綠膿桿菌檢驗技術(shù)課件

化妝品中銅綠假單胞菌（Pseudomonas

aeruginosa）

的檢測-化妝品中銅綠假單胞菌（Pseudomonas

aerugin1目的：

1.了解化妝品中銅綠假單胞菌檢測的基本過程。2.掌握幾種培養(yǎng)基的配置方法。3.掌握銅綠假單胞菌的鑒定及生化特征。原理：

銅綠假單胞菌為需氧及兼性厭氧的革蘭氏陰性桿菌，有鞭毛，在普通培養(yǎng)基上生長良好，菌落大小不一，平均直徑2mm～3mm，扁平，邊緣不整齊，且常呈相互融合狀態(tài)。氧化酶陽性，能產(chǎn)生綠膿菌素，此外還能液化明膠，還原硝酸鹽產(chǎn)生氮氣，在42℃條件下可以生長，可與類似菌區(qū)別。-目的：-2操作步驟

檢樣前化妝品的處理

接樣于營養(yǎng)肉湯增菌，37℃，12h，140rpm培養(yǎng)分離培養(yǎng)，挑取培養(yǎng)物接于十六烷基三甲基溴化銨平板，37℃，18-24h

染色鏡檢

配十六烷基三甲基溴化銨培養(yǎng)基（選擇性培養(yǎng)基，大腸桿菌不能生長，革蘭氏陽性菌生長完全受到抑制）配綠膿菌素測定用培養(yǎng)基，明膠培養(yǎng)基，硝酸鹽蛋白胨水培養(yǎng)基，普通瓊脂斜面培養(yǎng)基-操作步驟檢樣前化妝品的處理-3操作步驟特征性檢驗氧化酶綠膿菌素硝酸鹽還原明膠液化42℃生長試驗試驗產(chǎn)氣試驗試驗試驗取菌+1滴接菌，37℃接菌接菌接菌二甲基對24h+氯仿37℃24h37℃24h42℃24h苯二胺移出+鹽酸紫紅色（+）紫紅色（+）有氣體（+）溶解成液狀（+）生長（+）不變色（-）不變色（-）無氣體（-）未溶解（-）不生長（-）-操作步驟4實驗一培養(yǎng)基的制備及細菌的分離培養(yǎng)

-實驗一培養(yǎng)基的制備及細菌的分離培養(yǎng)-5實驗目的掌握培養(yǎng)基制備的原理和方法掌握細菌的分離培養(yǎng)了解滅菌方法-實驗目的掌握培養(yǎng)基制備的原理和方法-6實驗原理

不同的微生物生長繁殖都需要提供一定的營養(yǎng)條件，在實驗室中，微生物的營養(yǎng)是由培養(yǎng)基來提供的。培養(yǎng)基是按照微生物生長繁殖所需要的營養(yǎng)物質(zhì)，用人工方法配制而成的營養(yǎng)基質(zhì)。

除營養(yǎng)條件以外，微生物必須在最適酸堿度范圍內(nèi)才表現(xiàn)出最大生命力，因此，應(yīng)針對不同的微生物將培養(yǎng)基的pH值調(diào)節(jié)到適當范圍。

-實驗原理不同的微生物生長繁殖都需要提供一定的營養(yǎng)條件7操作步驟按培養(yǎng)基

配方稱量加水加

熱熔化調(diào)節(jié)

pH值分裝

包裝滅菌備用→-操作步驟按培養(yǎng)基

配方稱量加水加

熱熔化調(diào)節(jié)

