酶聯(lián)免疫吸附雙抗體夾心法課件

酶聯(lián)免疫吸附雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附雙抗體夾心法1優(yōu)選酶聯(lián)免疫吸附雙抗體夾心法優(yōu)選酶聯(lián)免疫吸附雙抗體夾心法一、實驗目的

1掌握酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）的原理2熟悉酶聯(lián)免疫吸附實驗的操作方法一、實驗目的1掌握酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELI二、實驗原理基礎知識

1971年瑞典學者Engvail和Perlmann,荷蘭學者Van

Weerman和Schuurs分別報道將免疫技術(shù)發(fā)展為檢測體液中微量物質(zhì)的固相免疫測定方法，即酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)。ELISA現(xiàn)在已成為目前分析化學領(lǐng)域中的前沿課題，它是一種特殊的試劑分析方法，是在免疫酶技術(shù)(immunoenzymatictechniques)的基礎上發(fā)展起來的一種新型的免疫測定技術(shù)。二、實驗原理基礎知識甲胎蛋白（αfetoprotein，AFP）

一種含4%碳水化合物的單鏈糖蛋白，分子量70KD，半衰期5天，由592個氨基酸殘基的單肽鏈組成?；蛭挥诘?對染色體4q1124q21區(qū)域，由15個外顯子和14個內(nèi)含子組成，屬于血清中一種α球蛋白，是一種胚胎性相關(guān)蛋白。自1963年發(fā)現(xiàn)以來，作為一種腫瘤特異性抗原已廣泛應用于臨床。它對原發(fā)性肝癌的早期診斷具有重要意義，同時對肝細胞癌的鑒別診斷，流行病學調(diào)查和理論研究都很有價值。甲胎蛋白（αfetoprotein，AFP）試驗中哪些因素可能會對實驗結(jié)果造成影響？加底物四甲基聯(lián)苯胺(TMB)2熟悉酶聯(lián)免疫吸附實驗的操作方法(八)試驗的重復性（精確度）試驗中哪些因素可能會對實驗結(jié)果造成影響？(2)四甲基聯(lián)苯胺(TMB)：TMB是一種脂溶性較強的基團，由于這種高度的脂溶性，使其易形成多聚體，在HRP活性部位產(chǎn)生粗大的、深藍色沉淀物反應后呈藍色。辣根過氧化物酶(HRP)辣根過氧化物酶(HRP)由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應的結(jié)果，使測定方法達到很高的敏感度。甲胎蛋白（αfetoprotein，AFP）辣根過氧化物酶(HRP)待測血清、抗-AFP-L3抗體、封閉蛋白溶液、辣根過氧化物酶（HRP）、底物四甲基聯(lián)苯胺（TMB)、顯色液、終止液……原理一

ELISA的基礎是抗原（或抗體）的固相化及抗原（或抗體）的酶標記。結(jié)合在固相載體表面的抗原（或抗體）仍保持其免疫學活性。原理二

抗原(或抗體)可通過共價鍵與酶連接形成酶結(jié)合物，而此種酶結(jié)合物仍能保持其免疫學和酶學活性。原理三

固相上的酶量與標本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應的結(jié)果，使測定方法達到很高的敏感度。ELISA的三條基本原理試驗中哪些因素可能會對實驗結(jié)果造成影響？原理一ELISA的三雙抗體夾心法方法

用已知抗體包被，加入待測抗原，再加酶標抗體，加底物顯色。

固相(包被)抗體Ab+樣品(抗原Ag)+酶標抗體Ab*→Ab-Ag-Ab*+底物(TMB)→顯色應用這種方法欲測的抗原必須有兩個可以與抗體結(jié)合的部位，因為其一端要與包被于固相載體上的抗體作用，而另一端則要與酶標記特異性抗體作用。雙抗體夾心法方法雙抗體夾心法圖示1、已知抗體包被于載體表面3、加酶標抗體與抗原結(jié)合4、加酶作用的底物產(chǎn)生較深藍色2、加腫瘤患者血清與抗體結(jié)合4、加酶作用的底物無顏色或藍色很淡洗滌洗滌洗滌洗滌雙抗體夾心法測抗原1、已知抗體包被于載體表面2、加健康人血清與抗體結(jié)合3、加酶標抗體無（少）抗原結(jié)合+-YYYEYEYEYYEYEYEYYYYEYEYEYYYYYYYYYYYYYYYYYY雙抗體夾心法圖示1、已知抗體包3、加酶標抗體4、加酶作用的底三、實驗儀器&試劑儀器

