食品中乳酸菌的檢測

范圍本標準規(guī)定了含乳酸菌食品中乳酸菌 ( lacticacidbacteria )的檢驗方法。本標準適用于含活性乳酸菌的食品中乳酸菌的檢驗。規(guī)范性引用文件本標準中引用的文件對于本標準的應用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 僅所注日期的版本適用于本標準。凡是不注日期的引用文件，其最新版本 (包括所有的修改單 )適用于本標準。術語和定義3.1 乳酸菌 lacticacidbacteria一類可發(fā)酵糖主要產(chǎn)生大量乳酸的細菌的通稱。 本標準中乳酸菌主要為乳桿菌屬 (Lactobacillus)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium )和鏈球菌屬(Streptococcus)。設備和材料除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設備外，其他設備和材料如下：4.1恒溫培養(yǎng)箱：36°C±1C。4.2冰箱：2C?5C。4.3均質(zhì)器及無菌均質(zhì)袋、均質(zhì)杯或滅菌乳缽。4.4天平：感量 0.1go4.5無菌試管：18mmK180mm、15mmK100mm。4.6無菌吸管：1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸頭。4.7無菌錐形瓶：500mL、250mL。培養(yǎng)基和試劑5.1 MRS(ManRogosaSharpe )培養(yǎng)基及莫匹羅星鋰鹽 (Li-Mupirocin )改良MRS培養(yǎng)基： 見附錄A中A.1。5.2 MC培養(yǎng)基(ModifiedChalmers 培養(yǎng)基)：見附錄 A中A.2。5.3 0.5%蔗糖發(fā)酵管：見附錄A中A.3。5.4 0.5%纖維二糖發(fā)酵管：見附錄A中A.3。5.5 0.5%麥芽糖發(fā)酵管：見附錄A中A.3。叮叮小文庫5.6 0.5%甘露醇發(fā)酵管：見附錄A中A.3。5.7 0.5%水楊苷發(fā)酵管：見附錄A中A.3。5.8 0.5%山梨醇發(fā)酵管：見附錄A中A.3。2叮叮小文庫5.9 0.5%乳糖發(fā)酵管：見附錄A中A.3。5.10七葉苷發(fā)酵管：見附錄A中A.45.11革蘭氏染色液：見附錄 A中A.5。5.12 莫匹羅星鋰鹽(Li-Mupirocin ):化學純。5.13 半胱氨酸鹽酸鹽(CysteineHydrochloride ):純度〉99%檢驗程序孚L酸菌檢驗程序見圖1。乳桿菌計數(shù)捉取艱岐稈菌或乳桿菌菌落接 種于MR5球脂平板I嗜熱璉球菌攝種于 MC瓊脂平■扳(可選做)菌種鑒定1圖1乳醋苗愴驗程序圖操作步驟7.1樣品制備

S樣品的全部制備過程均應遵循無菌操作程序。冷凍樣品可先使其在 2C?5C條件下解凍，時間不超過 18h,也可在溫度不超過 45C的條件解凍，時間不超過 15min。3叮叮小文庫固體和半固體食品：以無菌操作稱取 25g樣品，置于裝有 225mL生理鹽水的無菌均質(zhì)杯內(nèi)，于 8000r/min?10000r/min 均質(zhì)1min?2min，制成1:10樣品勻液；或置于 225mL生理鹽水的無菌均質(zhì)袋中， 用拍擊式均質(zhì)器拍打 1min?2min制成1:10的樣品勻液。液體樣品：液體樣品應先將其充分搖勻后以無菌吸管吸取樣品 25mL放入裝有225mL生理鹽水的無菌錐形瓶（瓶內(nèi)預置適當數(shù)量的無菌玻璃珠）中，充分振搖，制成1:10的樣品勻液。7.2步驟用1mL無菌吸管或微量移液器吸取 1:10樣品勻液1mL,沿管壁緩慢注于裝有 9mL生理鹽水的無菌試管中（注意吸管尖端不要觸及稀釋液），振搖試管或換用 1支無菌吸管反復吹打使其混合均勻，制成 1:100的樣品勻液。另取1mL無菌吸管或微量移液器吸頭，按上述操作順序，做 10倍遞增樣品勻液，每遞增稀釋一次，即換用 1次1mL滅菌吸管或吸頭。孚L酸菌計數(shù)孚L酸菌總數(shù)根據(jù)待檢樣品活菌總數(shù)的估計， 選擇2個?3個連續(xù)的適宜稀釋度， 每個稀釋度吸取 1mL樣品勻液于滅菌平皿內(nèi)，每個稀釋度做兩個平皿。稀釋液移入平皿后，將冷卻至 50C的MRS瓊脂培養(yǎng)基傾注入平皿約 15mL，轉(zhuǎn)動平皿使混合均勻。 