生物制品制造工藝2課件

生物制藥工藝學

教學課件生物工程教研室劉靜霆生物制藥工藝學

教學課件生物工程教研室第五章生物制品制造工藝生物工程教研室劉靜霆

第五章生物制品制造工藝生物工程教研室§1生物制品的基本概念§2疫苗和菌苗§3DNA重組藥物§4基因治療與基因藥物§1生物制品的基本概念§3

DNA重組藥物一、重組DNA技術與基因工程的基本定義二、基本過程三、重組藥物的分離純化四、質量控制五、重要的重組DNA藥物§3DNA重組藥物一、重組DNA技術與基因工程的基本定§3DNA重組藥物一、重組DNA技術與基因工程的基本定義重組DNA技術是指將一種生物體（供體）的基因與載體在體外進行拼接重組，然后轉入另一種生物體（受體）內，使之按照人們的意愿穩(wěn)定遺傳并表達出新產物或新性狀的DNA體外操作程序，也稱為分子克隆技術。因此，供體、受體、載體是重組DNA技術的三大基本元件。§3DNA重組藥物一、重組DNA技術與基因工程的基本定義§3DNA重組藥物基因工程是指重組DNA技術的產業(yè)化設計與應用，包括上游技術和下游技術兩大組成部分。上游技術指的是基因重組、克隆和表達的設計與構建（即重組DNA技術）；而下游則涉及到基因工程菌或細胞的大規(guī)模培養(yǎng)以及基因產物的分離純化過程?！?DNA重組藥物基因工程是指重組DNA技術的產業(yè)化設計優(yōu)點：1、可大量生產過去難以獲得的生理活性蛋白和多肽；去除內源性物質的不足之處2、提供足夠數(shù)量的生理活性物質，以進行生理生化、結構的研究3、利用基因工程技術可發(fā)現(xiàn)、挖掘更多內源性生理活性物質4、獲得新型化合物優(yōu)點：基因工程藥物是指應用基因工程或蛋白質工程技術制造的重組活性多肽、蛋白質及其修飾物。（1）重組細胞因子類：如IFN、IL、TNF；（2）重組生長因子類：如EGF、NGF以及促進造血系統(tǒng)的生長因子（EPO、CSF）；（3）重組多肽與蛋白質類激素：如重組人胰島素、重組人生長激素（rhGH）等；（4）心血管病治療劑及酶制劑：如水蛭素、tPA（組織纖溶酶原激活物）、天冬酰胺酶、SOD等。（5）重組疫苗及單抗制品：如重組乙肝表面抗原疫苗（酵母）、腫瘤疫苗等?；蚬こ趟幬锸侵笐没蚬こ袒虻鞍踪|工程技術制造的重組活性多主要基因工程產品的研制、開發(fā)、上市時間產品人生長激素釋放抑制素（SRM)人胰島素首次克隆表達時間國家用途首次進入市場時間國家/地區(qū)1977日本治療巨人癥1978美國治療糖尿病1982歐洲人生長激素（HGH)1979美國治療侏儒癥1985美國人α干擾素（α－IFN)1980美國治療病毒感染癥1985美國乙肝疫苗1983美國預防乙型肝炎1986歐洲人白細胞介素－21984日本治療腫瘤1989歐洲人促紅細胞生成素治療貧血1988歐洲人粒細胞集落刺激因子治療中性白細胞減少癥1991美國人組織纖溶酶原激活劑（t-PA)治療血栓癥1987美國主要基因工程產品的研制、開發(fā)、上市時間產品人生長激素釋放抑制DNA重組藥物制造的主要步驟獲得目的基因DNA的體外重組（切與連）載體的選擇受體細胞的選擇重組DNA分子轉化（轉）轉化子的篩選與鑒定（選）外源基因的大規(guī)模表達和分離純化產品的檢驗和制劑制備DNA重組藥物制造的主要步驟獲得目的基因DNA的體外重組（切第五章-生物制品制造工藝2課件二、基本過程上游階段：實驗室獲得目的基因、酶切和酶連、插入適當載體、轉入宿主細胞、復制、目的基因分析確證、表達、篩選合適表達系統(tǒng)等下游階段：將實驗室成果產業(yè)化發(fā)酵參數(shù)確定、新型生物反應器研制、高效分離介質及裝置開發(fā)、生物傳感器設計制造、電子計算機優(yōu)化控制、產品質量控制注意：上游DNA重組的設計必須以簡化下游操作工藝和裝備為指導思想；而下游過程則是上游基因重組藍圖的體現(xiàn)和保證，這是基因工程產業(yè)化的基本原則。二、基本過程上游階段：實驗室注意：上游DNA重組的設計必須1、目的基因的獲得1）鳥槍法（基因文庫）基因組DNA提取→限制性內切酶部分水解→與載體連接→轉化、擴增與篩選2）逆轉錄法（cDNA文庫）

mRNA純化→cDNA第一合成→第二鏈合成→cDNA克隆→將重組體導入宿主細胞→cDNA文庫鑒定→目的cDNA克隆的分離和鑒定3）合成法4）PCR法1、目的基因的獲得1）鳥槍法（基因文庫）2、基因表達1）選擇宿主細胞