pH值分裝

包8操作步驟1.綠膿菌素測定用培養(yǎng)基300ml加熱溶解調(diào)pH分裝試管高壓制成斜面2.明膠培養(yǎng)基300ml加熱溶解調(diào)pH分裝試管高壓直立制成高層3.硝酸鹽蛋白胨水培養(yǎng)基300ml加熱溶解調(diào)pH分裝有小倒管的試管高壓直立制成高層4.普通瓊脂斜面培養(yǎng)基300ml加熱溶解調(diào)pH分裝試管高壓制成斜面-操作步驟1.綠膿菌素測定用培養(yǎng)基300ml-9注意事項培養(yǎng)基溶解時，加有瓊脂的培養(yǎng)基易沸，應(yīng)注意看守。注意調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH。稱牛肉膏用玻片，稱甘油用小燒杯。加熱后應(yīng)補足液量。注意做好標記。-注意事項培養(yǎng)基溶解時，加有瓊脂的培養(yǎng)基易沸，應(yīng)注意看守。-10細菌的分離培養(yǎng)原理：通過劃線，將混雜的細菌在平板表面逐一分散，經(jīng)培養(yǎng)后，各自形成菌落(colony)。根據(jù)菌落形態(tài)、特征挑選單個菌落，移種培養(yǎng)后，即得到純種細菌。-細菌的分離培養(yǎng)原理：-11方法：平板劃線法有幾種，可根據(jù)不同情況選用其中一種。(1)平行劃線法此法適用于含菌不多的液體標本，如腦脊液(CSF)、腹水、分泌物、膿汁以及稀薄的菌液等。①左手斜持平板底，右手持接種環(huán)。接種環(huán)在火焰上滅菌，冷卻后，沾取一接種環(huán)標本，先在平板的一端涂開，并從此處開始向下劃密集的平行線，約占平板面積的一半。②將平板轉(zhuǎn)180°角，從平板另一端開始也劃密集的平行線，直到劃滿平板的剩余部分。將平板底放入蓋內(nèi)，接種環(huán)火焰滅菌后放下，將平板倒置，37℃培養(yǎng)。-方法：-12(2)分區(qū)劃線法。此法適用于含菌多的檢測標本，如糞便，喀痰、細菌固體培養(yǎng)物等。①劃線前的操作同平行劃線法。先在平板的一端將標本涂開并在平板的1/5～1/4面積上劃密集的平行線，接種環(huán)火焰滅菌。②將平板轉(zhuǎn)約70°角，待接種環(huán)冷卻后，使接種環(huán)通過已劃線的1區(qū)5～7次，以后即不與1區(qū)接觸作連續(xù)密集劃線，約占平板面積的1/4，接種環(huán)再通過火焰滅菌。③再轉(zhuǎn)平板約70°，如上法在第3區(qū)劃線，此后接種環(huán)不再滅菌。④重復上述操作在第4區(qū)劃線，劃滿余下的培養(yǎng)基表面。將平板底放入蓋內(nèi)，接種環(huán)滅菌后放下，置37℃培養(yǎng)。-(2)分區(qū)劃線法。此法適用于含菌多的檢測標本，如糞便，喀痰、13實驗二染色鏡檢及五項指標試驗

-實驗二染色鏡檢及五項指標試驗-14革蘭氏染色方法涂片→干燥→固定→染色→鏡檢1．涂片：取一潔凈的載玻片，用記號筆在載玻片做好標記，并在載玻片中間滴一小滴生理..鹽水，以無菌接種環(huán)挑取少量菌體涂片，玻片要潔凈無油，否則菌液涂不開。

為防止細菌濺散污染環(huán)境，接種環(huán)滅菌前，須先將接種環(huán)靠近火焰或放內(nèi)焰中烤干，然后再在外焰中燒紅滅菌，殺死殘留的細菌。2．干燥：放空氣中自然干燥。如欲加速，也可把涂片置于火焰上部的熱氣層中烘烤，但切勿將涂膜烤焦。3．固定：用染色夾子夾住涂片，在火焰的最熱部分連續(xù)通過三次，以固定之。此時殺死大部分細菌，并使標本固定于玻片上，以免在染色或水洗過程中被沖掉。-革蘭氏染色方法涂片→干燥→固定→染色→鏡檢-154．染色：①初染:將結(jié)晶紫染液加于涂膜上，1min。②媒染:水洗后加蘆戈氏碘液處理，1min。③脫色：水洗后用95％乙醇脫色，并搖動玻片，直至流下的液體無色為止，約需0.5min。④復染：水洗后加石炭酸復紅稀釋液染色，1min。⑤水洗，用濾紙吸干，待標本充分干燥后進行鏡檢。5．鏡檢：干燥后，用油鏡觀察。判斷兩種菌體染色反應(yīng)性。菌體被染成藍紫色的是革蘭氏陽性菌（G+），被染成紅色的為革蘭氏陰性菌（G-）。以分散開的細菌的革蘭氏染色反應(yīng)為準，過于密集的細菌，常常呈假陽性。。

