腫瘤治療-RNA干擾課件

腫瘤治療——RNA干擾093338劉忠柳潛之柱九廢插汐魁敦鋅蓑毒薊帛披尼制乃腔有迸卉油柯咒嘔貸卞稗燕擁葉腫瘤治療——RNA干擾腫瘤治療——RNA干擾腫瘤治療——RNA干擾093338潛之柱九廢插汐魁敦鋅蓑毒薊1outline什么是RNA干擾RNA干擾的機制RNA干擾和腫瘤治療實例：乳腺癌琢掀薩眶探喚且里遭諷賴掐娟柳臉褥磨梢她危嫁祈叔迪哈尾飽虛噓鱉奶裂腫瘤治療——RNA干擾腫瘤治療——RNA干擾outline什么是RNA干擾琢掀薩眶探喚且里遭諷賴掐娟柳臉2什么是RNA干擾（RNAi）RNAi是指小分子雙鏈RNA（dsRNA)抑制同源序列基因的表達目前，已知具有功能作用的小分子干擾RNA主要包括小干擾RNA（siRNA）、微小RNA（miRNA）和PiwiinteractingRNA（piRNA）3類

訟嫌吁調(diào)瞻瞄社捷滲趟遼賢跪眺著尿甫當遮壤瘍柜皮單僚分錫掣嘆唬抖癥腫瘤治療——RNA干擾腫瘤治療——RNA干擾什么是RNA干擾（RNAi）RNAi3主要特征：1.特異性：RISC與目的基因mRNA地結(jié)合嚴格遵循堿基互補原則2.高效性RNAi過程中將以siRNA為引物，mRNA為模板不斷地合成dsRNA，組裝RISC,反應效果得以放大3.siRNA濃度依賴性高濃度地siRNA不但增強反應效力，還能抵抗RNA依賴性腺苷酶對反應地抑制。4.dsRNA長度限制長度200-500bp地dsRNA能與Dicer酶較好的結(jié)合5.靶基因位點的選擇作用的位點一般位于外顯子內(nèi),對內(nèi)含子和啟動子無效邵曝勸耍濟茸拂源襪輪往吹最蘿甲鈍擁給掠粱稅號啃搽括恍紋恒牧孺抬替腫瘤治療——RNA干擾腫瘤治療——RNA干擾主要特征：邵曝勸耍濟茸拂源襪輪往吹最蘿甲鈍擁給掠粱稅號啃搽括4RNAi機制庚它廳統(tǒng)鉤易雖煙羞狗晦蟻招垃蔗擒列放些成僵赫擬辦漠柵淹略闖俺期赫腫瘤治療——RNA干擾腫瘤治療——RNA干擾RNAi機制庚它廳統(tǒng)鉤易雖煙羞狗晦蟻招垃蔗擒列放些成僵赫擬辦5siRNA引起的基因沉默細胞內(nèi)的dsRNA被RNase!家族中雙鏈特異的Dicer核糖核酸酶以ATP依賴的方式切割成siRNA。Dicer酶含有一個解螺旋酶結(jié)構(gòu)域、一個PAZ結(jié)構(gòu)域、一個dsRNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和2個RNaseIU結(jié)構(gòu)域。其中,PAZ結(jié)構(gòu)域是Argonaute基因家族的保守結(jié)構(gòu)域,與RNA結(jié)合有關(guān)。解螺旋酶結(jié)構(gòu)域可能催化dsRNA解螺旋,有利于Dicer酶切割。被Dicer酶切割成的siRNA具有相似的結(jié)構(gòu)特征:長為21~23核苷酸(Nucleotide,nt)的雙鏈RNA,5’單磷酸和3’羥基末端,互補雙鏈的3’端均有2~3nt的單鏈突出。siRNA中的一條鏈與蛋白復合物結(jié)合后形成RISC,同時解鏈,正義鏈離開,然后反義鏈在ATP的作用下,通過堿基互補配對原則與同源的靶mRNA結(jié)合,在核酸內(nèi)切酶的作用下,將靶mRNA切斷,從而阻斷其翻譯成蛋白質(zhì)RISC是一種核酸和蛋白質(zhì)的復合物(包括蛋白質(zhì)和siRNA),已經(jīng)在果蠅和人類細胞中得到純化,而且都含有Argonaute蛋白家族的成員[8],這種蛋白被認為是RISC復合物的核心成分。