36C±1C厭氧培養(yǎng)48h翌h，培養(yǎng)后計數(shù)。從樣品稀釋到平板傾注要求在 15min內(nèi)完成。雙歧桿菌計數(shù)根據(jù)對待檢樣品雙歧桿菌含量的估計，選擇 2個?3個連續(xù)的適宜稀釋度，每個稀釋度吸取1mL樣品勻液于滅菌平皿內(nèi)，每個稀釋度做兩個平皿。稀釋液移入平皿后，將冷卻至 50C的莫匹羅星鋰鹽和半胱氨酸鹽酸鹽的 MRS培養(yǎng)基傾注入平皿約 15mL，轉(zhuǎn)動平皿使混合均。36C±C厭氧培養(yǎng)48h±2h，培養(yǎng)后計數(shù)平板上的所有菌落數(shù)。從樣品稀釋到平板傾 注要求在15min內(nèi)完成。嗜熱鏈球菌計數(shù)根據(jù)待檢樣品嗜熱鏈球菌活菌數(shù)的估計，選擇 2個?3個連續(xù)的適宜稀釋度，每個稀釋度吸取1mL樣品勻液于滅菌平皿內(nèi)，每個稀釋度做兩個平皿。稀釋液移入平皿后，將冷卻 至50C的MC培養(yǎng)基傾注入平皿約 15mL，轉(zhuǎn)動平皿使混合均勻。 36C±1C需氧培養(yǎng)48h±4叮叮小文庫2h，培養(yǎng)后計數(shù)。嗜熱鏈球菌在 MC瓊脂平板上的菌落特征為：菌落中等偏小，邊緣整齊光滑的紅色菌落，直徑 2mr±1mm，菌落背面為粉紅色。從樣品稀釋到平板傾注要求在15min內(nèi)完成。723.4乳桿菌計數(shù)723.1項乳酸菌總數(shù)結(jié)果減去 項雙歧桿菌與 項嗜熱鏈球菌計數(shù)結(jié)果之和即得乳桿菌計數(shù)。7.3菌落計數(shù)可用肉眼觀察，必要時用放大鏡或菌落計數(shù)器， 記錄稀釋倍數(shù)和相應的菌落數(shù)量。 菌落計數(shù)以菌落形成單位（ colony-formingunits , CFU）表示。選取菌落數(shù)在 30CFU?300CFU之間、無蔓延菌落生長的平板計數(shù)菌落總數(shù)。低于30CFU的平板記錄具體菌落數(shù)，大于 300CFU的可記錄為多不可計。每個稀釋度的菌落數(shù)應采用兩個平板的平均數(shù)。其中一個平板有較大片狀菌落生長時，則不宜采用，而應以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數(shù)；若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻， 即可計算半個平板后乘以 2,代表一個平板菌落數(shù)。7.3.3當平板上出現(xiàn)菌落間無明顯界線的鏈狀生長時，則將每條單鏈作為一個菌落計數(shù)。7.4結(jié)果的表述7.4.1若只有一個稀釋度平板上的菌落數(shù)在適宜計數(shù)范圍內(nèi)，計算兩個平板菌落數(shù)的平均值，再將平均值乘以相應稀釋倍數(shù)，作為每g（mL）中菌落總數(shù)結(jié)果。7.4.2若有兩個連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)在適宜計數(shù)范圍內(nèi)時，按公式（1）計算：.............（式中:N――樣品中菌落數(shù)；H――平板（含適宜范圍菌落數(shù)的平板）菌落數(shù)之和 ;n1――第一稀釋度（低稀釋倍數(shù)）平板個數(shù)；n2――第二稀釋度（高稀釋倍數(shù)）平板個數(shù)；d――稀釋因子（第一稀釋度）。5叮叮小文庫743若所有稀釋度的平板上菌落數(shù)均大于 300CFU，則對稀釋度最高的平板進行計數(shù)，其他平板可記錄為多不可計，結(jié)果按平均菌落數(shù)乘以最高稀釋倍數(shù)計算。744若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均小于 30CFU，則應按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計算。7.4.5若所有稀釋度（包括液體樣品原液）平板均無菌落生長，則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)計算。