-4．染色：-16注意事項：酒精脫色是革蘭氏染色中的重要環(huán)節(jié)，如脫色過度，則革蘭氏陽性菌可能被誤染為革蘭氏陰性菌，如脫色不夠，則革蘭氏陰性菌可能被誤染為革蘭氏陽性菌，所以脫色時間要很好掌握。脫色時間的長短還受涂片厚薄的影響，一般涂片時取菌要少，涂片薄而均勻為好。被檢菌的培養(yǎng)條件、培養(yǎng)基成分、菌齡的不同等原因會影響染色結(jié)果，如革蘭氏陽性菌的陳舊培養(yǎng)物也有出現(xiàn)革蘭氏陰性的幾率，所以被檢菌的菌齡一般最好在18~24h之內(nèi)。-注意事項：酒精脫色是革蘭氏染色中的重要環(huán)節(jié)，如脫色過度，則革17革蘭氏染色方法操作步驟涂片生理鹽水接種環(huán)草酸銨結(jié)晶紫

碘液95%乙醇自然干燥媒染1min脫色0.5min固定初染1min復染1min干燥

鏡檢

復紅-革蘭氏染色方法操作步驟涂片生理接種環(huán)草酸銨結(jié)晶紫碘18銅綠假單胞菌鏡下形態(tài)圖示：--19氧化酶試驗原理：有氧呼吸過程中，氧化酵素（oxidase）于電子傳送系統(tǒng)扮演一重要角色，其可藉氧分子將已還原之細胞色素（reduced

cytochrome）氧化，產(chǎn)生水或過氧化氫。好氧菌與部份兼性厭氧菌及微好氧菌均具氧化酵素之作用，本實驗有助于區(qū)分奈瑟氏菌屬（Neisseria）、假單胞桿菌屬（Pseudomonas）此二屬為氧化酵素陽性(oxidase

positive)，與腸道桿菌科（Enterobacteriaceae）此科之細菌為氧化酵素陰性（oxidase

negative）。

方法：白色濾紙片取菌+1滴1%二甲基對苯二胺↓15~30s變紅色（+）不變色（-）-氧化酶試驗原理：有氧呼吸過程中，氧化酵素（oxidase）于20實驗三

結(jié)果觀察及報告

-實驗三結(jié)果觀察及報告-21綠膿菌素實驗：2~3個可疑菌落→綠膿菌素培養(yǎng)基→37℃24h→3~5mL氯仿→振蕩提取液呈藍色→取液體于一新試管+1mL1mol/L鹽酸上層鹽酸內(nèi)變?yōu)榧t色為陽性，不變色則為陰性。硝酸鹽還原產(chǎn)氣實驗：可疑菌落→硝酸鹽蛋白胨水→37℃24h→小倒管內(nèi)有氣體產(chǎn)生為陽性，否則陰性。-綠膿菌素實驗：2~3個可疑菌落→綠膿菌素培養(yǎng)基→37℃2422明膠液化實驗：可疑菌落→穿刺接種于明膠培養(yǎng)基→37℃24h→取出放冰箱10~30min呈溶解狀為陽性，不溶解則為陰性。42℃生長實驗：可疑菌落→普通瓊脂斜面→42℃24h→銅綠假單胞菌生長，而近似的熒光假單胞菌不能生長。-明膠液化實驗：可疑菌落→穿刺接種于明膠培養(yǎng)基→37℃2423結(jié)果判斷

氧化酶（+）綠膿菌素（+）可報告檢出

典型或可疑菌落氧化酶（+）綠膿菌素（-）

明膠液化（+）可報告檢出硝酸產(chǎn)氣（+）42℃生長（+）-結(jié)果判斷-24革蘭氏染色（Gramstaining）:革蘭氏染色法是由丹麥醫(yī)生Gram于1884年創(chuàng)立，其簡要操作分初染→媒染→脫色→復染。如果染色得當，鏡檢發(fā)現(xiàn)G+菌體呈藍紫色，G-菌體呈淺紅色。通過革蘭氏染色法可把所有細菌分兩在類。因此它是分類鑒定菌種的重要指標。其染色機制：通過初染和媒染操作后，在細菌細胞的膜或原生質(zhì)體上染上了不溶于水的結(jié)晶紫與碘的大分子復合物。

