RNApull-down的秘傳絕技一口氣都告訴你

RNApull-down的秘傳絕技，???都告訴你！最近?年的?編碼RNA熱潮雖然已經(jīng)不再新穎，但相信依舊有許多?伙伴們深陷其中，?最普遍的ceRNA機制已經(jīng)不再受?家歡迎，RBP機制逐漸成為選擇的?向，RBP機制最重要的?點就是檢測與?編碼RNA結(jié)合的蛋?質(zhì)。檢測RNA與其結(jié)合蛋?的重要技術(shù)?式就是RNApull-down。這?就會有?個問題：RNApull-down和RIP有什么不同，如何進?選擇？解決這個問題，?先我們需要介紹?下原理：RNApull-down技術(shù)是利??物素標(biāo)記的RNA和鏈霉親和素標(biāo)記的磁珠來?效富集及鑒定RNA結(jié)合蛋?。?RIP實驗是運?針對?標(biāo)蛋?的抗體把相應(yīng)的RNA-蛋?復(fù)合物沉淀下來，經(jīng)過分離純化對RNA進?分析。兩者均為檢測RNA和蛋?的相互作?，只是檢測的形式不同?已。（圖?來源?絡(luò)）?、如何進?該實驗，如何選擇試劑盒？萬事開頭難，相信很多?伙伴在剛開始進?實驗的時候都咨詢過?些試劑商，本?也詢問過?些，有些試劑商直接建議全部外包實驗，并包括后續(xù)的質(zhì)譜檢測。建議?家盡量不要選擇這種?式，畢竟實驗結(jié)果是真是假，不能得到很好保障，?常影響后續(xù)實驗進展。（圖?來源?絡(luò)）?、RNApull-down操作需注意！1.實驗前期準(zhǔn)備1).?先是樣本的收集和處理，如果樣本是細胞，要考慮細胞中該RNA的表達量，如果RNA含量較低，那提取出來的RBP可想?知會?常少，建議?家提前準(zhǔn)備較多的細胞。（本?的試劑盒要求的量是107個細胞，實驗操作時使?了8個10cm??。）也看到很多?伙伴說可以先進?過表達該RNA后再進?pull-down實驗，?家可以嘗試。2).由于該實驗我們提取的?的蛋?和細胞中的RNA含量都較低，因此更需要注意的是：實驗操作過程預(yù)防RNA和蛋?的降解！進?實驗的前兩天，?定要準(zhǔn)備好實驗需要的槍頭，EP管等。均需?酶?菌！提前?壓，做好準(zhǔn)備，實驗進?時，戴好?套和?罩！實驗操作臺提前使?DEPC?擦拭！剩余耗材準(zhǔn)備：磁?架，碎冰，低溫?速離?機，冰盒，漩渦振蕩器。2.實驗操作重點實驗的操作，?家可以根據(jù)??購買的試劑盒說明書嚴(yán)格進?。?般均包括以下?個關(guān)鍵步驟。1).探針的制備：這步強烈建議?家交給靠譜的公司進?構(gòu)建，便宜好?易上?！2).探針-磁珠制備：按照說明書進?操作，沒有任何問題。3).蛋?樣本的提取，除核酸：即制備蛋?樣本。如果設(shè)計的組較多，可以選擇分別提取，每次提取的蛋?樣本可短時間內(nèi)，凍存于-80度冰箱低溫保存。4).RNApull-down：同樣是按照說明書進?。重點：到最后?步孵育洗脫后收集上清（即最終樣本），?家可以根據(jù)??的情況，加適當(dāng)量buffer（減少量）！例如本?試劑盒上寫60ul，但加上60ul后，蛋?濃度太低，以?于后續(xù)實驗進?有些困難。（圖?來??絡(luò)）三、后續(xù)實驗安排有哪些？1.質(zhì)譜實驗收集的蛋?樣本進?質(zhì)譜檢測是?多數(shù)?伙伴的選擇。質(zhì)譜檢測?般需要試劑公司進?，這項服務(wù)國內(nèi)有很多公司進?選擇。需要?家提前聯(lián)系好如何進?送樣更?便檢測。本?選擇公司建議送膠條樣本，需要??進?蛋?電泳，?tip!：樣本?定要全部上樣。（本?即使制備?量細胞，后續(xù)buffer加?較少，但考馬斯亮藍染?后，條帶也是?常淺，但只要能夠看見條帶，即可進?質(zhì)譜檢測?。?.蛋?檢測（WB實驗）WB蛋?檢測即為常規(guī)檢測。3.銀染實驗?多數(shù)?章中都有?常漂亮的銀染圖?，本?就是被此吸引，但操作過程中發(fā)現(xiàn)?常多的要點！1).?先，市?上有較多好?的銀染試劑盒可供?家選擇。?伙伴們可以直接購買，如果實驗室試劑較全，也可??制備。2).銀染實驗過程中使?的?，?常重要！！?定要選擇去離??或三蒸?（本?嫌?煩中間步驟使?過?來?，結(jié)果?常糟糕。）3).染膠的器材，?或托盤提前處理，洗?凈后，使?超純?沖洗。4).銀染過程中，洗滌顯?時，條帶剛顯現(xiàn)或背景開始變?yōu)榈S?，即需要終?反應(yīng)，否則背景會?常深。（圖?來??絡(luò)）最后，好的實驗數(shù)據(jù)需要每個實驗???盡?去做，如果?伙伴們對RNApull-down實驗抱有嘗試的?態(tài)，那么細?查資料，準(zhǔn)備實驗都會有好的收獲。RNApull-down并不困難，?伙伴們沖呀?。▓D?來??絡(luò)）注：此推?未經(jīng)許可禁?轉(zhuǎn)載！?【新?攻略】?編碼RNA這么?，你?章的插圖畫好了嗎？?【新?攻略】??繁育?般常識及注意事項?【新?攻略】原代細胞分