谷氨酸發(fā)酵菌總結(jié)課件

氨基酸發(fā)酵工藝學(xué)3谷氨酸生產(chǎn)菌的特征、育種及擴(kuò)大培養(yǎng)氨基酸發(fā)酵工藝學(xué)3谷氨酸生產(chǎn)菌的特征、育種及擴(kuò)大培養(yǎng)1關(guān)鍵詞提示菌落形態(tài)、菌體形態(tài)重要生理特征育種策略谷氨酸生產(chǎn)菌種制備關(guān)鍵詞提示菌落形態(tài)、菌體形態(tài)2谷氨酸發(fā)酵菌總結(jié)課件3第一節(jié)谷氨酸生產(chǎn)菌棒狀桿菌科(Corynebacteriaceae)

棒桿菌屬北京棒桿菌C.pekinenseCorynebacterium鈍齒棒桿菌C.crenatum谷氨酸棒桿菌C.glutamicum百合棒桿菌C.lilium美棒桿菌C.callunae力士棒桿菌C.herculis小桿菌屬嗜氨小桿菌MicrobacteriumammoniaphilumMicrobacterium節(jié)桿菌屬球形節(jié)桿菌ArthrobacterglobiformisArthrobacter短桿菌科(Brevibacteriaceae)

短桿菌屬乳糖發(fā)酵短桿菌B.lactofermentumBrevibacterium叉開(kāi)短桿菌B.divaricatum黃色短桿菌B.flvum硫殖短桿菌B.thiogenitalis產(chǎn)氨短桿菌B.ammoniagenes第一節(jié)谷氨酸生產(chǎn)菌棒狀桿菌科(Corynebacteria4特征1.1棒狀桿菌屬(Corynebacterium)直到微彎的桿菌，一端膨大呈棒狀，折斷分裂形成“八”字形或柵狀排列。G+1.2短桿菌屬(Brevibacterium)短的不分枝直桿菌。G+1.3小桿菌屬(Microbacterium)桿狀，與棒桿菌相似。G+1.4節(jié)桿菌屬(Arthrobacterium)培養(yǎng)過(guò)程中，球菌桿菌，桿菌球菌。G+G-,G-G+特征1.1棒狀桿菌屬(Corynebacterium)5Corynebacterium：放線菌目中一屬革蘭染色陽(yáng)性、不運(yùn)動(dòng)、非抗酸性、無(wú)芽孢的桿菌。菌體直形、彎形或多形，常呈棒狀。一般不運(yùn)動(dòng)。好氧或兼性厭氧，化能有機(jī)營(yíng)養(yǎng)型。進(jìn)行氧化性或發(fā)酵性代謝。過(guò)氧化氫酶陽(yáng)性。G+Cmo1%值為51～59。Corynebacterium：放線菌目中一屬革蘭染色陽(yáng)性、6谷氨酸棒桿菌C.glutamicum谷氨酸棒桿菌C.glutamicum7基因特征GC含量類(lèi)E.coli，分類(lèi)屬于革蘭氏陽(yáng)性菌策略： 全序列測(cè)序 注釋蛋白信息 分析異同 克隆谷氨酸合成相關(guān)基因基因特征GC含量類(lèi)E.coli，分類(lèi)屬于革蘭氏陽(yáng)性菌8谷氨酸生產(chǎn)菌株形態(tài)及生理共性細(xì)胞為球形、棒形或短桿形革蘭氏染色陽(yáng)性，無(wú)芽孢，無(wú)鞭毛，不能運(yùn)動(dòng)都是需氧型微生物都是生物素缺陷型微生物脲酶強(qiáng)陽(yáng)性不分解淀粉、纖維素、油脂、酪蛋白以及明膠等發(fā)酵中菌體發(fā)生明顯的形態(tài)變化，同時(shí)發(fā)生細(xì)胞膜滲透性的變化CO2固定反應(yīng)酶系活力強(qiáng)異檸檬酸裂解酶活力欠缺或微弱，乙醛酸循環(huán)弱α－酮戊二酸氧化能力缺失或微弱還原型輔酶Ⅱ進(jìn)入呼吸鏈能力弱檸檬酸合成酶、烏頭酸酶、異檸檬酸脫氫酶以及谷氨酸脫氫酶活力強(qiáng)能利用醋酸，不能利用石蠟具有向環(huán)境中泄漏谷氨酸的能力不分解利用谷氨酸，并能耐高濃度的谷氨酸，產(chǎn)谷氨酸5%以上谷氨酸生產(chǎn)菌株形態(tài)及生理共性細(xì)胞為球形、棒形或短桿形9國(guó)內(nèi)谷氨酸生產(chǎn)主要菌株天津短桿菌(T613)及其突變株鈍齒棒桿菌(AS1.542)用其突變株北京棒桿菌(AS1.299)及其突變株國(guó)內(nèi)谷氨酸生產(chǎn)主要菌株天津短桿菌(T613)及其突變株101北京棒桿菌(AS1299)的形態(tài)和生理特征(1)形態(tài)特征