革蘭氏染色陽性（GramPositive）:革蘭氏陽性菌由于細胞壁厚、肽聚糖含量較高和其分子交聯(lián)度較緊密，故在用乙醇洗脫時，肽聚糖網(wǎng)孔會因脫水而明顯收縮，再加上它基本不含類脂，故用乙醇處理不能在壁上溶出縫隙，因此結(jié)晶紫與碘復合物仍牢牢阻留下其細胞壁內(nèi)，使其呈現(xiàn)藍紫色。革蘭氏染色陰性（GramNegative）:革蘭氏陰性細菌因其壁薄、肽聚糖含量低和交聯(lián)松散，故遇乙醇后，肽聚糖網(wǎng)孔不易收縮，加上它的類脂含量高，所以當乙醇把類脂溶解后，在細胞壁上就會出現(xiàn)較大的縫隙，這樣，結(jié)晶紫與碘的復合物就極易被溶出細胞壁，因此通過乙醇脫色后，細胞又呈無色。這時，再經(jīng)番紅等紅色染料進行復染，就使革蘭氏陰性獲得了淺紅色。-革蘭氏染色（Gramstaining）:革蘭氏染色25化妝品中銅綠假單胞菌（Pseudomonas

aeruginosa）

的檢測-化妝品中銅綠假單胞菌（Pseudomonas

aerugin26目的：

1.了解化妝品中銅綠假單胞菌檢測的基本過程。2.掌握幾種培養(yǎng)基的配置方法。3.掌握銅綠假單胞菌的鑒定及生化特征。原理：

銅綠假單胞菌為需氧及兼性厭氧的革蘭氏陰性桿菌，有鞭毛，在普通培養(yǎng)基上生長良好，菌落大小不一，平均直徑2mm～3mm，扁平，邊緣不整齊，且常呈相互融合狀態(tài)。氧化酶陽性，能產(chǎn)生綠膿菌素，此外還能液化明膠，還原硝酸鹽產(chǎn)生氮氣，在42℃條件下可以生長，可與類似菌區(qū)別。-目的：-27操作步驟

檢樣前化妝品的處理

接樣于營養(yǎng)肉湯增菌，37℃，12h，140rpm培養(yǎng)分離培養(yǎng)，挑取培養(yǎng)物接于十六烷基三甲基溴化銨平板，37℃，18-24h

染色鏡檢

配十六烷基三甲基溴化銨培養(yǎng)基（選擇性培養(yǎng)基，大腸桿菌不能生長，革蘭氏陽性菌生長完全受到抑制）配綠膿菌素測定用培養(yǎng)基，明膠培養(yǎng)基，硝酸鹽蛋白胨水培養(yǎng)基，普通瓊脂斜面培養(yǎng)基-操作步驟檢樣前化妝品的處理-28操作步驟特征性檢驗氧化酶綠膿菌素硝酸鹽還原明膠液化42℃生長試驗試驗產(chǎn)氣試驗試驗試驗取菌+1滴接菌，37℃接菌接菌接菌二甲基對24h+氯仿37℃24h37℃24h42℃24h苯二胺移出+鹽酸紫紅色（+）紫紅色（+）有氣體（+）溶解成液狀（+）生長（+）不變色（-）不變色（-）無氣體（-）未溶解（-）不生長（-）-操作步驟29實驗一培養(yǎng)基的制備及細菌的分離培養(yǎng)

-實驗一培養(yǎng)基的制備及細菌的分離培養(yǎng)-30實驗目的掌握培養(yǎng)基制備的原理和方法掌握細菌的分離培養(yǎng)了解滅菌方法-實驗目的掌握培養(yǎng)基制備的原理和方法-31實驗原理

不同的微生物生長繁殖都需要提供一定的營養(yǎng)條件，在實驗室中，微生物的營養(yǎng)是由培養(yǎng)基來提供的。培養(yǎng)基是按照微生物生長繁殖所需要的營養(yǎng)物質(zhì)，用人工方法配制而成的營養(yǎng)基質(zhì)。