原核

大腸桿菌：生長快；遺傳研究深入；產品多為胞內（包含體）或周質中；不能糖基化修飾。需注意內毒素污染。

枯草芽孢桿菌：分泌力強，不形成包含體；不修飾；胞外酶可能會降解產物

鏈霉菌：分泌能力強；不致病，安全；有糖基化能力。2、基因表達1）選擇宿主細胞真核酵母：研究基因表達調控最有效的單細胞真核微生物；基因組小，僅為大腸桿菌4倍；傳代時間短；無毒；有分泌功能和修飾功能；已用于干擾素、乙肝表面抗原等重組DNA藥物的生產。絲狀真菌：有很強的蛋白質分泌能力，能正確加工，糖基化方式與高等生物相似，有成熟發(fā)酵和后處理工藝哺乳動物細胞：類似天然產物，但培養(yǎng)條件苛刻真核大腸桿菌與真核細胞表達系統(tǒng)比較大腸桿菌:

發(fā)酵包含體復性純化目的蛋白真核細胞:發(fā)酵上清液純化目的蛋白大腸桿菌與真核細胞表達系統(tǒng)比較大腸桿菌:大腸桿菌表達的重組蛋白易形成包含體

高效表達的目的蛋白在大腸桿菌內形成大量無活性包含體。因無法有效的解決復性問題，在美國每年造成的經濟損失就達幾十億美元

包含體電鏡圖大腸桿菌表達的重組蛋白易形成包含體高效表達的目的蛋白包含體用大腸桿菌做宿主生產基因工程藥物必須克服的6個困難：1)原核基因表達產物為胞內表達，必須破胞分離，受胞內其他蛋白干擾，純化困難；2)原核基因表達產物在胞內多為不溶性包含體，必經過變性、復性處理來恢復藥物蛋白生物學活性工藝復雜；3)沒有翻譯后的加工機制，如糖基化，應用上受到限制；4)產物的第一個氨基酸必是甲酰甲硫氨酸，因無加工機制，常造成N-甲硫氨酸冗余，作為藥物易引起免疫反應；5)細菌的內毒素不易清除；6)細菌的蛋白酶常把外源基因的表達產物消化用大腸桿菌做宿主生產基因工程藥物必須克服的6個困難：1)原核蛋白質復性概念將蛋白質從結構不規(guī)則、無活性的狀態(tài)，恢復到有唯一立體結構、有生物活性的狀態(tài)的過程稱為蛋白質復性。蛋白質復性概念將蛋白質從結構不規(guī)則、無2）表達載體要求：a、能獨立復制b、有靈活的多克隆位點和方便的篩選標記c、具有有效運載外源基因的能力，能攜帶大小不同的外源基因d、容易控制，在細胞內穩(wěn)定性高，安全可靠。2）表達載體如大腸桿菌的pBV220系統(tǒng)，為溫度誘導表達載體，已成功用于IL-2，IL-3，IFN等pET系統(tǒng)，最有潛力的系統(tǒng)，可用乳糖代替IPTG（異丙基硫代-β-D-半乳糖），產物可達細胞總蛋白20~30%，表達量可達總蛋白50%。第五章-生物制品制造工藝2課件

3）構建工程菌目的基因與載體DNA的連接重組DNA向宿主細胞內轉移篩選與鑒定帶有目的基因的陽性克隆影響目的基因表達的因素3）構建工程菌三、重組藥物的分離純化

A重組蛋白分離純化方法選擇的基本原則◎針對不用的產物表達形式采取不同的策略◎針對不同性質的重組蛋白選擇不同的層析類型◎多種分離純化技術的聯(lián)合運用◎合適分離純化介質的選擇◎分離純化過程的規(guī)?；?、重組藥物的分離純化A重組蛋白分離純化方法選擇的基本原則◎針對不同的產物表達形式采取不同的策略采用分泌型戰(zhàn)略表達重組蛋白，通常體積大、濃度低，因此應在純化之前采用沉淀或超濾等方法先進行濃縮處理；采用包涵體型戰(zhàn)略表達重組蛋白，應先離心回收包涵體；采用融合型戰(zhàn)略表達重組蛋白，一般是胞內可溶性的，擬首先選用親和層析進行純化表達在細胞膜和細胞壁之間的間隙中的蛋白質，應用低濃度的溶菌酶處理，然后再用滲透壓休克法釋放重組蛋白?！蜥槍Σ煌漠a物表達形式采取不同的策略◎針對不同性質的重組蛋白選擇不同的層析類型

等電點處于極端區(qū)域（大于8或小于5）的重組蛋白應首選離子交換法進行分離，這樣很容易除去幾乎所有的雜蛋白；重組蛋白特異性的配體、底物、抗體、糖鏈等都是首選親和層析純化方法的重要條件，原則是它們與目標蛋白之間的解離常數(shù)應在合適的范圍內（10－8～10－4mol/L）;