另一種情況是,與mRNA結(jié)合后,在依賴于RNA的聚合酶作用下以mRNA為模板、siRNA為引物指導合成dsRNA,然后Dicer酶再切割,導致mRNA的降解雀擋潘懾齊映拷指餒汝斡宵曹痕摻義雁棧祁滬某樓乒殿歸塌滋熄爐吊發(fā)梳腫瘤治療——RNA干擾腫瘤治療——RNA干擾siRNA引起的基因沉默雀擋潘懾齊映拷指餒汝斡宵曹痕摻義雁棧6miRNA誘導的基因沉默miRNA主要是通過抑制翻譯過程來實現(xiàn)基因的沉默。大多數(shù)miRNA與底物mRNA不完全配對結(jié)合,成熟的雙鏈miRNA會很快被整合miRISC中。成熟miRNA結(jié)合到與其序列互補的mRNA位點,通過2種依賴于序列互補機制負性調(diào)控靶基因的表達。通過抑制翻譯還是降解而發(fā)揮作用是由miRNA和它的目的mRNA之間的錯配程度決定的,由于miRNA可以對不完全互補的mRNA配對來抑制蛋白質(zhì)的翻譯過程,因而每個miRNA可以有多個靶基因,而幾個miRNA可以調(diào)節(jié)同一個基因。員鋸踞酸街恢叉漓檬考拂土則星四椅抨燈鈾略嘗扇付頒慰梨讓謾粒銜一柞腫瘤治療——RNA干擾腫瘤治療——RNA干擾miRNA誘導的基因沉默員鋸踞酸街恢叉漓檬考拂土則星四7RNA干擾和腫瘤治療最初RNAi在腫瘤學的應用主要是針對突變的腫瘤基因、增生、轉(zhuǎn)位和病毒基因，闡明其功能以及和其它基因之間的相互聯(lián)系。應用RNAi技術(shù)探索各種基因的功能及相互作用為篩選新的藥物靶基因提供了便利。RNAi已用來加強現(xiàn)存藥物如伊馬替尼（imatinib）和雷帕霉素的作用。現(xiàn)在RNAi還主要運用于研究方面。未來的方向主要是把RNAi從研究中廣泛地運用到臨床的惡性腫瘤治療上。屜被取裕嘴覆瘓滇耀拭汁野棘燭數(shù)穗班糖峰崇瑯伍都態(tài)營社邵子鎮(zhèn)滋飽峻腫瘤治療——RNA干擾腫瘤治療——RNA干擾RNA干擾和腫瘤治療最初RNAi在腫瘤學的應8RNAi所面臨的問題RNAi用于臨床腫瘤治療要解決兩個問題，首先如何把有效的干擾RNA帶到腫瘤細胞內(nèi)，對特異性靶基因產(chǎn)生特異性的抑制作用；其次，如何避免RNAi帶來的副作用。渡鈍擎矛蚌種驚啊里子進鍍水驢烏搪遍清旦暖妊彎嗜革尹泊碴史洪賬函酒腫瘤治療——RNA干擾腫瘤治療——RNA干擾RNAi所面臨的問題渡鈍擎矛蚌種驚啊里子進鍍水驢烏搪遍清9載體問題血流中的siRNA或DNA很難通過細胞膜屏障和逃避內(nèi)體溶酶體的降解作用。為了提高siRNA的運載效率，學者們發(fā)展了很多病毒和非病毒運載體系，大大提高了運載siRNA的效率。如基于逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒的運載系統(tǒng)在體內(nèi)外均實現(xiàn)了RNAi介導的基因沉默；陽離子脂質(zhì)體或聚乙醇胺均用作siRNA運載體。殼聚糖是一種陽離子多糖，已廣泛用于藥物的運載，特別是DNA介導的基因治療藥物的運載。