除營養(yǎng)條件以外，微生物必須在最適酸堿度范圍內(nèi)才表現(xiàn)出最大生命力，因此，應(yīng)針對不同的微生物將培養(yǎng)基的pH值調(diào)節(jié)到適當范圍。

-實驗原理不同的微生物生長繁殖都需要提供一定的營養(yǎng)條件32操作步驟按培養(yǎng)基

配方稱量加水加

熱熔化調(diào)節(jié)

pH值分裝

包裝滅菌備用→-操作步驟按培養(yǎng)基

配方稱量加水加

熱熔化調(diào)節(jié)

pH值分裝

包33操作步驟1.綠膿菌素測定用培養(yǎng)基300ml加熱溶解調(diào)pH分裝試管高壓制成斜面2.明膠培養(yǎng)基300ml加熱溶解調(diào)pH分裝試管高壓直立制成高層3.硝酸鹽蛋白胨水培養(yǎng)基300ml加熱溶解調(diào)pH分裝有小倒管的試管高壓直立制成高層4.普通瓊脂斜面培養(yǎng)基300ml加熱溶解調(diào)pH分裝試管高壓制成斜面-操作步驟1.綠膿菌素測定用培養(yǎng)基300ml-34注意事項培養(yǎng)基溶解時，加有瓊脂的培養(yǎng)基易沸，應(yīng)注意看守。注意調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH。稱牛肉膏用玻片，稱甘油用小燒杯。加熱后應(yīng)補足液量。注意做好標記。-注意事項培養(yǎng)基溶解時，加有瓊脂的培養(yǎng)基易沸，應(yīng)注意看守。-35細菌的分離培養(yǎng)原理：通過劃線，將混雜的細菌在平板表面逐一分散，經(jīng)培養(yǎng)后，各自形成菌落(colony)。根據(jù)菌落形態(tài)、特征挑選單個菌落，移種培養(yǎng)后，即得到純種細菌。-細菌的分離培養(yǎng)原理：-36方法：平板劃線法有幾種，可根據(jù)不同情況選用其中一種。(1)平行劃線法此法適用于含菌不多的液體標本，如腦脊液(CSF)、腹水、分泌物、膿汁以及稀薄的菌液等。①左手斜持平板底，右手持接種環(huán)。接種環(huán)在火焰上滅菌，冷卻后，沾取一接種環(huán)標本，先在平板的一端涂開，并從此處開始向下劃密集的平行線，約占平板面積的一半。②將平板轉(zhuǎn)180°角，從平板另一端開始也劃密集的平行線，直到劃滿平板的剩余部分。將平板底放入蓋內(nèi)，接種環(huán)火焰滅菌后放下，將平板倒置，37℃培養(yǎng)。-方法：-37(2)分區(qū)劃線法。此法適用于含菌多的檢測標本，如糞便，喀痰、細菌固體培養(yǎng)物等。①劃線前的操作同平行劃線法。先在平板的一端將標本涂開并在平板的1/5～1/4面積上劃密集的平行線，接種環(huán)火焰滅菌。②將平板轉(zhuǎn)約70°角，待接種環(huán)冷卻后，使接種環(huán)通過已劃線的1區(qū)5～7次，以后即不與1區(qū)接觸作連續(xù)密集劃線，約占平板面積的1/4，接種環(huán)再通過火焰滅菌。③再轉(zhuǎn)平板約70°，如上法在第3區(qū)劃線，此后接種環(huán)不再滅菌。④重復上述操作在第4區(qū)劃線，劃滿余下的培養(yǎng)基表面。將平板底放入蓋內(nèi)，接種環(huán)滅菌后放下，置37℃培養(yǎng)。-(2)分區(qū)劃線法。此法適用于含菌多的檢測標本，如糞便，喀痰、38實驗二染色鏡檢及五項指標試驗

-實驗二染色鏡檢及五項指標試驗-39革蘭氏染色方法涂片→干燥→固定→染色→鏡檢1．涂片：取一潔凈的載玻片，用記號筆在載玻片做好標記，并在載玻片中間滴一小滴生理..鹽水，以無菌接種環(huán)挑取少量菌體涂片，玻片要潔凈無油，否則菌液涂不開。