7.4.6若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均不在30CFU?300CFU之間，其中一部分小于30CFU或大于300CFU時，則以最接近 30CFU或300CFU的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計算。7.5菌落數(shù)的報告菌落數(shù)小于 100CFU時，按 四舍五入”原則修約，以整數(shù)報告。菌落數(shù)大于或等于 100CFU時，第3位數(shù)字采用 四舍五入”原則修約后，取前 2位數(shù)字，后面用 0代替位數(shù)；也可用10的指數(shù)形式來表示，按 四舍五入”原則修約后，采用兩位有效數(shù)字。稱重取樣以 CFU/g為單位報告，體積取樣以 CFU/mL為單位報告。結(jié)果與報告根據(jù)菌落計數(shù)結(jié)果出具報告，報告單位以 CFU/g（mL）表示。乳酸菌的鑒定（可選做）9.1純培養(yǎng)挑取3個或以上單個菌落，嗜熱鏈球菌接種于 MC瓊脂平板，乳桿菌屬接種于 MRS瓊脂平板，置 36C±C厭氧培養(yǎng)48h。9.2鑒定雙歧桿菌的鑒定按 GB4789.34的規(guī)定操作。涂片鏡檢：乳桿菌屬菌體形態(tài)多樣，呈長桿狀、彎曲桿狀或短桿狀。無芽胞，革蘭氏染色陽性。嗜熱鏈球菌菌體呈球形或球桿狀，直徑為 0.5ym?2.0ym,成對或成鏈排列，無芽胞，革蘭氏染色陽性。孚L酸菌菌種主要生化反應見表 1和表2。6叮叮小文庫表1常見乳桿茵屈內(nèi)種的陽水化合物反應七纖菱甘水山M菌葉第芽題暢梨1芋昔二穩(wěn)醇昔陣權種擅■-3+■****■--_----++<--+d_■---+++444-444+-++<**++?述俸示時托M上苗株陽性；-表牙死K以上菌株陰性：日表示"％~矽號菌株陽性；HE）表示未測定一表2嗜熱惟球菌旳主娶土化反應馬躍菌種乳穩(wěn)甘莊酶水楊肴山梨酶七葉昔嗜熱稱碌菌（必恥咖巧應遊）-+-----WVVWWWWWVWV注-俵示兄X以上菌襪陽性；-恚示兀昇以上茵柿陰性-附錄A培養(yǎng)基及試劑A.1MRS培養(yǎng)基成分蛋白胨10.0g牛肉粉5.0g酵母粉4.0g葡萄糖20.0g吐溫801.0mLK2HPO47H2O2.0g醋酸鈉3H2O5.0g檸檬酸二銨2.0gMgSO47H2O0.2gMnSO44H2O0.05g瓊脂粉15.0g7叮叮小文庫pH6.2制法將上述成分加入到 1000mL蒸餾水中，加熱溶解，調(diào)節(jié) pH，分裝后121C高壓滅菌15min?20min。莫匹羅星鋰鹽和半胱氨酸鹽酸鹽改良 MRS培養(yǎng)基莫匹羅星鋰鹽儲備液制備：稱取 50mg莫匹羅星鋰鹽加入到 50mL蒸餾水中，用 0.22m微孔濾膜過濾除菌。半胱氨酸鹽酸鹽儲備液制備：稱取 250mg莫匹羅星鋰鹽加入到 50mL蒸餾水中，用0.22m微孔濾膜過濾除菌。A.1.3.2制法將A.1.1成分加入到950mL蒸餾水中，加熱溶解，調(diào)節(jié)pH，分裝后121C高壓滅菌15min20min。臨用時加熱熔化瓊脂，在水浴中冷至48C,?用帶有0.22m微孔濾膜的注射器將莫匹羅星鋰鹽儲備液及半胱氨酸鹽酸鹽儲備液制備加入到熔化瓊脂中，使培養(yǎng)基中莫匹羅星鋰鹽的濃度為50g/mL,半胱氨酸鹽酸鹽的濃度為500g/mL。A.2MC培養(yǎng)基A.2.1成分大豆蛋白胨5.0g牛肉粉3.0g酵母粉3.0g葡萄糖20.0g乳糖20.0g碳酸鈣10.0g瓊脂15.0g蒸餾水1000mL5.0mL%中性紅溶液pH6.0制法將前面7種成分加入蒸餾水中，加熱溶解，調(diào)節(jié) pH，加入中性紅溶液。分裝后 121C8叮叮小文庫高壓滅菌15min?20min。9叮叮小文庫A.3乳酸桿菌糖發(fā)酵管A.3.1基礎成分牛肉膏5.0g蛋白胨5.0g酵母浸膏5.0g吐溫800.5mL瓊脂1.5g1.6%溴甲酚紫酒精溶液1.4mL蒸餾水1000mLA.3.2制法,121C高壓滅菌15min按0.5%加入所需糖類，并分裝小試管20min。A.4七葉苷培養(yǎng)基A.4.1成分蛋白胨5.0g磷酸氫二鉀1.0g七葉苷3.0g枸櫞酸鐵0.5g1.6%溴甲酚紫酒精溶液1.4mL蒸餾水100mLA.4.2制法將上述成分加入蒸餾水中，加熱溶解，121C高壓滅菌15minA.5革蘭氏染色液20min。A.5.1結(jié)晶紫染色液A.5.1.1成分結(jié)晶紫1.0g95%乙醇20mL1%草酸銨水溶液80mLA.5.1.2制法將結(jié)晶紫完全溶解于乙醇中，然后與草酸銨溶