DB11-T 507-2007-玉米品種純度及真實(shí)性SSR分子檢測方法-（高清有效）

DBICS65.020.20DBB21備案號(hào)：21532-2007北 京 市 地 方 標(biāo) 準(zhǔn)DB11/T507—2007玉米品種純度及真實(shí)性SSR分子檢測方法SSR-basedMethodtoAssayPurityandGenuinenessinZeamaysL.2007-11-22發(fā)布 2008-02-01實(shí)施北京市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布DB11/T507—2007前言AB本標(biāo)準(zhǔn)由北京市農(nóng)業(yè)局提出。本標(biāo)準(zhǔn)由北京市農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)種植業(yè)分會(huì)歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：北京市種子管理站、北京市農(nóng)林科學(xué)院玉米研究中心、全國農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心。郭慧杰。IDB11/T507—2007玉米品種純度及真實(shí)性SSR分子檢測方法范圍本標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)SSR分子標(biāo)記原理，規(guī)定了進(jìn)行玉米單交種和親本自交系的品種純度及真實(shí)性檢測方法的儀器設(shè)備及試劑、引物篩選、試驗(yàn)步驟、純度檢測和真實(shí)性鑒定。本標(biāo)準(zhǔn)適用于玉米單交種及親本自交系的純度及真實(shí)性檢測。術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。2.1品種純度varietalpurity品種在DNA分子標(biāo)記帶型方面典型一致的程度，用供檢樣品中本品種的種子數(shù)占樣品種子總數(shù)的百分率表示。2.2品種真實(shí)性varietalgenuineness供檢品種與標(biāo)準(zhǔn)品種的符合程度。2.3SSR分子標(biāo)記simplesequencerepeatmarker由寡核苷酸為單位的簡單串聯(lián)重復(fù)序列。2.4引物primer結(jié)合在模板DNA上的互補(bǔ)短鏈，提供3＇-OH末端作為DNA合成的起點(diǎn)，延伸合成模板DNA的互補(bǔ)鏈。原理PCRSSR的純度及真實(shí)性。儀器設(shè)備及試劑儀器設(shè)備PCR；DNA（300A（0.01g,001g；冰箱；微量加樣器（05L～10L,20L～20μ,00L～100L；磁力攪拌器；膠片觀察燈；水平搖床；高壓滅菌鍋；酸度計(jì)等。（500mL1000mL5L.m0μ20μL，100L)（10L9696PCR（55cm×3cm8試劑（EDTA-Na（Hl3%(NaOH)；10CR（g2+-20℃（MgCl2（dNTPsAμL-20℃SSR-20℃；礦物油；1DB11/T507—2007（BindingSlne；剝離硅烷（Reliae；無水乙醇；四甲基乙二胺；過硫酸銨；冰醋酸；硝酸銀；甲醛溶液等。DNA提試劑、PCR反應(yīng)試劑、電泳試劑和銀染試劑的成分及配制按附錄A執(zhí)行。引物篩選適宜引物篩選應(yīng)遵守?cái)U(kuò)增后的雜交種SSR電泳譜帶含有雙親譜帶，而且?guī)颓逦⒅貜?fù)性好的原則?？梢岳靡呀?jīng)公開發(fā)表的引物，也可以自行篩選引物。自行篩選時(shí)，取測試雜交種種子10粒及父母本種子各5粒，利用一系列引物進(jìn)行分析，從中確定適宜的引物。常見適用于玉米品種的純度及真實(shí)性分析的SSR引物名稱及序列參見附錄B。方法步驟DNA提取96150μLDNA5min150μLTEDNA樣品DNA溶液可以直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增或在冰箱中冷凍長期保存。擴(kuò)增96PCR13.5L2L10PCR2.5LMgCl2（25mo/12LdN(.5mo/025LSR0molL025LTqAU/L)，混勻。2LDNA1PCR：94℃預(yù)變性5min；9440s，6035s，72℃45s35；72℃5min；4℃保存。檢測膠板制作0.5%親和硅烷（BindingSilane）0.5mL，2.0%剝離硅烷（RepelSilane）0.5mL。操作過程中防止兩塊玻璃板互相平儀調(diào)平。4.5%PA80mL80L25%80L1h預(yù)電泳在正極槽（下槽）和負(fù)極槽（上槽）1TBE600ml，拔出梳子，90W15min～20min。