疏水層析和反相層析是根據(jù)蛋白質的疏水性差異進行分離的；

凝膠過濾層析是根據(jù)蛋白的分子量和體積差異進行分離的；

徑向層析是近年來發(fā)展起來的集層析分離和膜分離于一體的一種復合技術，在流量、負荷量等參數(shù)方面顯示出極大的優(yōu)越性?！蜥槍Σ煌再|的重組蛋白選擇不同的層析類型§3DNA重組藥物◎多種分離純化技術的聯(lián)合運用在進行重組蛋白的純化時，通常需要綜合使用多種技術，一般來說，在選擇分離純化方法時應遵循下列原則：＃應選擇不同分離純化機理的方法聯(lián)合使用＃應首先選擇能除去含量最多雜質的方法＃應盡量選擇高效的分離方法＃應將最費時、成本最高的分離純化方法安排在最后階段§3DNA重組藥物◎多種分離純化技術的聯(lián)合運用◎合適分離純化介質的選擇常用的蛋白質分離純化介質有Sephadex和Sepharose。理想的分離純化介質應具有下列性質：＃對目標蛋白具有較高的分辨效率＃對目標蛋白不會造成變性?；瘜W性能和機械性能穩(wěn)定，重復性好＃價格低廉◎合適分離純化介質的選擇◎分離純化過程的規(guī)?；鞍踪|分離純化的實驗室工藝、技術、方法在大規(guī)模產業(yè)化過程未必合適，如：＃實驗室方法在工程上可能難以實現(xiàn)（超聲波破細胞壁）＃實驗室方法在大規(guī)模生產中可能成本過高（超速離心）因此，在很多情況下，實驗室的技術路線不等于生產工藝。◎分離純化過程的規(guī)模化四、質量控制

1、原材料質量控制

2、培養(yǎng)過程質量控制3、純化工藝質量控制

4、目標產品質量控制

四、質量控制

1、原材料質量控制保證編碼DNA序列正確要了解以下特性：A、目的基因來源、克隆過程、序列B、表達載體名稱、結構、遺傳特性及酶切圖譜、抗生素標記等C、宿主名稱、來源、傳代歷史、檢定結果及生物學特征D、載體引入宿主方式、及載體在宿主中狀態(tài)E、插入基因于表達載體兩側控制區(qū)核酸序列F、啟動和控制克隆基因表達的方法及水平保證編碼DNA序列正確種子克隆純而且穩(wěn)定，在培養(yǎng)工程中工程菌不應出現(xiàn)無突變或質粒丟失的現(xiàn)象種子批系統(tǒng)工作細胞庫種子克隆純而且穩(wěn)定，在培養(yǎng)工程中工程菌不應出現(xiàn)無突變或質粒丟§3DNA重組藥物盡量去除污染病毒、核酸、宿主細胞雜蛋白等雜質，并避免在純化過程帶入有害物質純化每一步應測定純度、計算提純倍數(shù)、收率等等§3DNA重組藥物盡量去除污染病毒、核酸、宿主細胞雜蛋白1）、產品的鑒別氨基酸組成分析：肽圖分析：N末端和C末端氨基酸測序：蛋白質二硫鍵的分析：重組蛋白相對分子量：等電點的測定：2）、純度分析：SDS,CE,IEF,HPLC3）、生物活性測定4）、殘余雜質檢測宿主細胞蛋白含量、宿主細胞DNA、殘余抗生素等5）、安全性檢測無菌實驗、熱原實驗、毒性實驗、免疫原性檢查1）、產品的鑒別A體內生物學活性測定方法生物學模型生長激素大鼠腦垂體B體外生物學活性測定方法如：MTT法:MTTformazan(藍紫色)干擾素類蛋白：可用細胞毒抑制試驗來測定干擾素的體外活性。琥珀酸脫氫酶A體內生物學活性測定方法琥珀酸脫氫酶五、重要的重組DNA藥物（一）利用重組大腸桿菌生產醫(yī)用蛋白或多肽代表產品：重組人胰島素、重組人生長激素、重組人干擾素、重組人白細胞介素、重組人集落刺激因子、重組抗體及其片斷等。

