液體發(fā)酵技術

液體發(fā)酵技術液體發(fā)酵技術液體發(fā)酵技術xxx公司液體發(fā)酵技術文件編號：文件日期：修訂次數(shù)：第1.0次更改批準審核制定方案設計，管理制度液體發(fā)酵技術1.液體發(fā)酵技術簡介液體發(fā)酵的概念液體發(fā)酵技術是現(xiàn)代生物技術之一，它是指在生化反應器中，模仿自然界將食藥用菌在生育過程中所必需的糖類、有機和無機含有氮素的化合物、無機鹽等一些微量元素以及其它營養(yǎng)物質溶解在水中作為培養(yǎng)基，滅菌后接入菌種，通入無菌空氣并加以攪拌，提供食用菌菌體呼吸代謝所需要的氧氣，并控制適宜的外界條件，進行菌絲大量培養(yǎng)繁殖的過程。工業(yè)化大規(guī)模的發(fā)酵培養(yǎng)即為發(fā)酵生產，亦稱深層培養(yǎng)或沉沒培養(yǎng)。工業(yè)化發(fā)酵生產必需采用發(fā)酵罐，而實驗室中發(fā)酵培養(yǎng)多采用三角瓶。得到的發(fā)酵液中含有菌體、被菌體分解及未分解的營養(yǎng)成分、菌體產生的代謝產物。發(fā)酵液直接供作藥用或供分離提取，也可以作液體菌種。液體發(fā)酵技術的發(fā)展簡史液體深層發(fā)酵技術這一概念是20世紀40年代由美國弗吉尼亞大學生物工程專家ElmerL，設計出培養(yǎng)微生物系統(tǒng)的生物反應器，成為該項技術的創(chuàng)始人。據資料報道，液體深層發(fā)酵技術應用于食藥用菌方面的研究始于美國。1948年，用深層發(fā)酵來培養(yǎng)蘑菇(Agaricuscampestris)菌絲體，并首先提出了用液體發(fā)酵來培養(yǎng)蕈菌的菌絲體。從此食藥用菌的發(fā)酵生產在世界范圍內興起；1953年，美國的博士用廢苷汁深層培養(yǎng)了野蘑菇(Agaricusarvensis)；1958年第一個用發(fā)酵罐培養(yǎng)了羊肚菌(Morchellaesculenta)。從此，食藥用菌的生產漸漸跨入了大規(guī)模工業(yè)化生產的領域。日本的杉森恒武等于1975、1977年用1%的有機酸和%的酵母膏組成液體培養(yǎng)基，取得了大量香菇菌絲體。我國是在1958年開始研究蘑菇、側耳等的深層發(fā)酵的。1963年羊肚菌液體發(fā)酵開始工業(yè)化生產試驗。自此以后，大規(guī)模采用液態(tài)發(fā)酵生產食藥用菌逐漸展開。當時主要研究靈芝(Ganodermalucidum)、蜜環(huán)菌(Armillariellamellea)、銀耳(Tremellafuciformis)等的液體發(fā)酵應用于醫(yī)藥工業(yè)。70年代開始研究香菇(Lentinulaedodes)、冬蟲夏草(Cordycepssinensis)、黑木耳(Auriculariaauricula)、金針菇(Flammulinavelutipes)、猴頭(Hericiumerinaceus)、草菇(Volvariellavolvacea)等的液體發(fā)酵。2液體發(fā)酵培養(yǎng)的特點原料來源廣泛，價格低廉食藥用菌的液體培養(yǎng)所需的碳源可用工業(yè)葡萄糖、工業(yè)淀粉及山芋粉等；氮源可采用黃豆餅粉、蠶蛹粉、麩皮粉等。