為防止細菌濺散污染環(huán)境，接種環(huán)滅菌前，須先將接種環(huán)靠近火焰或放內(nèi)焰中烤干，然后再在外焰中燒紅滅菌，殺死殘留的細菌。2．干燥：放空氣中自然干燥。如欲加速，也可把涂片置于火焰上部的熱氣層中烘烤，但切勿將涂膜烤焦。3．固定：用染色夾子夾住涂片，在火焰的最熱部分連續(xù)通過三次，以固定之。此時殺死大部分細菌，并使標本固定于玻片上，以免在染色或水洗過程中被沖掉。-革蘭氏染色方法涂片→干燥→固定→染色→鏡檢-404．染色：①初染:將結(jié)晶紫染液加于涂膜上，1min。②媒染:水洗后加蘆戈氏碘液處理，1min。③脫色：水洗后用95％乙醇脫色，并搖動玻片，直至流下的液體無色為止，約需0.5min。④復染：水洗后加石炭酸復紅稀釋液染色，1min。⑤水洗，用濾紙吸干，待標本充分干燥后進行鏡檢。5．鏡檢：干燥后，用油鏡觀察。判斷兩種菌體染色反應(yīng)性。菌體被染成藍紫色的是革蘭氏陽性菌（G+），被染成紅色的為革蘭氏陰性菌（G-）。以分散開的細菌的革蘭氏染色反應(yīng)為準，過于密集的細菌，常常呈假陽性。。

-4．染色：-41注意事項：酒精脫色是革蘭氏染色中的重要環(huán)節(jié)，如脫色過度，則革蘭氏陽性菌可能被誤染為革蘭氏陰性菌，如脫色不夠，則革蘭氏陰性菌可能被誤染為革蘭氏陽性菌，所以脫色時間要很好掌握。脫色時間的長短還受涂片厚薄的影響，一般涂片時取菌要少，涂片薄而均勻為好。被檢菌的培養(yǎng)條件、培養(yǎng)基成分、菌齡的不同等原因會影響染色結(jié)果，如革蘭氏陽性菌的陳舊培養(yǎng)物也有出現(xiàn)革蘭氏陰性的幾率，所以被檢菌的菌齡一般最好在18~24h之內(nèi)。-注意事項：酒精脫色是革蘭氏染色中的重要環(huán)節(jié)，如脫色過度，則革42革蘭氏染色方法操作步驟涂片生理鹽水接種環(huán)草酸銨結(jié)晶紫

碘液95%乙醇自然干燥媒染1min脫色0.5min固定初染1min復染1min干燥

鏡檢

復紅-革蘭氏染色方法操作步驟涂片生理接種環(huán)草酸銨結(jié)晶紫碘43銅綠假單胞菌鏡下形態(tài)圖示：--44氧化酶試驗原理：有氧呼吸過程中，氧化酵素（oxidase）于電子傳送系統(tǒng)扮演一重要角色，其可藉氧分子將已還原之細胞色素（reduced

cytochrome）氧化，產(chǎn)生水或過氧化氫。好氧菌與部份兼性厭氧菌及微好氧菌均具氧化酵素之作用，本實驗有助于區(qū)分奈瑟氏菌屬（Neisseria）、假單胞桿菌屬（Pseudomonas）此二屬為氧化酵素陽性(oxidase

positive)，與腸道桿菌科（Enterobacteriaceae）此科之細菌為氧化酵素陰性（oxidase

negative）。

方法：白色濾紙片取菌+1滴1%二甲基對苯二胺↓15~30s變紅色（+）不變色（-）-氧化酶試驗原理：有氧呼吸過程中，氧化酵素（oxidase）于45實驗三

結(jié)果觀察及報告

-實驗三結(jié)果觀察及報告-46綠膿菌素實驗：2~3個可疑菌落→綠膿菌素培養(yǎng)基→37℃24h→3~5mL氯仿→振蕩提取液呈藍色→取液體于一新試管+1mL1mol/L鹽酸上層鹽酸內(nèi)變?yōu)榧t色為陽性，不變色則為陰性。硝酸鹽還原產(chǎn)氣實驗：可疑菌落→硝酸鹽蛋白胨水→37℃24h→小倒管內(nèi)有氣體產(chǎn)生為陽性，否則陰性。-綠膿菌素實驗：2~3個可疑菌落→