效率高、產量大周期短、成本低工藝穩(wěn)定、質量可控缺點是易形成包含體五、重要的重組DNA藥物（一）利用重組大腸桿菌生產醫(yī)用蛋白或1）、干擾素（IFN-α、β、γ）1957年Isaccs等發(fā)現(xiàn)病毒干擾現(xiàn)象，即病毒感染的細胞能產生一種因子，作用于其他細胞干擾病毒復制，因而命名為干擾素。根據(jù)產生干擾素細胞的來源、理化性質和生物活性等差異，可分為α、β、γ等3種，其中IFN-α為多基因產物，有23種以上的亞型。1）、干擾素（IFN-α、β、γ）1986年，F(xiàn)DA批準Roch公司的重組IFN-α2a和Schering公司的重組IFN-α2b，重組IFN-β、γ分別在1990年和1993年上市。我國中國預防醫(yī)學科學院病毒學研究所侯云德等發(fā)現(xiàn)中國人受病毒攻擊產生的干擾素主要為IFN-α1b型，1992年我國第一個基因工程藥物IFN-α1b獲得國家一類新藥證書。1986年，F(xiàn)DA批準Roch公司的重組IFN-α2a2）胰島素(Insulin,Ins)1921年，BantingFG等從胰臟中分離1955年，SangerF測序1965年，我國完成結晶牛胰島素全合成1979年，RutterW等克隆了胰島素基因1982年，第一個重組人胰島素批準上市2）胰島素(Insulin,Ins)胰島素的結構及生物合成胰島素原與胰島素人胰島素的生產方法產人胰島素大腸桿菌工程菌的構建策略胰島素的結構及生物合成第五章-生物制品制造工藝2課件(a)AB鏈分別表達法

體外折疊成功率低，通常只有10～20％(b)人胰島素原表達法

由于C肽的存在，胰島素原在復性條件下能形成天然的空間構象，為三對二硫鍵的正確配對提供了良好的條件，使得體外折疊率高達80％以上目前ElyLily用這種工藝路線年產幾十噸的重組人胰島素，其經濟效益相當可觀。(c)AB鏈同時表達法(a)AB鏈分別表達法體外折疊成功率低，通常只有10～InsA鏈InsB鏈轉化大腸桿菌發(fā)酵A鏈B鏈純化二硫鍵活性胰島素AB鏈合成人胰島素InsA鏈InsB鏈轉化大腸桿菌發(fā)酵A鏈B鏈純化二硫鍵活第五章-生物制品制造工藝2課件質粒InsmRNA反轉錄InscDNA轉化大腸桿菌PCR連接胰島素原活性胰島素二硫鍵酶切提取質粒限制性內切酶酶切反轉錄酶法合成人胰島素質粒InsmRNA反轉錄InscDNA轉化大腸桿菌PCR3）生長激素1944年，李卓浩等從牛垂體中分離出牛生長激素1956年，從人垂體中分離出hGH1969年，hGH序列報道臨床上用于垂體性侏儒癥。1956~1985年，只能從人尸體垂體中分離純化。但至1985年，共發(fā)現(xiàn)50多例克-雅氏癥，5人病亡，研究結果證實由垂體來源的生長激素污染有朊病毒。1985年，垂體來源的被禁用，同年，rhGH上市。3）生長激素1985年，美國FDA批準由大腸桿菌發(fā)酵生產的重組人生長激素上市，隨后各種途徑生產的重組人生長激素迅速充斥市場。1997年，僅美國Genentech和ElyLily兩家公司的重組人生長激素年產量已達20kg，年銷售額超過3.5億美元。人生長激素的結構與性質重組人生長激素工程菌的構建1985年，美國FDA批準由大腸桿菌發(fā)酵生產的重組人生長激素第五章-生物制品制造工藝2課件（二）利用重組酵母生產醫(yī)用蛋白優(yōu)勢：1.最簡單的真核生物，基因表達調控機理較清楚，并且遺傳操作相對較為簡單；2.具有原核無法比擬的真核生物蛋白翻譯后修飾加工系統(tǒng)3.不含有特異性的病毒，不產生毒素，有些酵母菌在食品工業(yè)當中有著幾百年的應用歷史，屬于安全型基因工程受體系統(tǒng)；4.大規(guī)模發(fā)酵工藝簡單，成本低廉5.能將外源基因表達產物分泌至培養(yǎng)基中劣勢：雖然擁有完整的蛋白質糖基化修飾系統(tǒng)，但其修飾方式不用于高等真核生物。舉例：重組乙肝疫苗重組人血清白蛋白（二）利用重組酵母生產醫(yī)用蛋白優(yōu)勢：重組HAS的制備人血清白蛋白HAS是血漿中的主要成分載體蛋白。成熟的人血清白蛋白為一非糖基化的單一多肽鏈，由585個氨基酸組成，含有17對二硫鍵，由此維系的空間構象是血清白蛋白的生物功能所必需的。巴斯德畢赤酵母是迄今為止最為優(yōu)良的重組人血清白蛋白的表達分泌系統(tǒng)。產率可高達15g/L重組HAS的制備人血清白蛋白HAS是血漿中的主要成分載體蛋（三）利用轉基因動物或細胞生產生物大分子1.利用動物乳腺組織生產蛋白藥物酪蛋白、tPA、IL－22.利用哺乳動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術生產復雜的人體蛋白例如EPO（三）利用轉基因動物或細胞生產生物大分子1.利用動物乳腺組織促紅細胞生成素（EPO）由腎臟分泌的一種唾液酸蛋白，它能促進紅細胞系的增殖、分化和成熟.由166個氨基酸殘基組成的高度糖基化蛋白，其糖基對其生物活性至關重要目前用哺乳動物細胞表達系統(tǒng)如CHO細胞生產。臨床為治療腎衰導致貧血的首選藥物，全世界銷售額超過10億美元。促紅細胞生成素（EPO）1957年Jacobson等證實，腎臟是血清EPO的主要來源，含量極微小，無法分離純化獲得純品。直到1985年，Jacobs等才先后成功克隆出人、猴、小鼠的EPO基因，隨后重組人EPO在CHO細胞中獲得表達，并通過層析純化技術制備出rHuEPO純品，于1989年獲得美國FDA批準后首次投放市場。1957年Jacobson等證實，腎臟是血清EPO的主要來源EPO制備工藝根據(jù)已知天然EPO的氨基酸序列，合成相應的寡聚核苷酸探針，篩選出人EPO基因，引入真核生物質粒表達載體PD11,用磷酸鈣微量沉淀法轉染CHO細胞，克隆培養(yǎng)后，檢測培養(yǎng)上清中EPO的生物學活性，篩選出高效表達EPO的細胞株，按照《中國生物制品規(guī)程》要求建立種子庫，檢定合格后用于生產。CHO工程細胞在條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，表達的EPO分泌到培養(yǎng)上清中，上清液中除了EPO外，還含有培養(yǎng)基成分和其他雜蛋白，利用EPO本身的物理化學性質，將培養(yǎng)上清液加熱至80℃，或用6mol/L鹽酸胍、8mol/L尿素沉淀，可以除去大多數(shù)雜蛋白。上清液超濾濃縮后，經過一系列的凝膠過濾層析，如SephadexG－25，SephacrylS－200及Bio－gelP等多步凝膠過濾，其EPO的純度可達到90％以上。進一步純化可用Sepharose4B偶聯(lián)EPO單克隆抗體或多克隆抗體親和層析或經高壓液相層析，其EPO純度可達99％以上。EPO制備工藝根據(jù)已知天然EPO的氨基酸序列，合成相應的寡根據(jù)氨基酸序列合成寡聚核苷酸篩選出EPO基因與真核載體連接轉化重組質粒轉染CHO篩選高表達CHO工程細胞建立種子庫CHO工程細胞培養(yǎng)培養(yǎng)液去雜蛋白初提取液80℃鹽酸胍凝膠層析EPO純度達90％HPLC或親合層析EPO純度達99％根據(jù)氨基酸序列合成寡聚核苷酸篩選出EPO基因與真核載體連接轉生物制藥工藝學

