢加入固定液 4m1,輕輕吹打混勻，置室溫15分鐘。5、離心沉淀 1000r/min，10分鐘。6、棄去上情液，再加入固定液 4m1吹打均勻重懸細胞，固定10分鐘。7、離心沉淀 1000r/min，10分鐘。8、重復固定一次。9、盡量吸凈上清液，視管底剩下的細胞多少加入適量固定液 （0.3?0.6m1）,輕輕吹打成細胞懸液。10、滴片： 取保存在冰水中的冷濕載玻片1張，稍傾斜，用滴管吸取細胞懸液，從30~40cm高處滴2滴于玻片上，立即用口對準玻片吹氣，使細胞在玻片上散開，然后在酒精燈上略烘一下（勿全烘干，過火 3-5次），在空氣中待干。（四）染色：1、滴有細胞懸液的載片反扣在染色板上， 使片、板之間有一縫隙， 將稀釋后的Giemsa染色滴在片隙中，室溫染色 20分鐘；2、自來水輕輕沖洗（沖洗標本片的背面） 3?5秒鐘，晾干；3、鏡下觀察染色體分帶及染色情況。五、實驗結(jié)果1、觀察自己制作的標本片中染色體的形態(tài)、顏色及其顯帶情況，記錄并說明原因。計數(shù)10個細胞的染色體數(shù)。2、試述染色體G顯帶技術在人類染色體識別中的意義。繪出一套完整的中期分裂細胞的染色體圖；根據(jù)課堂提供的材料，排列初一份正常人類染色體 G帶核型圖。4、實驗報告六、注意事項（一）細胞培養(yǎng)技術1、在體外模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，培養(yǎng)從機體中取出的細胞，并使之生存和生長的技術為細胞培養(yǎng)技術。由于體外培養(yǎng)的細胞缺乏機體抗感染功能，所以在一切操作中要努力做到最大限度的無菌，防止污染。2、無菌操作的要領和要求培養(yǎng)前準備為做好培養(yǎng)前用品的充分準備工作，根據(jù)實驗內(nèi)容的要求收集好已消毒的所需用品，清點無誤后置于超凈工作臺內(nèi)，這樣可避免操作開始后由于用品不全、往反取物而增加污染機會。超凈工作臺消毒 打開紫外線殺菌燈照射消毒 20-30分鐘，然后關閉紫外燈打開風機，流入的空氣是經(jīng)過除菌板過濾的空氣，工作臺內(nèi)可保持無菌環(huán)境。為防止培養(yǎng)細胞和培養(yǎng)液等受到紫外線照射，消毒前應予先放在帶蓋容器內(nèi)或在操作時隨手攜入。3）洗手 操作時因整個前臂要伸入超凈工作臺內(nèi)，所以洗手時，一定要洗刷到肘部，然后用0.2%新潔爾滅擦洗或用 75%酒精棉球擦試?；鹧嫦?在超凈工作臺無菌環(huán)境中操作時，首先要點燃酒精燈，此后一切操作如安裝吸管橡皮頭、打開或加蓋瓶塞、使用吸管等都要經(jīng)過火焰燒灼，或在近火焰處進行。注意金屬器械不能在火焰上燒灼時間過長。燒過的用具都要待冷卻后再接觸細胞，否則會燒焦形成炭膜，再用時會把有害物質(zhì)帶入培養(yǎng)液中。操作進行培養(yǎng)操作時動作要準確敏捷，但又不能太快，以防空氣流動增加污染機會。不能用手觸及器皿的消毒部分。如已接觸，要用火焰燒灼消毒或更換。為拿取方便，工作臺面上的用品要有合理布局。原則上是右手使用方便的用品放在右側(cè)，左手使用方便的用品放在左側(cè)；酒精燈置于中央。培養(yǎng)液等不要過早開瓶，打開的培養(yǎng)液和培養(yǎng)用瓶等應保持斜位或平放，長時間開口直立，易增加落菌機會。吸取各種用液時均應分別使用吸管，不能混用，以防擴大污染或增加混淆不同細胞的機會。（二）染色體染色體是生物細胞中的一個重要的組成部分，每一物種都有一定數(shù)目及一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的染色體。染色體能通過細胞分裂而復制。并且在世代相傳的過程中具有穩(wěn)定地保持形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能的特征。