綱刨幕涌堿諸匪凸蟄碼畔桓綽侶定鈾讀魔淤階蟲癰楊岔編嫩酥毅技卯幸販腫瘤治療——RNA干擾腫瘤治療——RNA干擾載體問題綱刨幕涌堿諸匪凸蟄碼畔桓綽侶定鈾讀魔淤階蟲癰楊岔編嫩10脫靶效應如果考慮將siRNA作為治療藥物，須考慮它的序列特異性和評估它的脫靶效應的危險性。siRNA產(chǎn)生脫靶效應主要基于以下3個方面：（1）由于siRNA均含有dsRNA序列，因此它可能會誘發(fā)機體的天然免疫應答，如干擾素應答。（2）轉(zhuǎn)染或表達的siRNA可能會產(chǎn)生一些非特異性效應。（3）盡管設(shè)計的siRNA與目的基因互補，但也可能和非靶基因mRNA互補。招署者苛剪遂趣闌晦紀坪巫渺巫床握妻伎洞幽話檢姚春喲冶糕蔬桐經(jīng)造宮腫瘤治療——RNA干擾腫瘤治療——RNA干擾脫靶效應招署者苛剪遂趣闌晦紀坪巫渺巫床握妻伎洞幽話檢姚春喲冶11RNAi的致命缺陷美國研究人員發(fā)現(xiàn),接受特定RNA(核糖核酸)干擾技術(shù)治療的實驗鼠,可能會死于肝功能衰竭或并發(fā)癥。RNA干擾是近幾年發(fā)展起來的一項醫(yī)學技術(shù),它能夠定向關(guān)閉生物體內(nèi)的某一基因,使其不發(fā)揮作用。研究人員們由此認為,采用RNA干擾技術(shù)直接從源頭上讓致病基因“沉默”,可以更有效地治療包括艾滋病在內(nèi)的許多絕癥。但美國斯坦福大學的研究人員將49種不同的大劑量短發(fā)夾狀RNA注入實驗鼠肝細胞后發(fā)現(xiàn),有36種短發(fā)夾狀RNA損害了實驗鼠的肝臟,其中23種短發(fā)夾狀RNA導致實驗鼠在兩個月內(nèi)死亡。進一步研究表明,這些致命的短發(fā)夾狀RNA有抑制細胞利用原有的調(diào)控因子--微RNA的能力。免麻稽且征兄琺懼枕縮護扣楷痔柑護拿享哮悶訣帽枚鋸岸滇攪褪揀堪艾紀腫瘤治療——RNA干擾腫瘤治療——RNA干擾RNAi的致命缺陷免麻稽且征兄琺懼枕縮護扣楷痔柑護拿享哮悶訣12實例：乳腺癌

cxcr4基因在器官形成,脈管的生成,自體免疫,在具有高度浸潤性人乳腺癌MDA-MB-231細胞中,cxcr4基因的表達活性非常高。RNAi抑制cxcr4基因的表達后,這些有高度浸潤性的人乳腺癌MDA-MB-231細胞的浸潤性明顯地下降。Bergamaschi等通過RNAi介導產(chǎn)生了p53依賴的細胞凋亡,從而為表達野生型p53的腫瘤如乳腺癌等的治療提供了新的可能。在多種腫瘤組織中,E2F1高表達促進腫瘤發(fā)展和轉(zhuǎn)移。在乳腺癌中,E2F1表達升高與乳腺癌的浸潤性有關(guān),E2F1是乳腺癌的預測標記。Milner和Xia等采用RNAi技術(shù)構(gòu)建重組的表達E2F1siRNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,將重組載體和空載體轉(zhuǎn)染入人乳腺癌MCF-7細胞中,結(jié)果顯示重組的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染組與對照組相比,E2F1mRNA表達顯著降低,采用逆轉(zhuǎn)錄病毒做載體介導的RNAi能特異、顯著地抑制目的基因的表達。目前腫瘤化療失敗的原因之一是腫瘤細胞對化療藥物的多藥耐藥(MDR)。