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第五章生物制品制造工藝生物工程教研室§1生物制品的基本概念§2疫苗和菌苗§3DNA重組藥物§4基因治療與基因藥物§1生物制品的基本概念§3

DNA重組藥物一、重組DNA技術與基因工程的基本定義二、基本過程三、重組藥物的分離純化四、質量控制五、重要的重組DNA藥物§3DNA重組藥物一、重組DNA技術與基因工程的基本定§3DNA重組藥物一、重組DNA技術與基因工程的基本定義重組DNA技術是指將一種生物體（供體）的基因與載體在體外進行拼接重組，然后轉入另一種生物體（受體）內，使之按照人們的意愿穩(wěn)定遺傳并表達出新產物或新性狀的DNA體外操作程序，也稱為分子克隆技術。因此，供體、受體、載體是重組DNA技術的三大基本元件。§3DNA重組藥物一、重組DNA技術與基因工程的基本定義§3DNA重組藥物基因工程是指重組DNA技術的產業(yè)化設計與應用，包括上游技術和下游技術兩大組成部分。上游技術指的是基因重組、克隆和表達的設計與構建（即重組DNA技術）；而下游則涉及到基因工程菌或細胞的大規(guī)模培養(yǎng)以及基因產物的分離純化過程?！?DNA重組藥物基因工程是指重組DNA技術的產業(yè)化設計優(yōu)點：1、可大量生產過去難以獲得的生理活性蛋白和多肽；去除內源性物質的不足之處2、提供足夠數(shù)量的生理活性物質，以進行生理生化、結構的研究3、利用基因工程技術可發(fā)現(xiàn)、挖掘更多內源性生理活性物質4、獲得新型化合物優(yōu)點：基因工程藥物是指應用基因工程或蛋白質工程技術制造的重組活性多肽、蛋白質及其修飾物。（1）重組細胞因子類：如IFN、IL、TNF；（2）重組生長因子類：如EGF、NGF以及促進造血系統(tǒng)的生長因子（EPO、CSF）；（3）重組多肽與蛋白質類激素：如重組人胰島素、重組人生長激素（rhGH）等；（4）心血管病治療劑及酶制劑：如水蛭素、tPA（組織纖溶酶原激活物）、天冬酰胺酶、SOD等。（5）重組疫苗及單抗制品：如重組乙肝表面抗原疫苗（酵母）、腫瘤疫苗等。基因工程藥物是指應用基因工程或蛋白質工程技術制造的重組活性多主要基因工程產品的研制、開發(fā)、上市時間產品人生長激素釋放抑制素（SRM)人胰島素首次克隆表達時間國家用途首次進入市場時間國家/地區(qū)1977日本治療巨人癥1978美國治療糖尿病1982歐洲人生長激素（HGH)1979美國治療侏儒癥1985美國人α干擾素（α－IFN)1980美國治療病毒感染癥1985美國乙肝疫苗1983美國預防乙型肝炎1986歐洲人白細胞介素－21984日本治療腫瘤1989歐洲人促紅細胞生成素治療貧血1988歐洲人粒細胞集落刺激因子治療中性白細胞減少癥1991美國人組織纖溶酶原激活劑（t-PA)治療血栓癥1987美國主要基因工程產品的研制、開發(fā)、上市時間產品人生長激素釋放抑制DNA重組藥物制造的主要步驟獲得目的基因DNA的體外重組（切與連）載體的選擇受體細胞的選擇重組DNA分子轉化（轉）轉化子的篩選與鑒定（選）外源基因的大規(guī)模表達和分離純化產品的檢驗和制劑制備DNA重組藥物制造的主要步驟獲得目的基因DNA的體外重組（切第五章-生物制品制造工藝2課件二、基本過程上游階段：實驗室獲得目的基因、酶切和酶連、插入適當載體、轉入宿主細胞、復制、目的基因分析確證、表達、篩選合適表達系統(tǒng)等下游階段：將實驗室成果產業(yè)化發(fā)酵參數(shù)確定、新型生物反應器研制、高效分離介質及裝置開發(fā)、生物傳感器設計制造、電子計算機優(yōu)化控制、產品質量控制注意：上游DNA重組的設計必須以簡化下游操作工藝和裝備為指導思想；而下游過程則是上游基因重組藍圖的體現(xiàn)和保證，這是基因工程產業(yè)化的基本原則。二、基本過程上游階段：實驗室注意：上游DNA重組的設計必須1、目的基因的獲得1）鳥槍法（基因文庫）基因組DNA提取→限制性內切酶部分水解→與載體連接→轉化、擴增與篩選2）逆轉錄法（cDNA文庫）