為了降低成本，通常還取用部分工業(yè)廢水為代用品，如糖蜜廢母液、木材水解液、各種大豆深加工廢水、玉米深加工廢水及淀粉廢水等，原料來源相當廣泛。菌絲體生長快速在液體培養(yǎng)中，液體培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分分布均勻，有利于菌類營養(yǎng)體的充分接觸和吸收。菌絲細胞能在反應器內處于最適溫度、pH、氧氣和碳氮比的條件下生長，能及時排放呼吸作用產生的代謝廢氣，因此新陳代謝旺盛，菌絲生長分裂迅速，能在短時間內積累大量的菌絲體和多糖、多肽等具有生理活性的代謝產物。生產周期短通過食藥用菌液體發(fā)酵培養(yǎng)獲得大量的菌絲體和生理活性物質一般僅需要2-7天的時間，且菌齡整齊，而固體培養(yǎng)需要30-60天。能有效降低菌種污染率液體菌種接入固體培養(yǎng)料時，具有流動快，易分散、發(fā)菌點多、萌發(fā)快等特點，能有效地降低袋栽食用菌在接種過程中的污染。工廠化生產、無季節(jié)性生產中的食用菌液體發(fā)酵是在發(fā)酵罐內、控制最佳條件來培養(yǎng)菌體的，因此不受季節(jié)性限制。而固體培養(yǎng)往往需要有很大的培養(yǎng)空間，條件難以控制，且受季節(jié)影響較大3食藥用菌液體發(fā)酵的培養(yǎng)基在食藥用菌的液體培養(yǎng)中，影響發(fā)酵成敗的關鍵因素有兩個：第一是菌種，第二是培養(yǎng)基。優(yōu)良的培養(yǎng)基應該具備以下特點：①目的物產生率高；②產生目的物的菌絲體生長良好，發(fā)酵周期短；③培養(yǎng)基成本低、原料來源廣；④培養(yǎng)基對目的物的提取干擾少，目的物后處理工藝簡單、得率高。液體培養(yǎng)基的組成根據培養(yǎng)基中組成的不同，可分為天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。天然培養(yǎng)基的組成均為天然有機物。合成培養(yǎng)基則是采用—些已知化學成分的營養(yǎng)物質作培養(yǎng)基。在生產上，還根據工藝將培養(yǎng)基分為孢子培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基及發(fā)酵培養(yǎng)基。但無論如何劃分，每一種培養(yǎng)基的組成中都離不開碳、氮、無機鹽、微量元素、維生素和生長素等。(一)碳源碳源的含義為營養(yǎng)物化學成分中必需含有大量的“C”元素，即含有“碳水化合物”。碳源主要用于供應菌株生命活動所需要的能量，構成菌體細胞及代謝產物，是食藥用菌液體培養(yǎng)的主要營養(yǎng)成分。碳源包括糖類(單糖、雙糖、多糖)、脂肪和某些有機酸。雙糖及多糖首先由菌體產生的酶分解為單糖后再被利用。食藥用菌利用單糖、一般通過有氧分解、最終產物是二氧化碳、水和能量。為降低培養(yǎng)基成本，藥用真菌的發(fā)酵常用—些粗糧、雜糧或糧食加工之后的下腳料作為原料，如玉米粉、蔗糖糖蜜、甜菜糖蜜等。還可利用野生植物淀粉的水解產物代替糧食作發(fā)酵原料。不同的菌種對碳源種類的要求及利用亦不—樣，但絕大多數(shù)藥用真菌都能利用葡萄糖、麥芽糖、蔗糖和淀粉。