短桿至小棒狀，有時(shí)微彎曲，兩端鈍圓，不分枝，呈多種形態(tài)。單個(gè)、成對(duì)及“V”字形排列。G+。胞內(nèi)有橫隔。不運(yùn)動(dòng)。無(wú)芽孢。1北京棒桿菌(AS1299)的形態(tài)和生理特征11北京棒桿菌(AS1299)的形態(tài)和生理特征(2)培養(yǎng)特征★普通肉汁瓊脂斜面：中間劃直線培養(yǎng)，中度生長(zhǎng)，菌胎線狀，24h白色，48h淡黃色，顏色逐漸加深，表面光滑、濕潤(rùn)、有光澤，無(wú)黏性，無(wú)水溶性色素?！锲胀ㄈ庵傊桨澹壕鋱A形，24h白色，48h淡黃色，中央隆起，表面濕潤(rùn)、光滑，有光澤，邊緣整齊且呈半透明狀，無(wú)黏性，不產(chǎn)生水溶性色素?！锲胀ㄈ庵后w培養(yǎng)：稍渾濁，有時(shí)表面沿管壁呈薄環(huán)狀，搖動(dòng)培養(yǎng)管，底部有粒狀沉渣?！锲胀ㄈ庵傊┐蹋罕砻姘l(fā)育良好，沿穿刺線生長(zhǎng)弱，且不向四周擴(kuò)散?！锩髂z平板及明膠穿刺：菌落形狀不規(guī)則，扁平，邊緣不整齊，淡黃色。穿刺培養(yǎng)時(shí)，沿穿刺線生長(zhǎng)不明顯，表面發(fā)育良好。不液化明膠?！锺R鈴薯塊：培養(yǎng)三周仍不生長(zhǎng)。北京棒桿菌(AS1299)的形態(tài)和生理特征12北京棒桿菌(AS1299)的形態(tài)和生理特征(3)生理特征★對(duì)氧的要求：好氧及兼性厭氧?！锱c溫度的關(guān)系：菌株26~37℃培養(yǎng)生長(zhǎng)良好，不耐高溫，41℃生長(zhǎng)較弱?！飌H的影響：Ph5~10均能生長(zhǎng)，最適pH6~7.5?！镞€原硝酸鹽：反映強(qiáng)烈?！锸锱Ｄ膛囵B(yǎng)：7d后微產(chǎn)堿?！锊凰獾矸??！锊环纸饫w維素?！镫迕冈囼?yàn)：強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)?！锂a(chǎn)酸物質(zhì)的測(cè)定：G、果糖、甘露糖、蔗糖、麥芽糖★生長(zhǎng)因素試驗(yàn)：生物素是必需生長(zhǎng)因素。硫胺素明顯促生長(zhǎng)。北京棒桿菌(AS1299)的形態(tài)和生理特征132鈍齒棒桿菌(AS1542)的形態(tài)和生理特征

(1)形態(tài)特征短桿至棒狀，有時(shí)微彎曲，兩端鈍圓，不分枝。單個(gè)、成對(duì)及“V”字形排列。折斷分裂。G+。胞內(nèi)有橫隔。不運(yùn)動(dòng)。無(wú)芽孢。2鈍齒棒桿菌(AS1542)的形態(tài)和生理特征14鈍齒棒桿菌(AS1542)的形態(tài)和生理特征

(2)培養(yǎng)特征★普通肉汁瓊脂斜面：中間劃直線培養(yǎng)，中度生長(zhǎng)，菌胎線狀，近草黃色，表面濕潤(rùn)、無(wú)光澤，無(wú)黏性，不產(chǎn)生水溶性色素?！锲胀ㄈ庵傊桨澹壕鋱A形，近草黃色，表面濕潤(rùn)、光滑，無(wú)光澤，邊緣頓齒狀，較薄，半透明，無(wú)黏性，不產(chǎn)生水溶性色素。★普通肉汁液體培養(yǎng)：稍渾濁，表面有薄菌膜，底部有較多沉渣?！锲胀ㄈ庵傊┐蹋罕砻婕把卮┐叹€生長(zhǎng)，且不向四周擴(kuò)散?！锩髂z穿刺培養(yǎng)：表面及沿穿刺線生長(zhǎng)。不液化明膠?！锺R鈴薯塊：培養(yǎng)三周仍不生長(zhǎng)。鈍齒棒桿菌(AS1542)的形態(tài)和生理特征15鈍齒棒桿菌(AS1542)的形態(tài)和生理特征