mRNA純化→cDNA第一合成→第二鏈合成→cDNA克隆→將重組體導入宿主細胞→cDNA文庫鑒定→目的cDNA克隆的分離和鑒定3）合成法4）PCR法1、目的基因的獲得1）鳥槍法（基因文庫）2、基因表達1）選擇宿主細胞

原核

大腸桿菌：生長快；遺傳研究深入；產品多為胞內（包含體）或周質中；不能糖基化修飾。需注意內毒素污染。

枯草芽孢桿菌：分泌力強，不形成包含體；不修飾；胞外酶可能會降解產物

鏈霉菌：分泌能力強；不致病，安全；有糖基化能力。2、基因表達1）選擇宿主細胞真核酵母：研究基因表達調控最有效的單細胞真核微生物；基因組小，僅為大腸桿菌4倍；傳代時間短；無毒；有分泌功能和修飾功能；已用于干擾素、乙肝表面抗原等重組DNA藥物的生產。絲狀真菌：有很強的蛋白質分泌能力，能正確加工，糖基化方式與高等生物相似，有成熟發(fā)酵和后處理工藝哺乳動物細胞：類似天然產物，但培養(yǎng)條件苛刻真核大腸桿菌與真核細胞表達系統(tǒng)比較大腸桿菌:

發(fā)酵包含體復性純化目的蛋白真核細胞:發(fā)酵上清液純化目的蛋白大腸桿菌與真核細胞表達系統(tǒng)比較大腸桿菌:大腸桿菌表達的重組蛋白易形成包含體

高效表達的目的蛋白在大腸桿菌內形成大量無活性包含體。因無法有效的解決復性問題，在美國每年造成的經濟損失就達幾十億美元

包含體電鏡圖大腸桿菌表達的重組蛋白易形成包含體高效表達的目的蛋白包含體用大腸桿菌做宿主生產基因工程藥物必須克服的6個困難：1)原核基因表達產物為胞內表達，必須破胞分離，受胞內其他蛋白干擾，純化困難；2)原核基因表達產物在胞內多為不溶性包含體，必經過變性、復性處理來恢復藥物蛋白生物學活性工藝復雜；3)沒有翻譯后的加工機制，如糖基化，應用上受到限制；4)產物的第一個氨基酸必是甲酰甲硫氨酸，因無加工機制，常造成N-甲硫氨酸冗余，作為藥物易引起免疫反應；5)細菌的內毒素不易清除；6)細菌的蛋白酶常把外源基因的表達產物消化用大腸桿菌做宿主生產基因工程藥物必須克服的6個困難：1)原核蛋白質復性概念將蛋白質從結構不規(guī)則、無活性的狀態(tài)，恢復到有唯一立體結構、有生物活性的狀態(tài)的過程稱為蛋白質復性。蛋白質復性概念將蛋白質從結構不規(guī)則、無2）表達載體要求：a、能獨立復制b、有靈活的多克隆位點和方便的篩選標記c、具有有效運載外源基因的能力，能攜帶大小不同的外源基因d、容易控制，在細胞內穩(wěn)定性高，安全可靠。2）表達載體如大腸桿菌的pBV220系統(tǒng)，為溫度誘導表達載體，已成功用于IL-2，IL-3，IFN等pET系統(tǒng)，最有潛力的系統(tǒng)，可用乳糖代替IPTG（異丙基硫代-β-D-半乳糖），產物可達細胞總蛋白20~30%，表達量可達總蛋白50%。第五章-生物制品制造工藝2課件