點(diǎn)樣20lPCR4l6PCR95℃5min，4℃冷10min5l電泳80W恒功率電泳30min。染色電泳結(jié)束后，分開兩塊玻璃板。將帶凝膠的玻璃板浸入固定液中輕輕晃動(dòng)3min，再放入去離子水中漂洗10s，然后將膠板放入染色液中染色5min。2DB11/T507—2007將染色后的膠板放入去離子水中漂洗10s，然后在顯影液中輕輕晃動(dòng)直至帶紋清晰。將顯影后的膠板放入固定液中定影5min，再用去離子水漂洗1min。純度檢測取樣從送檢樣品中隨機(jī)取不少于100粒種子。SSR分析按照本標(biāo)準(zhǔn)第6章規(guī)定的方法步驟進(jìn)行。數(shù)據(jù)計(jì)算和表示（自交系供檢種子粒數(shù)非本品種種子粒數(shù)100供檢種子粒數(shù)（供檢種子粒數(shù)母本種子粒數(shù)其他類型種子粒數(shù)100供檢種子粒數(shù)真實(shí)性鑒定取樣分別從送檢樣品和標(biāo)準(zhǔn)樣品中各隨機(jī)抽取10粒種子。SSR分析40SSR6結(jié)果判定送檢樣品與標(biāo)準(zhǔn)樣品之間未檢測出差異，判定送檢樣品與標(biāo)準(zhǔn)樣品屬于同一品種。送檢樣品與標(biāo)準(zhǔn)樣品有一對以上（包括一對）引物檢測出差異，判定送檢樣品與標(biāo)準(zhǔn)樣品不屬于同一品種。送檢樣品或標(biāo)準(zhǔn)樣品存在兩種或兩種以上帶型，以出現(xiàn)次數(shù)最多的一種帶型作為該樣品典型帶型。3DB11/T507—2007附錄A（規(guī)范性附錄）主要試劑配制DNA提取試劑配制10mol/LNaOH160mL200mL。0.5ml/LDTA（H8.：取EDTA-Na218.1g100mL蒸餾水，再加入適量10mol/LNaOH溶液，加熱至完全溶解后，冷卻至室溫，用10mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至8.0，加水定容至1000mL，高壓滅菌。1mlLTsHpH0HCl)調(diào)pH至8.0，加水定容至500mL，高壓滅菌。TEH20mlLTiHH8）mL0mlLET（pH.）1LDNA提取液：取NaOH2g，先用200mL蒸餾水溶解，再加水定容至500mL，高壓滅菌。PCR擴(kuò)增試劑配制dNTPs：用超純水分別配制ATP、GTP、CTP、TTP終濃度為100mmol/L的儲(chǔ)存液，各取20μL混合，加入720μL超純水定容至終濃度2.5mmol/L。SSR引物：用超純水分別配制左引物（L）和右引物（R）終濃度均為40μmol/L的儲(chǔ)存液，等體積混合成20μmol/L。凝膠與電泳試劑配制6倍加樣緩沖液：取去離子甲酰胺49mL，加入0.5mol/LEDTA（pH8.0）1mL，溴酚蘭0.125g，二甲苯青FF0.125g，混勻。10倍TBE緩沖液：稱取三羥甲基氨基甲烷（Tris）108g55g，加適量去離子水溶解后，再加入0.5mol/LEDTA（pH8.0）37mL，加水定容至1000mL。40%PA190g和甲叉雙丙烯酰胺400mL500mL。4.5%PA450g，10倍TBE緩沖液100mL和40%PA膠112.5親和硅烷（BindingSilane）緩沖液：取無水乙醇49.75mL和冰醋酸250μL，混合。05%Bnigiae9.95mL5025％過硫酸銨：取0.25g過硫酸銨，加1mL去離子水溶解，現(xiàn)用現(xiàn)配。1倍TBE緩沖液：取10倍TBE500mL，加4500mL去離子水混勻。銀染試劑配制固定液：取冰醋酸100mL，加去離子水定容至1000mL。染色液：取硝酸銀2g，加去離子水定容至1000mL。顯影液：取氫氧化鈉30g和甲醛5mL，加去離子水定容至1000mL。4DB11/T507—2007附錄B（資料性附錄SSR表B.1 玉米品種純度檢測常用的SSR引物編號(hào)引物名稱引物序列1bnlg439左引物（L）: 右引物（R）: 2bnlg161左引物（L）: 右引物（R）: 3bnlg125左引物（L）: GGGACAAAAGAAGAAGCAGAG-3＇右引物（R）: 4bnlg198左引物（L）: 右引物（R）: 5bnlg238左引物（L）: 右引物（R）: 6bnlg240左引物（L）: 右引物（R）: 7bnlg107左引物（L）: 右引物（R）: CAACAACAAGTGGCTGGCTAGGGTGAA-3＇8phi034左引物（L）: 右引物（R）: GGGGAGCACGCCTTCGTTCT-3＇9phi053左引物（L）: 右引物（R）: AACCCAACGTACTCCGGCAG-3＇10phi056左引物（L）: ACTTGCTTGCCTGCCGTTAC-3＇右引物（R）: CGCACACCACTTCCCAGAA-3＇11phi065左引物（L）: 右引物（R）: 12phi072左引物（L）: 右引物（R）: 