染色體是遺傳物質(zhì)的載體。人類 99%的遺傳物質(zhì)位于染色體上。染色體數(shù)目、結(jié)構(gòu)的改變將導致染色體病。（三）操作接種的血樣越新鮮越好，最好是在采血后24h內(nèi)培養(yǎng)，如不能立刻培養(yǎng)，應置于4℃冰箱存放，避免保存時間過久，以免影響細胞的活力。培養(yǎng)過程中，如發(fā)現(xiàn)血樣凝集，可將培養(yǎng)瓶輕輕震蕩，使凝塊散開，繼續(xù)放回 37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)，最好每天輕輕震蕩混勻一次。Giemsa為噻嗪類染料 ,其堿性成份天青 B與DNA分子中的磷酸基結(jié)合 ,蛋白質(zhì)在一定的環(huán)境中，具有不同的嗜酸性和嗜磴性傾向 ，出現(xiàn)著色差異易于觀察。因此染液 PH值對著色效果有影響。當呈淡灰色帶紋不顯時 ,應調(diào)節(jié)染液 pH值7.0~7.2,復染10min,可獲得鮮亮的顯色效果。3、在采血接種培養(yǎng)是，不要加入太多的肝素。肝素太多可能引起溶血、抑制淋巴細胞的轉(zhuǎn)化和分裂。但肝素量也不應太少，以免發(fā)生凝血或培養(yǎng)物中出現(xiàn)纖維蛋白形成的膜狀結(jié)構(gòu)。這種膜狀物一般在培養(yǎng)24小時左右出現(xiàn)，此時可在無菌條件下將它除去以免影響培養(yǎng)效果。4、在普通培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)時，必須將培養(yǎng)瓶口蓋緊，以免培養(yǎng)液的 PH發(fā)生較大的變化。如果培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)液酸化比較嚴重(培養(yǎng)液呈黃色時)將不利于細胞生長，此時可加入適量無菌的0.14%碳酸氫鈉溶液調(diào)整或再加入2?3ml培養(yǎng)液來校正。培養(yǎng)箱的溫度應控制在37C+0.5C,溫度過高或過低都會影響細胞的生長。5、染色體標本質(zhì)量不佳的原因。如果淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗表明培養(yǎng)物生長發(fā)育良好，但制成的標本質(zhì)量不佳時，其原因可能為：⑴秋水仙素處理不當：一般秋水仙素溶液的濃度與處理時間有一定的關系，如果處理時間太短，則標本中的分裂細胞就少，相反，如果處理時間太長，則標本中的分裂細胞雖多，但其染色體縮得太短，以致形態(tài)特征模糊，不容易觀察。⑵低滲處理不當：低滲處理細胞時間過長，細胞膜往往過早破裂，以致分裂細胞或染色體丟失；如果處理時間不足時，細胞膨脹不夠， 則染色體分散不佳，難以進行染色體計數(shù)分析。⑶離心速度不合適：如果從培養(yǎng)瓶收集細胞后進行離心時的速度太低，細胞可能被丟失；如果細胞被低滲后離心速度過高，往往使分裂細胞過早破裂，分散良好的分裂相丟失，以致制出的標本分裂相較少或大部分為剩余的分散不好的分裂相。(4)標本固定不充分：如固定液不新鮮，甲醇、冰醋酸的質(zhì)量不佳，此時染色體形態(tài)模糊、不分散，其周圍有細胞漿的藍色背景。⑸載玻片清洗不徹底：玻片有油跡，致使滴在載玻片上的細胞懸液不能均勻分散，且細胞隨液體流動而丟失。(6)載玻片冷凍不夠：合適的冰濕玻片，從冰水中拿出時，其表面有一層霜雪。如冷凍不夠則無此現(xiàn)象，此時細胞難以貼附在載玻片上。6、下列因素對染色體G顯帶有一定的影響。(1)制作標本的方法：火焰干燥法制得的標本對胰蛋白酶處理的抵抗性較氣干法標本要強