實際生產時，首先要通過實驗了解菌株所能利用的幾種碳源是什么，然后選出利用最好、來源較廣、成本較低的原料作碳源。必須指出，同一菌種在固體培養(yǎng)與液體培養(yǎng)時，所能利用的碳源是不同的。例如香菇、金針菇、鳳尾菇等在固體培養(yǎng)時可利用木質素、半纖維素及纖維素作為碳源，而在液體培養(yǎng)時就不宜用這些碳源。（二）氮源氮源指營養(yǎng)物化學成分中必需大量含“N”的物質。氮源主要用于構成菌體細胞物質和含氮代謝物，是食藥用菌液體培養(yǎng)的主要營養(yǎng)成分。常用的氮源可分為有機氮源和無機氮源兩大類。黃豆餅粉、花生餅粉、棉籽餅粉、玉米漿、蛋白胨、酵母粉、魚粉、蠶蛹粉、麥麩、酒糟、菌絲體等屬于有機氮源；氨水、硫酸銨、尿素、硝酸銨、硝酸鈉、磷酸氫二銨、氯化銨等為無機氮源。有機氮源除含有豐富的蛋白質、多肽和游離氨基酸之外，往往還含有少量糖、脂肪、微量元素及維生素、生長素等。對絕大多數(shù)食藥用菌，有機氮源比無機氮源更適合菌體的生長。某些菌則只能利用銨鹽和硝酸鹽。一般，銨鹽能較快被菌體利用，NH4+進入細胞中可直接摻入有機化合物中；而NO3-被細胞吸收后，先還原成NH4+，才用于合成有機化合物。NH4+或NO3-被吸收后．會引起培養(yǎng)基酸化或堿化，因此在配制這類培養(yǎng)基時，應在培養(yǎng)基中加入少量緩沖物質。不同菌種對氮源種類的要求及利用程度亦不一致，因此在確定培養(yǎng)基前應在實驗中設法找到菌種所能利用的幾種較好氮源及最佳氮源，然后根據成本、原料來源是否容易等因素確定氮源組成。同—菌種在固體培養(yǎng)及液體培養(yǎng)時，可利用的最佳氮源不同三）碳、氮比(C/N)碳、氮比指碳源及氮源在培養(yǎng)基中的含量比。構成菌絲細胞的碳、氮比通常是：8~12:1。由于菌絲生長過程中，一般需50%的碳源作為能量供給菌絲呼吸，另50%的碳源組成菌體細胞。因此培養(yǎng)基中理想碳、氮比的理論值為16~24:1。多數(shù)食藥用菌的固體培養(yǎng)，在營養(yǎng)菌絲生長階段，含氮量以%~%為宜，即C:N＝20:1；在子實體生長階段以%~%為宜，即C:N=30~40:1為好。因此，降低培養(yǎng)基中的氮源是產生子實體的前體。但在液體培養(yǎng)中就不存在這個問題，以菌絲增殖為目的的培養(yǎng)，通常碳、氮比以20:1為宜。雖然藥用真菌的液體培養(yǎng)一般要求較高的碳與氮比，即C:N＝20:1左右生長較好，但許多菌種也能在較寬的碳、氮比范圍內生長。不同的菌種所要求合適的碳、氮比，可通過實驗求得。（四）無機鹽與微量元素許多無機鹽及微量元素對菌種的生理過程的影響與其濃度有關。不同的菌種，對無機鹽及微量元素要求的最適濃度也不同。1．磷磷是細胞中核酸、核蛋白等重要物質的組成部分，又是許多輔酶(或輔基)高能磷酸鍵的組成部分。磷是食藥用菌液體發(fā)酵不可缺少的物質，常加入磷酸二氫鉀以提供磷，加入量大約為%~%。2．鎂鎂在細胞中起著穩(wěn)定核蛋白、細胞膜和核酸的作用，而且是—些重要酶的活化劑，是藥用真菌液體培養(yǎng)中不可缺少的營養(yǎng)成分。一般通過加入硫酸鎂以提供鎂，濃度通常是%~%。3．