肺癌課件含31日日下午內(nèi)科

技術(shù)平臺(tái)對(duì)比肺癌少見(jiàn)靶點(diǎn)的診療應(yīng)用其他癌種少見(jiàn)靶點(diǎn)的診療應(yīng)用與展望組織病理H&EIHC細(xì)胞學(xué)經(jīng)典分子FISHPCRSanger高通量分子NGS?液態(tài)活檢NGSddPCRCTCARMS-PCR現(xiàn)行的化醫(yī)學(xué)（基于靶標(biāo)的治療V1.0）基于單

的分子檢測(cè)，為每個(gè) 選擇特異性藥物發(fā)展的化醫(yī)學(xué)（基于靶標(biāo)的治療V2.0）：以具有高靈敏度和通量的

多重分子檢測(cè)，為每個(gè)選擇有效的藥物將來(lái)的化醫(yī)學(xué)（基于靶標(biāo)的治療V3.0）：以源于高通量下一代的整合 組圖譜，為每個(gè) 定制治療策略原理：將待檢測(cè)DNA樣本的某一個(gè)片段的堿基逐一精確檢測(cè)，然后與已知的標(biāo)準(zhǔn)樣本序列比較，尋找突變，發(fā)現(xiàn)突變與疾病(或能力、特點(diǎn))的關(guān)系。準(zhǔn)確率高，當(dāng)前的金標(biāo)準(zhǔn)2005年至今，大規(guī)模平儀代表公司Illumina及Thermo

Fisher序，實(shí)現(xiàn)一次可對(duì)多個(gè)樣本完成多個(gè) 所有位點(diǎn)的檢測(cè)；定量功能，更利于動(dòng)態(tài) （復(fù)發(fā)/療效）；靈敏度高，適用于起始濃度很低的樣本（液態(tài)活檢）。NGS熱點(diǎn)1熱點(diǎn)2熱點(diǎn)3熱點(diǎn)4定量報(bào)告等位

突變頻率，反映不同亞克隆的比例關(guān)系；NGS可分辨分子順式/分子反式，明確突變與診療的正確相關(guān)性；C797S，是最早發(fā)現(xiàn)的AZD9291的耐藥位點(diǎn)，如單個(gè)C797S突變，則對(duì)一代TKI敏感。NGS發(fā)現(xiàn)：當(dāng)與T790M以incis（順式）存在，對(duì)一代、三代TKI單用或聯(lián)用均耐藥；當(dāng)以in

trans（反式）的形式存在，一代三代TKI聯(lián)用可抑制腫瘤進(jìn)展。NGS同時(shí)檢測(cè)已知&未知突變，相比PCR法，它檢測(cè)的覆蓋面更廣，可系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)潛在的驅(qū)動(dòng)

。檢測(cè)PCR法K.S.

Thress,

et

al.

Nat

Med,

2015.

21(6):

p.

560-562.*PacBio

SMRT原理代表公司Pacific

Bioscience，以SMRT

專(zhuān)利技術(shù)為

載體。2016年12月初，BioRxiv（生命科學(xué)預(yù)印本網(wǎng)）發(fā)布，技術(shù)確診一種罕見(jiàn)遺傳病。克服，而未能檢測(cè)到的致病性大片段首次利用第三代了此前使用二代缺失突變。缺點(diǎn)：

錯(cuò)誤率較高達(dá)15%，樣本 要求高，臨床應(yīng)用少。優(yōu)點(diǎn)：快速；便捷；價(jià)格優(yōu)勢(shì)缺點(diǎn)：錯(cuò)誤率高，開(kāi)放數(shù)據(jù)少。僅處于內(nèi)測(cè)階段，未投入臨床技術(shù)代表技術(shù)通量

時(shí)間優(yōu)勢(shì)缺點(diǎn)