3）構建工程菌目的基因與載體DNA的連接重組DNA向宿主細胞內轉移篩選與鑒定帶有目的基因的陽性克隆影響目的基因表達的因素3）構建工程菌三、重組藥物的分離純化

A重組蛋白分離純化方法選擇的基本原則◎針對不用的產物表達形式采取不同的策略◎針對不同性質的重組蛋白選擇不同的層析類型◎多種分離純化技術的聯(lián)合運用◎合適分離純化介質的選擇◎分離純化過程的規(guī)?；⒅亟M藥物的分離純化A重組蛋白分離純化方法選擇的基本原則◎針對不同的產物表達形式采取不同的策略采用分泌型戰(zhàn)略表達重組蛋白，通常體積大、濃度低，因此應在純化之前采用沉淀或超濾等方法先進行濃縮處理；采用包涵體型戰(zhàn)略表達重組蛋白，應先離心回收包涵體；采用融合型戰(zhàn)略表達重組蛋白，一般是胞內可溶性的，擬首先選用親和層析進行純化表達在細胞膜和細胞壁之間的間隙中的蛋白質，應用低濃度的溶菌酶處理，然后再用滲透壓休克法釋放重組蛋白?！蜥槍Σ煌漠a物表達形式采取不同的策略◎針對不同性質的重組蛋白選擇不同的層析類型

等電點處于極端區(qū)域（大于8或小于5）的重組蛋白應首選離子交換法進行分離，這樣很容易除去幾乎所有的雜蛋白；重組蛋白特異性的配體、底物、抗體、糖鏈等都是首選親和層析純化方法的重要條件，原則是它們與目標蛋白之間的解離常數(shù)應在合適的范圍內（10－8～10－4mol/L）;

疏水層析和反相層析是根據(jù)蛋白質的疏水性差異進行分離的；

凝膠過濾層析是根據(jù)蛋白的分子量和體積差異進行分離的；

徑向層析是近年來發(fā)展起來的集層析分離和膜分離于一體的一種復合技術，在流量、負荷量等參數(shù)方面顯示出極大的優(yōu)越性。◎針對不同性質的重組蛋白選擇不同的層析類型§3DNA重組藥物◎多種分離純化技術的聯(lián)合運用在進行重組蛋白的純化時，通常需要綜合使用多種技術，一般來說，在選擇分離純化方法時應遵循下列原則：＃應選擇不同分離純化機理的方法聯(lián)合使用＃應首先選擇能除去含量最多雜質的方法＃應盡量選擇高效的分離方法＃應將最費時、成本最高的分離純化方法安排在最后階段§3DNA重組藥物◎多種分離純化技術的聯(lián)合運用◎合適分離純化介質的選擇常用的蛋白質分離純化介質有Sephadex和Sepharose。理想的分離純化介質應具有下列性質：＃對目標蛋白具有較高的分辨效率＃對目標蛋白不會造成變性?；瘜W性能和機械性能穩(wěn)定，重復性好＃價格低廉◎合適分離純化介質的選擇◎分離純化過程的規(guī)模化蛋白質分離純化的實驗室工藝、技術、方法在大規(guī)模產業(yè)化過程未必合適，如：＃實驗室方法在工程上可能難以實現(xiàn)（超聲波破細胞壁）＃實驗室方法在大規(guī)模生產中可能成本過高（超速離心）因此，在很多情況下，實驗室的技術路線不等于生產工藝?！蚍蛛x純化過程的規(guī)?；摹①|量控制