全自動酶標儀、全自動酶標洗板機三、實驗儀器&試劑儀器試劑

待測血清、抗-AFP-L3抗體、封閉蛋白溶液、辣根過氧化物酶（HRP）、底物四甲基聯(lián)苯胺（TMB)、顯色液、終止液……OR:甲胎蛋白（AFP）定量測定試劑盒（酶聯(lián)免疫法）試劑四、實驗步驟獲得AFP未標定抗體將AFP抗體與固相載體連接形成固相抗體洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)加入封閉蛋白溶液以封閉載體表面殘留的蛋白結(jié)合位點洗滌并除去未結(jié)合的封閉蛋白加血清形成固相抗體－抗原復合物四、實驗步驟獲得AFP未標定抗體將AFP抗體與固相洗滌除去未洗滌除去其他未結(jié)合的物質(zhì)加HRP酶標抗體生成抗體—待測抗原—酶標記抗體的復合物徹底洗滌未結(jié)合的HRP酶標抗體加底物四甲基聯(lián)苯胺(TMB)進行酶催化反應根據(jù)顏色反應的程度進行AFP的定量測定洗滌除去其他加HRP酶標抗體生成徹底洗滌未結(jié)合加底物四甲基聯(lián)詳細步驟1.標準品的稀釋與加樣：在酶標包被板上設標準品孔10孔，在第一、第二孔中分別加標準品100μl，然后在第一、第二孔中加標準品稀釋液50μl，混勻；然后從第一孔、第二孔中各取100μl分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標準品稀釋液50μl，混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl棄掉，再各取50μl分別加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分別加標準品稀釋液50ul，混勻；混勻后從第五、第六中各取50μl分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加標準品稀釋液50μ，混勻后從第七、第八孔中分別取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分別加標準品稀釋液50μl，混勻后從第九第十孔中各取50μl棄掉。（稀釋后各孔加樣量都為50μl，濃度分別為（1800ng/L，1200ng/L，600ng/L，300ng/L，150ng/L）。詳細步驟1.標準品的稀釋與加樣：在酶標包被板上設標準品孔12.加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl（樣品最終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。3.溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。4.配液：將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用5.洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干。6.加酶：每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。7.溫育：操作同3。8.洗滌：操作同5。9.顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘.10.終止：每孔加終止液50μl，終止反應（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。11.測定：以空白空調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。測定應在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行。2.加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余辣根過氧化物酶(HRP)常用底物：(1)鄰苯二胺(OPD)：反應顯橙黃色，應避光，致癌性。(2)四甲基聯(lián)苯胺(TMB)：TMB是一種脂溶性較強的基團，由于這種高度的脂溶性，使其易形成多聚體，在HRP活性部位產(chǎn)生粗大的、深藍色沉淀物反應后呈藍色。酶反應用HCL或H2SO4終止后，TMB產(chǎn)物由藍色呈黃色，最適吸收波長為450nm。辣根過氧化物酶(HRP)常用底物：五、結(jié)果分析以標準物的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上繪出標準曲線，根據(jù)樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。五、結(jié)果分析以標準物的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標六、思考題試驗中哪些因素可能會對實驗結(jié)果造成影響？（一）固相載體（二）抗原（三）試驗樣品（四）結(jié)合物

(五）洗滌劑與稀釋劑（六）底物（七）作用時間

(八)試驗的重復性（精確度）（九）對使用儀器要求六、思考題試驗中哪些因素可能會對實驗結(jié)果造成影響？（一）固相身體健康，學習進步！身體健康，酶聯(lián)免疫吸附雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附雙抗體夾心法19優(yōu)選酶聯(lián)免疫吸附雙抗體夾心法優(yōu)選酶聯(lián)免疫吸附雙抗體夾心法一、實驗目的

1掌握酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）的原理2熟悉酶聯(lián)免疫吸附實驗的操作方法一、實驗目的1掌握酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELI二、實驗原理基礎知識

1971年瑞典學者Engvail和Perlmann,荷蘭學者Van

Weerman和Schuurs分別報道將免疫技術(shù)發(fā)展為檢測體液中微量物質(zhì)的固相免疫測定方法，即酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)。ELISA現(xiàn)在已成為目前分析化學領(lǐng)域中的前沿課題，它是一種特殊的試劑分析方法，是在免疫酶技術(shù)(immunoenzymatictechniques)的基礎上發(fā)展起來的一種新型的免疫測定技術(shù)。二、實驗原理基礎知識甲胎蛋白（αfetoprotein，AFP）