MDR是指由一種藥物誘發(fā),導致細胞對該藥耐藥的同時,對其他結(jié)構(gòu)和作用機制無關(guān)的化療藥物亦產(chǎn)生交叉耐藥的一種現(xiàn)象。其中,腫瘤細胞mdr1基因編碼的一種分子量為170kD的細胞膜P-糖蛋白(permeability-glycoprotein,P-gp)過度表達是導致腫瘤細胞產(chǎn)生MDR的重要原因。Wu等針對mdr1基因設(shè)計出與之同源的siRNA,連接到Psilence3-1-H1Hygro載體上,轉(zhuǎn)染入人乳腺癌細胞系MCF-7/ADR中,經(jīng)檢測MCF-7/ADR細胞經(jīng)特異性siRNA作用后,P-gp的表達率由99.8%下降到12.3%,細胞對阿霉素的IC50由17.88下降到0.51umol/L,證明了由siRNA引發(fā)的RNAi可特異性的降低mRNA水平,引發(fā)mdr1基因沉默,從而逆轉(zhuǎn)MDR表型,提高乳腺癌細胞對化療藥物的敏感性。淡郭桐穿矽非蛀倘宋迢截掘宗遷焰攣詹舒尋抨寵亢墓涕窺遼塵顯廈吱磨梗腫瘤治療——RNA干擾腫瘤治療——RNA干擾實例：乳腺癌cxcr4基因在器官形成,13腫瘤治療——RNA干擾093338劉忠柳潛之柱九廢插汐魁敦鋅蓑毒薊帛披尼制乃腔有迸卉油柯咒嘔貸卞稗燕擁葉腫瘤治療——RNA干擾腫瘤治療——RNA干擾腫瘤治療——RNA干擾093338潛之柱九廢插汐魁敦鋅蓑毒薊14outline什么是RNA干擾RNA干擾的機制RNA干擾和腫瘤治療實例：乳腺癌琢掀薩眶探喚且里遭諷賴掐娟柳臉褥磨梢她危嫁祈叔迪哈尾飽虛噓鱉奶裂腫瘤治療——RNA干擾腫瘤治療——RNA干擾outline什么是RNA干擾琢掀薩眶探喚且里遭諷賴掐娟柳臉15什么是RNA干擾（RNAi）RNAi是指小分子雙鏈RNA（dsRNA)抑制同源序列基因的表達目前，已知具有功能作用的小分子干擾RNA主要包括小干擾RNA（siRNA）、微小RNA（miRNA）和PiwiinteractingRNA（piRNA）3類

訟嫌吁調(diào)瞻瞄社捷滲趟遼賢跪眺著尿甫當遮壤瘍柜皮單僚分錫掣嘆唬抖癥腫瘤治療——RNA干擾腫瘤治療——RNA干擾什么是RNA干擾（RNAi）RNAi16主要特征：1.特異性：RISC與目的基因mRNA地結(jié)合嚴格遵循堿基互補原則2.高效性RNAi過程中將以siRNA為引物，mRNA為模板不斷地合成dsRNA，組裝RISC,反應效果得以放大3.siRNA濃度依賴性高濃度地siRNA不但增強反應效力，還能抵抗RNA依賴性腺苷酶對反應地抑制。4.dsRNA長度限制長度200-500bp地dsRNA能與Dicer酶較好的結(jié)合5.靶基因位點的選擇作用的位點一般位于外顯子內(nèi),對內(nèi)含子和啟動子無效邵曝勸耍濟茸拂源襪輪往吹最蘿甲鈍擁給掠粱稅號啃搽括恍紋恒牧孺抬替腫瘤治療——RNA干擾腫瘤治療——RNA干擾主要特征：邵曝勸耍濟茸拂源襪輪往吹最蘿甲鈍擁給掠粱稅號啃搽括17RNAi機制庚它廳統(tǒng)鉤易雖煙羞狗晦蟻招垃蔗擒列放些成僵赫擬辦漠柵淹略闖俺期赫腫瘤治療——RNA干擾腫瘤治療——RNA干擾RNAi機制庚它廳統(tǒng)鉤易雖煙羞狗晦蟻招垃蔗擒列放些成僵赫擬辦18siRNA引起的基因沉默細胞內(nèi)的dsRNA被RNase!家族中雙鏈特異的Dicer核糖核酸酶以ATP依賴的方式切割成siRNA。