1、原材料質量控制

2、培養(yǎng)過程質量控制3、純化工藝質量控制

4、目標產品質量控制

四、質量控制

1、原材料質量控制保證編碼DNA序列正確要了解以下特性：A、目的基因來源、克隆過程、序列B、表達載體名稱、結構、遺傳特性及酶切圖譜、抗生素標記等C、宿主名稱、來源、傳代歷史、檢定結果及生物學特征D、載體引入宿主方式、及載體在宿主中狀態(tài)E、插入基因于表達載體兩側控制區(qū)核酸序列F、啟動和控制克隆基因表達的方法及水平保證編碼DNA序列正確種子克隆純而且穩(wěn)定，在培養(yǎng)工程中工程菌不應出現(xiàn)無突變或質粒丟失的現(xiàn)象種子批系統(tǒng)工作細胞庫種子克隆純而且穩(wěn)定，在培養(yǎng)工程中工程菌不應出現(xiàn)無突變或質粒丟§3DNA重組藥物盡量去除污染病毒、核酸、宿主細胞雜蛋白等雜質，并避免在純化過程帶入有害物質純化每一步應測定純度、計算提純倍數(shù)、收率等等§3DNA重組藥物盡量去除污染病毒、核酸、宿主細胞雜蛋白1）、產品的鑒別氨基酸組成分析：肽圖分析：N末端和C末端氨基酸測序：蛋白質二硫鍵的分析：重組蛋白相對分子量：等電點的測定：2）、純度分析：SDS,CE,IEF,HPLC3）、生物活性測定4）、殘余雜質檢測宿主細胞蛋白含量、宿主細胞DNA、殘余抗生素等5）、安全性檢測無菌實驗、熱原實驗、毒性實驗、免疫原性檢查1）、產品的鑒別A體內生物學活性測定方法生物學模型生長激素大鼠腦垂體B體外生物學活性測定方法如：MTT法:MTTformazan(藍紫色)干擾素類蛋白：可用細胞毒抑制試驗來測定干擾素的體外活性。琥珀酸脫氫酶A體內生物學活性測定方法琥珀酸脫氫酶五、重要的重組DNA藥物（一）利用重組大腸桿菌生產醫(yī)用蛋白或多肽代表產品：重組人胰島素、重組人生長激素、重組人干擾素、重組人白細胞介素、重組人集落刺激因子、重組抗體及其片斷等。

效率高、產量大周期短、成本低工藝穩(wěn)定、質量可控缺點是易形成包含體五、重要的重組DNA藥物（一）利用重組大腸桿菌生產醫(yī)用蛋白或1）、干擾素（IFN-α、β、γ）1957年Isaccs等發(fā)現(xiàn)病毒干擾現(xiàn)象，即病毒感染的細胞能產生一種因子，作用于其他細胞干擾病毒復制，因而命名為干擾素。根據(jù)產生干擾素細胞的來源、理化性質和生物活性等差異，可分為α、β、γ等3種，其中IFN-α為多基因產物，有23種以上的亞型。1）、干擾素（IFN-α、β、γ）1986年，F(xiàn)DA批準Roch公司的重組IFN-α2a和Schering公司的重組IFN-α2b，重組IFN-β、γ分別在1990年和1993年上市。我國中國預防醫(yī)學科學院病毒學研究所侯云德等發(fā)現(xiàn)中國人受病毒攻擊產生的干擾素主要為IFN-α1b型，1992年我國第一個基因工程藥物IFN-α1b獲得國家一類新藥證書。1986年，F(xiàn)DA批準Roch公司的重組IFN-α2a2）胰島素(Insulin,Ins)1921年，BantingFG等從胰臟中分離1955年，SangerF測序1965年，我國完成結晶牛胰島素全合成1979年，RutterW等克隆了胰島素基因1982年，第一個重組人胰島素批準上市2）胰島素(Insulin,Ins)胰島素的結構及生物合成胰島素原與胰島素人胰島素的生產方法產人胰島素大腸桿菌工程菌的構建策略胰島素的結構及生物合成第五章-生物制品制造工藝2課件(a)AB鏈分別表達法

體外折疊成功率低，通常只有10～20％(b)人胰島素原表達法

由于C肽的存在，胰島素原在復性條件下能形成天然的空間構象，為三對二硫鍵的正確配對提供了良好的條件，使得體外折疊率高達80％以上目前ElyLily用這種工藝路線年產幾十噸的重組人胰島素，其經濟效益相當可觀。(c)AB鏈同時表達法(a)AB鏈分別表達法體外折疊成功率低，通常只有10～InsA鏈InsB鏈轉化大腸桿菌發(fā)酵A鏈B鏈純化二硫鍵活性胰島素AB鏈合成人胰島素InsA鏈InsB鏈轉化大腸桿菌發(fā)酵A鏈B鏈純化二硫鍵活第五章-生物制品制造工藝2課件質粒InsmRNA反轉錄InscDNA轉化大腸桿菌PCR連接胰島素原活性胰島素二硫鍵酶切提取質粒限制性內切酶酶切反轉錄酶法合成人胰島素質粒InsmRNA反轉錄InscDNA轉化大腸桿菌PCR3）生長激素1944年，李卓浩等從牛垂體中分離出牛生長激素1956年，從人垂體中分離出hGH1969年，hGH序列報道臨床上用于垂體性侏儒癥。1956~1985年，只能從人尸體垂體中分離純化。但至1985年，共發(fā)現(xiàn)50多例克-雅氏癥，5人病亡，研究結果證實由垂體來源的生長激素污染有朊病毒。1985年，垂體來源的被禁用，同年，rhGH上市。3）生長激素1985年，美國FDA批準由大腸桿菌發(fā)酵生產的重組人生長激素上市，隨后各種途徑生產的重組人