一種含4%碳水化合物的單鏈糖蛋白，分子量70KD，半衰期5天，由592個氨基酸殘基的單肽鏈組成?；蛭挥诘?對染色體4q1124q21區(qū)域，由15個外顯子和14個內(nèi)含子組成，屬于血清中一種α球蛋白，是一種胚胎性相關(guān)蛋白。自1963年發(fā)現(xiàn)以來，作為一種腫瘤特異性抗原已廣泛應用于臨床。它對原發(fā)性肝癌的早期診斷具有重要意義，同時對肝細胞癌的鑒別診斷，流行病學調(diào)查和理論研究都很有價值。甲胎蛋白（αfetoprotein，AFP）試驗中哪些因素可能會對實驗結(jié)果造成影響？加底物四甲基聯(lián)苯胺(TMB)2熟悉酶聯(lián)免疫吸附實驗的操作方法(八)試驗的重復性（精確度）試驗中哪些因素可能會對實驗結(jié)果造成影響？(2)四甲基聯(lián)苯胺(TMB)：TMB是一種脂溶性較強的基團，由于這種高度的脂溶性，使其易形成多聚體，在HRP活性部位產(chǎn)生粗大的、深藍色沉淀物反應后呈藍色。辣根過氧化物酶(HRP)辣根過氧化物酶(HRP)由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應的結(jié)果，使測定方法達到很高的敏感度。甲胎蛋白（αfetoprotein，AFP）辣根過氧化物酶(HRP)待測血清、抗-AFP-L3抗體、封閉蛋白溶液、辣根過氧化物酶（HRP）、底物四甲基聯(lián)苯胺（TMB)、顯色液、終止液……原理一

ELISA的基礎是抗原（或抗體）的固相化及抗原（或抗體）的酶標記。結(jié)合在固相載體表面的抗原（或抗體）仍保持其免疫學活性。原理二

抗原(或抗體)可通過共價鍵與酶連接形成酶結(jié)合物，而此種酶結(jié)合物仍能保持其免疫學和酶學活性。原理三

固相上的酶量與標本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應的結(jié)果，使測定方法達到很高的敏感度。ELISA的三條基本原理試驗中哪些因素可能會對實驗結(jié)果造成影響？原理一ELISA的三雙抗體夾心法方法

用已知抗體包被，加入待測抗原，再加酶標抗體，加底物顯色。

固相(包被)抗體Ab+樣品(抗原Ag)+酶標抗體Ab*→Ab-Ag-Ab*+底物(TMB)→顯色應用這種方法欲測的抗原必須有兩個可以與抗體結(jié)合的部位，因為其一端要與包被于固相載體上的抗體作用，而另一端則要與酶標記特異性抗體作用。雙抗體夾心法方法雙抗體夾心法圖示1、已知抗體包被于載體表面3、加酶標抗體與抗原結(jié)合4、加酶作用的底物產(chǎn)生較深藍色2、加腫瘤患者血清與抗體結(jié)合4、加酶作用的底物無顏色或藍色很淡洗滌洗滌洗滌洗滌雙抗體夾心法測抗原1、已知抗體包被于載體表面2、加健康人血清與抗體結(jié)合3、加酶標抗體無（少）抗原結(jié)合+-YYYEYEYEYYEYEYEYYYYEYEYEYYYYYYYYYYYYYYYYYY雙抗體夾心法圖示1、已知抗體包3、加酶標抗體4、加酶作用的底三、實驗儀器&試劑儀器

全自動酶標儀、全自動酶標洗板機三、實驗儀器&試劑儀器試劑

待測血清、抗-AFP-L3抗體、封閉蛋白溶液、辣根過氧化物酶（HRP）、底物四甲基聯(lián)苯胺（TMB)、顯色液、終止液……OR:甲胎蛋白（AFP）定量測定試劑盒（酶聯(lián)免疫法）試劑四、實驗步驟獲得AFP未標定抗體將AFP抗體與固相載體連接形成固相抗體洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)加入封閉蛋白溶液以封閉載體表面殘留的蛋白結(jié)合位點洗滌并除去未結(jié)合的封閉蛋白加血清形成固相抗體－抗原復合物四、實驗步驟獲得AFP未標定抗體將AFP抗體與固相洗滌除去未洗滌除去其他未結(jié)合的物質(zhì)加HRP酶標抗體生成抗體—待測抗原—酶標記抗體的復合物徹底洗滌未結(jié)合的HRP酶標抗體加底物四甲基聯(lián)苯胺(TMB)進行酶催化反應根據(jù)顏色反應的程度進行AFP的定量測定洗滌除去其他加HRP酶標抗體生成徹底洗滌未結(jié)合加底物四甲基聯(lián)詳細步驟1.標準品的稀釋與加樣：在酶標包被板上設標準品孔10孔，在第一、第二孔中分別加標準品100μl，然后在第一、第二孔中加標準品稀釋液50μl，混勻；然后從第一孔、第二孔中各取100μl分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標準品稀釋液50μl，混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl棄掉，再各取50μl分別加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分別加標準品稀釋液50ul，混勻；混勻后從第五、第六中各取50μl分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加標準品稀釋液50μ，混勻后從第七、第八孔中分別取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分別加標準品稀釋液50μl，混勻后從第九第十孔中各取50μl棄掉。（稀釋后各孔加樣量都為50μl，濃度分別為（1800ng/L，1200ng/L，600ng/L，300ng/L，150ng/L）。詳細步驟1.標準品的稀釋與加樣：在酶標包被板上設標準品孔12.加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl（樣品最終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。3.溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。4.配液：將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用5.洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干。6.加酶：每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。7.溫育：操作同3。