應(yīng)用第一代DNA氧鏈終止法）為

低代表1977年

1）準(zhǔn)確率高2）讀長(zhǎng)較NGS長(zhǎng)1000

bp左右。時(shí)間太長(zhǎng)基于PCR反應(yīng)的局限性。靈敏度不高。1.一個(gè)反應(yīng)所

列不能太長(zhǎng)，目前

微生物鑒定；分型；其他平臺(tái) 結(jié)果驗(yàn)證。第二代（NGS）邊

邊

；

高1）大規(guī)模平

序2）定量4）靈敏度高，適用于起始濃度很低的樣本（液態(tài)活檢）1）錯(cuò)誤率較Sanger

高；2）樣本建庫(kù)流程繁瑣；過(guò)后續(xù)加深

糾正；

4）數(shù)據(jù)量大，對(duì)后續(xù)數(shù)據(jù)的拼接、生物信息學(xué)分析要求極高臨床：NIPT、2005年

3）比

Sanger技術(shù)成本低廉。

3）多次PCR存在系統(tǒng)誤差，無(wú)法通

腫瘤/罕見(jiàn)病，液態(tài)活檢等。第三代

單分子讀長(zhǎng)長(zhǎng)單分子

，無(wú)需建庫(kù)、模板擴(kuò)增，保留樣本最原始的信息。低-中

2008年

3）

同時(shí)可檢測(cè)堿基修飾的情況，如甲基化、乙酰化等。4）可以做全轉(zhuǎn)錄本的

，分析可變剪切。機(jī)樣本的濃度要求較高；目前臨床應(yīng)用的實(shí)例較少；無(wú)法表達(dá)定量1）由于建庫(kù)無(wú)需PCR，因此對(duì)于上

科研：全組

、轉(zhuǎn)錄組

、

/微生物

組 、宏組第四代？第三代！納米孔低快速、便捷、價(jià)格優(yōu)勢(shì)，目2014年

前最大的賣(mài)點(diǎn)是設(shè)備便宜。錯(cuò)誤率高現(xiàn)有開(kāi)放的數(shù)據(jù)僅僅是基于微生物或者擬南芥等小

組的數(shù)據(jù)。3）目前均屬于在內(nèi)測(cè)階段，還沒(méi)有商品化的設(shè)備銷(xiāo)售。技術(shù)平臺(tái)對(duì)比肺癌少見(jiàn)靶點(diǎn)的診療應(yīng)用其他癌種少見(jiàn)靶點(diǎn)的診療應(yīng)用與展望的突變類(lèi)型多種多樣，單位點(diǎn)檢測(cè)漏掉大量信息突變類(lèi)型現(xiàn)常用檢測(cè)方法單堿基突變（KRAS

G12D）PCR+小范圍堿基缺失/（KIT

V559del）PCR+大范圍堿基缺失/（EGFR

19外顯子）ARMS

PCR擴(kuò)增/表達(dá)變化（ERBB2/HER2擴(kuò)增）熒光定量PCR,FISH融合（EML4-ALK融合）FISH高通量 可一次檢測(cè)以上列舉的所有突變類(lèi)型人類(lèi) 組結(jié)構(gòu)變化示圖：突變類(lèi)型多種多樣肺癌分子信號(hào)傳導(dǎo)通路：酪氨酸激酶受體激活；RAS-RAF通路；PI3K-AKT-MTOR通路；These

frequencies

are

a

combination

of

data

from

theLung

Cancer

Mutation

nd

frequencieslistedinShea

Met

al.

TherAdv

Respir

Dis

2016;10:113-129.Kobayashi

Y,Mitsudomi

T:[J].Cancer

Science,

2016,

107(9):1179-1186.罕見(jiàn)的EGFR-19Del可能會(huì)造成PCR方法假

。ALK等熱點(diǎn)的非常見(jiàn)融合方式。約3/4ALK融合為經(jīng)典的EML4-ALK融合，但有1/4為與其他 的融合，包括：STRN-ALKCATSPERB-ALKACVR1-ALKCLIP1-ALKDPH6-AS1-ALKKIF5B-ALKRP11-320M2.1-ALKUGP2-ALKV1

49.6%V3a/b25.6%V210%作為最常見(jiàn)的EML4-ALK融合，其融合變異體還有多種，包括V1，V2，V3a/b等，其中V1-3變異體所占比例最多，除了EML4外，ALK還有其他的融合伙伴

。The

captured

DNA

was

then

sequenced

on

HiSeq

2000

sequencer

(Illumina,San

Diego,CA)for

paired

100

bp

read.

The

next

generation

sequenceysis

revealed

a

new

ALK

partner

gene。一名45歲吸煙女性患者，胸部CT發(fā)現(xiàn)左側(cè)肺部有3.1cmx3.4cm的腫物及縱膈淋 腫大，伴雙側(cè)胸腔積液。對(duì)患者進(jìn)行淋 活檢，病理結(jié)果顯示：淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 癌， 于肺。分子病理檢測(cè)結(jié)果顯示：EGFR和KRAS 突變均，F(xiàn)ISH檢測(cè)EML4-ALK融合。但該患者的免疫組化（VentanaD5F3）檢測(cè)顯示ALK陽(yáng)性。Shan

L,

et

al.[J].

JTO

Official

Publication

of

the

International

Association

for

the

Study

of

LC

,

2015,

10(6):37-9.C，E：crizotinib的啟動(dòng)前CT掃描的縱隔淋和胸腔前D，F(xiàn)：Crizotinib治療1個(gè)月治療后；G：Crizotinib治療3個(gè)月后Shan

L,

et

al.[J].