(3)生理特征★對(duì)氧的要求：兼性厭氧。★與溫度的關(guān)系：菌株20~37℃培養(yǎng)生長(zhǎng)良好，不耐高溫，42℃不生長(zhǎng)?！飌H的影響：pH6~9生長(zhǎng)良好，pH10生長(zhǎng)微弱，pH4~5已不能生長(zhǎng)?！镞€原硝酸鹽：反映強(qiáng)烈。★石蕊牛奶培養(yǎng)：7d后微產(chǎn)堿?！锼獾矸??！锊环纸饫w維素?！镫迕冈囼?yàn)：強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)?！锂a(chǎn)酸物質(zhì)的測(cè)定：G、果糖、甘露糖、蔗糖、麥芽糖、水楊苷、七葉靈★生長(zhǎng)因素試驗(yàn)：生物素是必需生長(zhǎng)因子。鈍齒棒桿菌(AS1542)的形態(tài)和生理特征163天津短桿菌(T613)的形態(tài)和生理特征(1)形態(tài)特征典型的短桿狀，有時(shí)微彎曲，兩端稍鈍圓，不分枝。單個(gè)、成對(duì)及“V”字形排列。折斷分裂。G+。不運(yùn)動(dòng)。無(wú)芽孢。3天津短桿菌(T613)的形態(tài)和生理特征17天津短桿菌(T613)的形態(tài)和生理特征(2)培養(yǎng)特征★普通肉汁瓊脂斜面：中間劃直線培養(yǎng)，中度生長(zhǎng)，菌胎線狀、隆起，淺黃色，表面濕潤(rùn)、有光澤，不透明，不產(chǎn)生水溶性色素。★普通肉汁瓊脂平板：菌落圓形，淺黃色，表面濕潤(rùn)、光滑，隆起，邊緣整齊，較薄，半透明，無(wú)黏性，不產(chǎn)生水溶性色素?！锲胀ㄈ庵后w培養(yǎng)：渾濁，沒(méi)有菌蓋，表面沿管壁有一圈菌膜，底部有棉絮狀和粒狀沉渣?！锲胀ㄈ庵傊┐蹋罕砻姘l(fā)育良好，沿穿刺線生長(zhǎng)較弱，且不向四周擴(kuò)散?！锩髂z穿刺培養(yǎng)：表面發(fā)育良好，沿穿刺線生長(zhǎng)不明顯，不液化明膠?！锺R鈴薯塊：培養(yǎng)15d仍不生長(zhǎng)。天津短桿菌(T613)的形態(tài)和生理特征18天津短桿菌(T613)的形態(tài)和生理特征(3)生理特征★對(duì)氧的要求：好氧及兼性厭氧?！锱c溫度的關(guān)系：菌株26~37℃培養(yǎng)生長(zhǎng)良好，75℃處理10min不再生長(zhǎng)?！飌H的影響：pH6~10生長(zhǎng)良好，pH5生長(zhǎng)微弱，pH4和pH11已不能生長(zhǎng)?！镞€原硝酸鹽：反映強(qiáng)烈。★不水解淀粉?！锊环纸饫w維素?！镫迕冈囼?yàn)：強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)?！锂a(chǎn)酸物質(zhì)的測(cè)定：G、果糖、甘露糖、蔗糖、麥芽糖、水楊苷、七葉靈★生長(zhǎng)因素試驗(yàn)：生物素是必需生長(zhǎng)因子。硫胺素是促生長(zhǎng)作用。天津短桿菌(T613)的形態(tài)和生理特征19北京棒桿菌(7338)與鈍齒棒桿菌(B9)的比較后提取容易，收率較高，質(zhì)量較好分泌色素較多北京棒桿菌(7338)與鈍齒棒桿菌(B9)的比較后提取容易，20天津短桿菌(T613)與鈍齒桿菌(B9)的比較