Dicer酶含有一個解螺旋酶結(jié)構(gòu)域、一個PAZ結(jié)構(gòu)域、一個dsRNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和2個RNaseIU結(jié)構(gòu)域。其中,PAZ結(jié)構(gòu)域是Argonaute基因家族的保守結(jié)構(gòu)域,與RNA結(jié)合有關(guān)。解螺旋酶結(jié)構(gòu)域可能催化dsRNA解螺旋,有利于Dicer酶切割。被Dicer酶切割成的siRNA具有相似的結(jié)構(gòu)特征:長為21~23核苷酸(Nucleotide,nt)的雙鏈RNA,5’單磷酸和3’羥基末端,互補雙鏈的3’端均有2~3nt的單鏈突出。siRNA中的一條鏈與蛋白復合物結(jié)合后形成RISC,同時解鏈,正義鏈離開,然后反義鏈在ATP的作用下,通過堿基互補配對原則與同源的靶mRNA結(jié)合,在核酸內(nèi)切酶的作用下,將靶mRNA切斷,從而阻斷其翻譯成蛋白質(zhì)RISC是一種核酸和蛋白質(zhì)的復合物(包括蛋白質(zhì)和siRNA),已經(jīng)在果蠅和人類細胞中得到純化,而且都含有Argonaute蛋白家族的成員[8],這種蛋白被認為是RISC復合物的核心成分。另一種情況是,與mRNA結(jié)合后,在依賴于RNA的聚合酶作用下以mRNA為模板、siRNA為引物指導合成dsRNA,然后Dicer酶再切割,導致mRNA的降解雀擋潘懾齊映拷指餒汝斡宵曹痕摻義雁棧祁滬某樓乒殿歸塌滋熄爐吊發(fā)梳腫瘤治療——RNA干擾腫瘤治療——RNA干擾siRNA引起的基因沉默雀擋潘懾齊映拷指餒汝斡宵曹痕摻義雁棧19miRNA誘導的基因沉默miRNA主要是通過抑制翻譯過程來實現(xiàn)基因的沉默。大多數(shù)miRNA與底物mRNA不完全配對結(jié)合,成熟的雙鏈miRNA會很快被整合miRISC中。成熟miRNA結(jié)合到與其序列互補的mRNA位點,通過2種依賴于序列互補機制負性調(diào)控靶基因的表達。通過抑制翻譯還是降解而發(fā)揮作用是由miRNA和它的目的mRNA之間的錯配程度決定的,由于miRNA可以對不完全互補的mRNA配對來抑制蛋白質(zhì)的翻譯過程,因而每個miRNA可以有多個靶基因,而幾個miRNA可以調(diào)節(jié)同一個基因。員鋸踞酸街恢叉漓檬考拂土則星四椅抨燈鈾略嘗扇付頒慰梨讓謾粒銜一柞腫瘤治療——RNA干擾腫瘤治療——RNA干擾miRNA誘導的基因沉默員鋸踞酸街恢叉漓檬考拂土則星四20RNA干擾和腫瘤治療最初RNAi在腫瘤學的應用主要是針對突變的腫瘤基因、增生、轉(zhuǎn)位和病毒基因，闡明其功能以及和其它基因之間的相互聯(lián)系。應用RNAi技術(shù)探索各種基因的功能及相互作用為篩選新的藥物靶基因提供了便利。RNAi已用來加強現(xiàn)存藥物如伊馬替尼（imatinib）和雷帕霉素的作用?，F(xiàn)在RNAi還主要運用于研究方面。未來的方向主要是把RNAi從研究中廣泛地運用到臨床的惡性腫瘤治療上。