JTO

Official

Publication

of

the

International

Association

for

the

Study

of

LC

,

2015,

10(6):37-9.BIRC6-ALKALKALKVi

B,

The

Evolutionof

Therapies

in

NSCLC.

Cancers

2015,7,1815-1846.RTKGEFGDPGTPNF-1PIK3CARAFNF1作為腫瘤抑制因子，通過(guò)催化

RAS-GTP變成RAS-GDP，抑制RAS的活性；因此缺失NF1的細(xì)胞有高水平的RAS活性，主要通過(guò)MAPK通路來(lái)傳導(dǎo)信號(hào)種系NF1突變可導(dǎo)致多發(fā)性神經(jīng)纖維瘤(Neurofibromatosis)發(fā)生，從而增加全身多腫瘤發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，包括神經(jīng)膠質(zhì)瘤、惡性外周神經(jīng)鞘瘤、幼年型粒單核細(xì)胞白血病、胃腸道間皮瘤、血管球瘤等J

Clin

Oncol

33,2015(suppl;

abstr

8022)頻率

~10%

(60/591)主要的組織學(xué)類(lèi)型

(63%)>

鱗癌(18%)臨床特點(diǎn) 在吸煙/曾經(jīng)吸煙人群中更常見(jiàn)臨床檢測(cè)方法很難檢測(cè)NF1突變，因?yàn)楦咄?/p>

；傳統(tǒng)的NF1的任何位點(diǎn)都可以發(fā)生突變(位點(diǎn)分散在整個(gè))，突變類(lèi)型包括錯(cuò)義突變、無(wú)義突變、移碼突變和剪切突變共發(fā)生的驅(qū)動(dòng)突變25%NF1突變腫瘤同時(shí)有MAPK通路的其它突變(RAS家族或BRAF)；75%不含其他MAPK通路驅(qū)動(dòng)突變臨床意義

EGFR-TKI耐藥未來(lái)方向

MAPK通路抑制劑在NF1突變腫瘤中有較好前景尼臨床I期試驗(yàn)，叢狀神經(jīng)纖維瘤患者服用 尼，11／18腫瘤有縮小J

Clin

Oncol

33,2015(suppl;

abstr

8022)J

Clin

Oncol

32:5s,2014

(suppl;

abstr

10018)BRAF抑制劑響應(yīng)ALL

Patients(N=35)V600E

and

VemurafenibSubgroup(N=25)Data

missing11Notmeasurable1(3%)1(4%)CR2(6%)2(8%)PR16(47%)11(46%)SD11(32%)10(42%)PD4(12%)0ORR18(53%;95%CI:35-70)13(54%;95%CI:33-74)DCR29(85%;95%CI:69-95)23(96%;95%CI:79-100)CR,

complete

response;

PR,

partial

response;

SD,

stable

disease;

PD,progressivedisease;

ORR.

Overall

response

rate;

DCR,

disease

control

rate;

CI,

confidenceinterval備注：BRAF還存在許多罕見(jiàn)的點(diǎn)激活突變，NGS可檢出。J

Thorac

Oncol.

2015;10:

1451–14576318/平均男／女

從未吸煙者法國(guó)德國(guó)荷蘭

奧地利之前未接受治療1512BRAF突變肺癌患者中突變頻率1-3%，對(duì)有較好的應(yīng)答ALKALKVi

B,

The

Evolutionof

Therapies

in

NSCLC.

Cancers

2015,7,1815-1846.Cancer

Discov.

2015

Dec;5(12):1262-70CC223研究獲得一年SDMLN0128研究再次SD技術(shù)平臺(tái)對(duì)比肺癌少見(jiàn)靶點(diǎn)的診療應(yīng)用其他癌種少見(jiàn)靶點(diǎn)的診療應(yīng)用與展望Tarra

Evans,

J

Natl

Compr

Canc

Netw

2016;14(9):1165–1173兩項(xiàng)三期前瞻性研究運(yùn)用NGS技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，HER2+晚期 患者PIK3CA突變、PTEN缺失，針對(duì)該類(lèi)型患者，依維莫司、曲妥珠單抗聯(lián)合化療，可以提高患者的無(wú)進(jìn)展生存期。Fabrice

Andre，J

Clin

Oncol

34:2115-2124.Daniel

H.Cancer

2016;122:3657-66技術(shù)平臺(tái)對(duì)比肺癌少見(jiàn)靶點(diǎn)的診療應(yīng)用其他癌種少見(jiàn)靶點(diǎn)的診療應(yīng)用與展望技術(shù)本身應(yīng)用上系統(tǒng)誤差建庫(kù)/讀長(zhǎng)短數(shù)據(jù)分析NGS本質(zhì)上還是PCR，在建庫(kù)過(guò)程中需要被擴(kuò)增上千次，因此樣本中