鉀、鈣、鈉鉀不參與細胞結構物質的構成，但控制原生質的膠態(tài)和細腦膜的透性。鈣離子與細胞透性有關。鈉離子能維持細胞滲透壓，鈉離子可以部分代替鉀離子的作用。三種物質需求量甚微，若采用天然培養(yǎng)基，可不必另加。4．硫、鐵硫是菌體細胞蛋白質的組成部分(胱氨酸、半胱氨酸及蛋氨酸中皆含硫)，鐵是細胞色素、細胞色素氧化酶和過氧化氫酶的組成部分，亦是菌體有氧代謝中不可缺少的元素。5．鋅、錳、鈷、銅鋅、錳、鈷等離子是某些酶的輔基或激活劑。銅是多元酚氧化酶的活性基。在配制培養(yǎng)基時應注意，鎂和磷的添加不宜過多，否則會帶來危害。菌體對鋅、錳、鈷、銅等微量元素的需求量甚少，一般天然有機原料中均有，不必另加。碳酸鈣本身不溶于水，但可以調節(jié)培養(yǎng)其中的酸堿度。磷酸鹽與碳酸鈣不宜混合滅菌，否則會形成不溶于水的磷酸鹽，使可溶性的磷酸鹽濃度大大降低。（五）維生素與生長素維生素在細胞中作為輔酶的成分，具有催化功能。大多數(shù)藥用真菌的培養(yǎng)都與B族維生素有關，而與維生素A、K關系不大。水溶性維生素對菌體的影響比脂溶性維生素大。維生素B1是目前已知對絕大多數(shù)藥用真菌生長有利的維生素。其適宜濃度在50~1000μg/L之間。由于藥用真菌對維生素的需求量甚微，因此在使用天然有機原料為培養(yǎng)基時—般不需另加。有時也可加入少量維生素B1。生長素包括三十烷醇、吲哚乙酸、赤霉素、α-萘乙酸、激動素等，在植物細胞的組織培養(yǎng)中用的較多。在食用菌的固體栽培中，目前還用一些菌絲生長促進劑及子實體增產促進劑等．但在食藥用真菌的液體培養(yǎng)中應用較少。六)化合物利用食藥用菌具有生物轉化的特點，在培養(yǎng)基中加入某種化合物，經過生物合成后成為我們所需要的化合物。在合成甾體激素(如可的松)時，利用某些食藥用真菌進行氧化，往往能在專一位置上導入所需要的含氧基團，大大縮減了合成步驟，并加快合成速度。利用藥用真菌的生物氧化作用合成藥物，是一廣闊的應用領域。這一應用的前提是必須搞清藥用真菌的生物合成特性及生物轉化的能力。具有生物合成能力的藥用真菌，目前已知的多是些黑曲霉、黃曲霉、華根霉及酵母菌等，而非一些能產生子座及子實體的子囊菌或擔子菌。這方面的工作還有待深入研究。在液體培養(yǎng)基中加入—些藥性基質，經過藥用真菌發(fā)酵后觀察藥性基質的變化，這是一個新開拓的講究領域，其發(fā)展前景十分遠大。4食藥用菌的搖瓶培養(yǎng)藥用真菌的液體培養(yǎng)在實驗室中進行，一般通過搖瓶培養(yǎng)實現(xiàn)。即將藥用真菌試管母種接入滅過菌的三角瓶培養(yǎng)液中，然后置于往復式或旋轉式搖床上培養(yǎng)。經過搖床培養(yǎng)的菌絲體呈球狀、絮狀等多種形態(tài)。培養(yǎng)液可呈黏稠狀，清液狀等狀態(tài)，并可有清香味或其他異味。因菌液中有菌株發(fā)酵產生的次生代謝產物，可呈不同顏色。在實驗室中進行搖瓶培養(yǎng)可摸索菌株液體發(fā)酵的適宜生長條件及生理生化變化等。工廠化生產時，先進行搖瓶培養(yǎng)作為接入種子罐的菌種。搖瓶培養(yǎng)的菌絲體也可作為液體菌種接入固體培養(yǎng)料中。