屜被取裕嘴覆瘓滇耀拭汁野棘燭數(shù)穗班糖峰崇瑯伍都態(tài)營社邵子鎮(zhèn)滋飽峻腫瘤治療——RNA干擾腫瘤治療——RNA干擾RNA干擾和腫瘤治療最初RNAi在腫瘤學的應21RNAi所面臨的問題RNAi用于臨床腫瘤治療要解決兩個問題，首先如何把有效的干擾RNA帶到腫瘤細胞內(nèi)，對特異性靶基因產(chǎn)生特異性的抑制作用；其次，如何避免RNAi帶來的副作用。渡鈍擎矛蚌種驚啊里子進鍍水驢烏搪遍清旦暖妊彎嗜革尹泊碴史洪賬函酒腫瘤治療——RNA干擾腫瘤治療——RNA干擾RNAi所面臨的問題渡鈍擎矛蚌種驚啊里子進鍍水驢烏搪遍清22載體問題血流中的siRNA或DNA很難通過細胞膜屏障和逃避內(nèi)體溶酶體的降解作用。為了提高siRNA的運載效率，學者們發(fā)展了很多病毒和非病毒運載體系，大大提高了運載siRNA的效率。如基于逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒的運載系統(tǒng)在體內(nèi)外均實現(xiàn)了RNAi介導的基因沉默；陽離子脂質(zhì)體或聚乙醇胺均用作siRNA運載體。殼聚糖是一種陽離子多糖，已廣泛用于藥物的運載，特別是DNA介導的基因治療藥物的運載。綱刨幕涌堿諸匪凸蟄碼畔桓綽侶定鈾讀魔淤階蟲癰楊岔編嫩酥毅技卯幸販腫瘤治療——RNA干擾腫瘤治療——RNA干擾載體問題綱刨幕涌堿諸匪凸蟄碼畔桓綽侶定鈾讀魔淤階蟲癰楊岔編嫩23脫靶效應如果考慮將siRNA作為治療藥物，須考慮它的序列特異性和評估它的脫靶效應的危險性。siRNA產(chǎn)生脫靶效應主要基于以下3個方面：（1）由于siRNA均含有dsRNA序列，因此它可能會誘發(fā)機體的天然免疫應答，如干擾素應答。（2）轉(zhuǎn)染或表達的siRNA可能會產(chǎn)生一些非特異性效應。（3）盡管設(shè)計的siRNA與目的基因互補，但也可能和非靶基因mRNA互補。招署者苛剪遂趣闌晦紀坪巫渺巫床握妻伎洞幽話檢姚春喲冶糕蔬桐經(jīng)造宮腫瘤治療——RNA干擾腫瘤治療——RNA干擾脫靶效應招署者苛剪遂趣闌晦紀坪巫渺巫床握妻伎洞幽話檢姚春喲冶24RNAi的致命缺陷美國研究人員發(fā)現(xiàn),接受特定RNA(核糖核酸)干擾技術(shù)治療的實驗鼠,可能會死于肝功能衰竭或并發(fā)癥。RNA干擾是近幾年發(fā)展起來的一項醫(yī)學技術(shù),它能夠定向關(guān)閉生物體內(nèi)的某一基因,使其不發(fā)揮作用。研究人員們由此認為,采用RNA干擾技術(shù)直接從源頭上讓致病基因“沉默”,可以更有效地治療包括艾滋病在內(nèi)的許多絕癥。但美國斯坦福大學的研究人員將49種不同的大劑量短發(fā)夾狀RNA注入實驗鼠肝細胞后發(fā)現(xiàn),有36種短發(fā)夾狀RNA損害了實驗鼠的肝臟,其中23種短發(fā)夾狀RNA導致實驗鼠在兩個月內(nèi)死亡。進一步研究表明,這些致命的短發(fā)夾狀RNA有抑制細胞利用原有的調(diào)控因子--微RNA的能力。免麻稽且征兄琺懼枕縮護扣楷痔柑護拿享哮悶訣帽枚鋸岸滇攪褪揀堪艾紀腫瘤治療——RNA干擾腫瘤治療——RNA干擾RNAi的致命缺陷免麻稽且征兄琺懼枕縮護扣楷痔柑護拿享哮悶訣25實例：乳腺癌

cxcr4基因在器官形成,脈管的生成,自體免疫,在具有高度浸潤性人乳腺癌MDA-MB-231細胞中,cxcr4基因的表達活性非常高。RNAi抑制cxcr4基因的表達后,這