的量的線(xiàn)性關(guān)系會(huì)有偏差，特別在ctDNA中檢測(cè)copy-number

gain存在缺陷，步驟復(fù)雜，專(zhuān)業(yè)

素養(yǎng)要求高；之深，海量數(shù)據(jù)，如何爭(zhēng)取判讀，降低假陽(yáng)性&假

；由于

讀長(zhǎng)短，數(shù)據(jù)量大，對(duì)后續(xù)數(shù)據(jù)的拼接、生物信息學(xué)分析要求高，龐大的生物數(shù)據(jù)處理難度極高，尚無(wú)標(biāo)準(zhǔn)化流程。技術(shù)復(fù)雜推廣普及

，基于統(tǒng)計(jì)學(xué)原理篩查的變異需要臨床科研大數(shù)據(jù)的驗(yàn)證數(shù)據(jù)庫(kù)臨床目前參考和

CBI等歐美數(shù)據(jù)庫(kù)，缺乏標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)，臨床意義功能不明、無(wú)方可用，檢出意義不明確：2016年《新英格蘭雜志》稱(chēng)：經(jīng)過(guò)

大概有30％－50％的

能找到可以解釋腫瘤惡變的相關(guān)突變；因?yàn)槟苡玫乃幬镉邢?，只?％－13％的能夠找到“精準(zhǔn)”的藥物；即使使用上了配對(duì)的藥物，也只有30％的

有療效。100人

，最后僅僅2.7-19.5人獲益；型與疾病關(guān)系基礎(chǔ)研究發(fā)展

，制約

的應(yīng)用范圍的拓寬；臨床前必須建立嚴(yán)格的數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)價(jià)體系和數(shù)據(jù)分析流程；建立

的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)；隱私及

封信廣泛的分子檢測(cè)系統(tǒng)，如NGS，可檢測(cè)一組基因突變和重排，若該平臺(tái)被驗(yàn)證并確認(rèn)的話(huà)；與其他任何技術(shù)一樣，NGS平臺(tái)也同樣需要質(zhì)量控制，這一點(diǎn)很重要；由于它是依賴(lài)引物的，所以組合及所檢測(cè)的變異依賴(lài)于NGS平臺(tái)的設(shè)計(jì)；例如，一些NGS平臺(tái)可檢測(cè)突變和重排，以及拷貝數(shù)變異，但并非所有NGS平臺(tái)的結(jié)果都是一致的，無(wú)論是商品化的還是檢測(cè)機(jī)構(gòu)自己開(kāi)發(fā)的。2015年7月，歐盟發(fā)布指南并刊登于《Nature》子刊。指南對(duì)六個(gè)方向做了38個(gè)

。最大更新為

NGS

測(cè)試的“評(píng)價(jià)系統(tǒng)”，確保樣品的質(zhì)量，規(guī)范多項(xiàng)參數(shù)有關(guān)，包括數(shù)據(jù)的產(chǎn)量、PCR拷貝和覆蓋的比例。/臨床的效用NGS目前發(fā)展水平知情同意書(shū)及對(duì)患者和醫(yī)生報(bào)告驗(yàn)證研究與 之間的區(qū)別Guidelines-for-diagnostic-next-generation-sequencing2016年4月，《二代

（NGS）技術(shù)應(yīng)用于臨床腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)學(xué) 的共識(shí)》。應(yīng)將NGS視為多步驟的由CSCO及CAGC聯(lián)合發(fā)布，分為9部分36項(xiàng)系統(tǒng)工程。NGS技術(shù)質(zhì)量需求腫瘤相關(guān)NGS檢測(cè)內(nèi)容樣本處理流程CAGC

POI項(xiàng)目NGS測(cè)試數(shù)據(jù)管理信息學(xué)分析結(jié)果報(bào)告解釋和咨詢(xún)以及知情同意書(shū)NGS用于研究與診斷的區(qū)別NGS檢測(cè)的標(biāo)本處理不同類(lèi)型生物材料的收集及處理均應(yīng)

有明確的標(biāo)準(zhǔn)操作流程（SOP）指導(dǎo)。樣本需要有唯一性的標(biāo)示；適于NGS檢測(cè)的組織標(biāo)本中腫瘤細(xì)胞含量建議應(yīng)達(dá)到20%以上，組織樣本抽提獲得的DNA量應(yīng)達(dá)到50ng