搖瓶培養(yǎng)的有關參數(shù)：影響搖瓶培養(yǎng)發(fā)酵質量的諸因素有：培養(yǎng)溫度、搖床的振蕩頻率、瓶子的裝料系數(shù)，pH值、菌齡、接種量、培養(yǎng)液的粘度、光照等。(一)溫度藥用真菌菌絲的增殖及次級謝產物的產生都在各種酶的催化下進行，而酶的催化反應需要適宜的溫度，不同的菌種有不同的適宜溫度。絕大多數(shù)藥用真菌菌絲生長的適宜溫度在22~30℃的范圍內。以產生次級代謝產物為目的培養(yǎng)，其最適溫度出可能與菌絲生長的最適溫度不同。(二)搖床的振蕩頻率和瓶子的裝料系數(shù)食藥用菌的液體培養(yǎng)使用的搖床有兩種：旋轉式和往復式。旋轉式搖床的偏心距可不同，轉速可調或不可調；往復式搖床的振幅可不同，其每分鐘的往返次數(shù)（震蕩頻率）多是固定的。搖床的振蕩頻率和瓶子的裝料系數(shù)關系到搖瓶中培養(yǎng)基的溶氧量，另外震蕩頻率還影響菌絲體所受的機械刺激。食藥用菌的液體培養(yǎng)多為好氧發(fā)酵，要求有足夠的氧氣，因此要求有較高的搖床震蕩頻率。然而振蕩頻率過快又會引起培養(yǎng)液的飛濺，弄濕棉花塞。所以振蕩頻率要有一定的限度。(三)pH值食藥用真菌的液體培養(yǎng)時，要求有合適的pH值(即氫離子濃度)，這是因為：1．培養(yǎng)基中pH值的變化，會影響到細胞內pH值的變化，而細胞內pH值合適與否，會影響細胞內酶的活性，大多數(shù)酶催化反應的最適pH值為4~8。2．pH值對一些微量元素的利用有影響一些金屬離子形成的復合物在某pH值下是不溶的。如鎂離子與磷酸在酸性條件下呈游離狀態(tài)，pH升高會形成不可溶的復合物，不能被菌體吸收利用。鐵離子在堿性培養(yǎng)基中形成不可溶的復合物。鈣與鋅離子也有類似現(xiàn)象。3．pH值影響細胞的滲透性在酸性條件下，細胞質膜被氫離子飽和，限制了陽離子的通行；在堿性條件下，細胞質膜被氫氧根離子飽和，限制了陰離子的通行。大多數(shù)藥用真菌的液體發(fā)酵，多采用自然pH或控制在pH值~的范圍內。如果需要對培養(yǎng)液的pH進行調節(jié)時?？刹捎玫蜐舛鹊臍溲趸c及鹽酸進行。菌液的pH值是各種生化反應的綜合結果?！惆l(fā)酵培養(yǎng)到了中期，pH值開始下降；到了發(fā)酵后期，有的菌種菌液中pH會回升。發(fā)酵過程中由于加糖太多而又供氧不足時，碳源氧化不完全導致有機酸積累，引起pH下降。一些無機鹽，如碳酸銨被菌絲利用后．會引起pH下降。葡萄糖作為碳源時，因丙酮酸迅速積累，會引起pH下降；而以乳糖為碳源時因乳糖的吸收較緩慢，pH值下降較慢。因此，測定不同菌齡時培養(yǎng)液中的pH值，對了解菌絲的生長、代謝、生理生化反應等是一重要因素。要精確測定pH值，可用酸度計進行，也可用pH試紙先進行粗測。搖瓶培養(yǎng)的pH測定必須將菌液倒出測定。(四)菌齡所謂菌齡就是指菌株液體培養(yǎng)的時齡、是菌種接入培養(yǎng)液后開始計算的累積發(fā)酵時間。食藥用菌的液體發(fā)酵也要經歷延滯期、生長期、穩(wěn)定期及衰亡期等。不同的菌株，隨著菌齡的增加，這幾個時期的劃分也不一樣(五)接種量搖瓶培養(yǎng)的接種量指一級搖瓶種子對二級搖瓶所接入菌液量與培養(yǎng)液的比值。如對二級搖瓶1000ml的培養(yǎng)液中接人50ml的菌液，稱接種量為5%