13phi080左引物（L）: CACCCGATGCAACTTGCGTAGA-3＇右引物（R）: TCGTCACGTTCCACGACATCAC-3＇14phi085左引物（L）: 右引物（R：3＇15phi96100左引物（L）: AGGAGGACCCCAACTCCTG-3＇右引物（R）: 16umc1061左引物（L）: 右引物（R）: 17bnlg233左引物（L）: 右引物（R）: GGAGCTTGCGCTTTTTAACA-3＇18umc2084左引物（L）: 右引物（R）: 19bnlg1450左引物（L）: ACAGCTCTTCTTGGCATCGT-3＇右引物（R）: GACTTTGCTGGTCAGCTGGT-3＇20bnlg1940左引物（L）: 5CCTTTTGTTTCAGGCCGTTA-3＇右引物（R）: 5DB11/T507—2007表B.2 玉米品種真實(shí)性鑒定常用的SSR引物編號(hào)引物名稱引物序列1bnlg125左引物（L）: 5＇-GGGACAAAAGAAGAAGCAGAG-3＇右引物（R）: 2bnlg439左引物（L）: 右引物（R）: 3phi072左引物（L）: 右引物（R）: 4bnlg162左引物（L）: 右引物（R）: 5bnlg161左引物（L）: 右引物（R）: 6bnlg198左引物（L）: 右引物（R）: 7phi116左引物（L）: 右引物（R）: 5＇-TCCCTGCCGGGACTCCTG-3＇8phi123左引物（L）: 5＇-GGAGACGAGGTGCTACTTCTTCAA-3＇右引物（R）: 9phi065左引物（L）: 5＇-AGGGACAAATACGTGGAGACACAG-3＇右引物（R）: 10umc1040左引物（L）: 5＇-CATTCACTCTCTTGCCAACTTGA-3＇右引物（R）: 11umc1944左引物（L）: 右引物（R）: 12phi077左引物（L）: 5＇-GAGAAGAGGATCAGGTTCGTTCCA-3＇右引物（R）: 13bnlg240左引物（L）: 右引物（R）: 14bnlg238左引物（L）: 右引物（R）: 15phi085左引物（L）: 5＇-AGCAGAACGGCAAGGGCTACT-3＇右引物（R）: 5＇-TTTGGCACACCACGACGA-3＇16umc1196左引物（L）: 右引物（R）: 5＇-AGTCGTTCGTGTCTTCCGAAACT-3＇17bnlg1006左引物（L）: 5＇-GACCAGCGTGTTGATCCC-3＇右引物（R）: 5＇-GAGACCCCGACTCTCTCTC-3＇18bnlg1621左引物（L）: 5＇-CTCTTCGATCTTTAAGAGAGAGAGAG-3＇右引物（R）: 5＇-ACACGAGGCACTGGTACTAACG-3＇19phi295450左引物（L）: 5＇-CCTTTTCATGTTGCTTTCCC-3＇右引物（R）: 5＇-GCCCAATCCTTCCTTCCT-3＇20phi053左引物（L）: 右引物（R）: 5＇-AACCCAACGTACTCCGGCAG-3＇6表B.2（續(xù)）

DB11/T507—2007編號(hào)引物名稱引物序列編號(hào)引物名稱引物序列21umc1904左引物（L）: 右引物（R）: 22phi048左引物（L）: 右引物（R）: 23phi080左引物（L）: 右引物（R）: 5＇-TCGTCACGTTCCACGACATCAC-3＇24phi099左引物（L）: 5＇-TACAAAAATCAGGACTGCGAAAAACCCAA-3＇右引物（R）: 5＇-GTCGGTGTGTGATCCTTCCAC-3＇25phi015左引物（L）: 5＇-GCAACGTACCGTACCTTTCCGA-3＇右引物（R）: 5＇-26phi037左引物（L）: 5＇-CCCAGCTCCTGTTGTCGGCTCAGAC-3＇右引物（R）: 5＇-TCCAGATCCGCCGCACCTCACGTCA-3＇27bnlg1306左引物（L）: 右引物（R）: 5＇-CAAAAACAAATGGCAGCTGA-3＇28bnlg1505左引物（L）: 5＇-GAAAGACAAGGCGAAGTTGG-3＇右引物（R）: 5＇-GCTTCTGAACTGGATCGGAG-3＇29bnlg1884左引物（L）: 右引物（R）: 30umc2105左引物（L）: 右引物（R）: 5＇-TCCCGTGACACTCTCTTTCTCTCT-3＇31phi047左引物（L）: 5＇-GGAGATGCTCGCACTGTTCTC-3＇右引物（R）: 32bnlg2291左引物（L）: 5＇-CCTCTCGATGTTCTGAAGCC-3＇右引物（R）: 33umc1822左引物（L）: 右引物（R）: 34bnlg1401左引物（L）: 5＇-CACTCGGTTTTTGCTTAGCC-3＇右引物（R）: 5＇-GTGTCGTCGAGTGCATGC-3＇35nc004左引物（