T613感染噬菌體時(shí)，不能換用B9，調(diào)換7338.天津短桿菌(T613)與鈍齒桿菌(B9)的比較T613感染21目前味精行業(yè)采用的主要菌株鈍齒棒桿菌B9和天津短桿菌TG-866是我國(guó)味精行業(yè)生產(chǎn)上的重要菌種。二者融合子F263.S9114華南理工大學(xué)FD415上海復(fù)旦大學(xué)TG961天津科技大學(xué)目前味精行業(yè)采用的主要菌株22作業(yè)：列表比較菌種形態(tài)特征培養(yǎng)特征生理特性生產(chǎn)特性其他北京棒桿菌鈍齒棒桿菌天津短桿菌作業(yè)：列表比較菌種形態(tài)特征培養(yǎng)特征生理特性生產(chǎn)特性其他23文獻(xiàn)導(dǎo)航/search.aspx?q=Corynebacterium%20crenatum文獻(xiàn)導(dǎo)航http://www.authormapper.co24§2谷氨酸生產(chǎn)菌在發(fā)酵過(guò)程中的形態(tài)變化細(xì)胞壁細(xì)胞形態(tài)+

生物素細(xì)胞壁§2谷氨酸生產(chǎn)菌在發(fā)酵過(guò)程中的形態(tài)變化細(xì)胞壁細(xì)胞形態(tài)25過(guò)程變化斜面小，革蘭氏染色淺種子大而粗壯，革蘭氏染色深第一個(gè)10小時(shí)大而粗壯，革蘭氏染色深第二個(gè)10小時(shí)細(xì)胞形態(tài)急劇變化，伸長(zhǎng)、膨大。非積累型積累型。16或20小時(shí)后伸長(zhǎng)，膨大，不規(guī)則狀，缺乏“V”字形排列，有的呈彎曲形，邊緣顏色淺，稍模糊，有的邊緣褶皺，甚至殘缺不齊，菌體形態(tài)基本清楚發(fā)酵后期細(xì)胞較長(zhǎng)，有模隔的多節(jié)花生狀，產(chǎn)酸高。過(guò)程變化斜面小，革蘭氏染色淺種子大而粗壯，革蘭氏染色深第一個(gè)26感染噬菌體后：感染時(shí)期細(xì)胞形態(tài)生產(chǎn)表現(xiàn)發(fā)酵前期菌體細(xì)胞明顯減少，細(xì)胞不規(guī)則，發(fā)圓，發(fā)胖，缺乏V字形排列，細(xì)胞碎片，嚴(yán)重時(shí)出現(xiàn)拉絲、拉網(wǎng)，互相堆在一起，幾乎找不到完整的菌體細(xì)胞。排氣口二氧化碳迅速下降，相繼出現(xiàn)OD值下跌、pH上升或不上升、耗糖緩慢發(fā)酵中后期細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，邊緣不整齊，毛刺狀，有細(xì)胞碎片。OD值下降，泡沫多，粘度大、耗糖緩慢等，補(bǔ)加適量營(yíng)養(yǎng)物可適當(dāng)挽救。感染噬菌體后：感染時(shí)期細(xì)胞形態(tài)生產(chǎn)表現(xiàn)發(fā)酵前期菌體細(xì)胞明顯減27策略：以日常維護(hù)優(yōu)選為背景……§3谷氨酸發(fā)酵的育種谷氨酸生產(chǎn)菌選擇壓代謝控制細(xì)胞工程基因工程誘變細(xì)胞融合高糖高谷氨酸策略：以日常維護(hù)優(yōu)選為背景……§3谷氨酸發(fā)酵的育種谷氨酸28日常菌種工作定期分純小劑量誘變刺激高產(chǎn)菌制做安瓿管日常菌種工作29育種方法1自然選育與誘變育種自然選育誘變育種變異幅度大于自然選育。2代謝控制育種育種方法1自然選育與誘變育種30選育細(xì)胞膜滲透性好的突變株抗VP類(lèi)衍生物選育對(duì)溶菌酶敏感突變株選育二氨基庚二酸缺陷突變株選育溫度敏感突變株選育細(xì)胞膜滲透性好的突變株抗VP類(lèi)衍生物31磷脂質(zhì)磷酸甘油磷酸二羥丙酮3-磷酸甘油醛脂肪酸乙酰CoA檸檬酸酮戊二酸L-GA葡萄糖C16酸C18酸乙酸葡萄糖表活劑生物素n-石蠟油酸油酸－G途徑石蠟途徑甘油缺陷部位表活劑拮抗部位細(xì)菌谷氨酸排泄控制部位L-GA磷脂質(zhì)磷酸甘油磷酸二羥丙酮3-磷酸甘油醛脂肪酸乙酰CoA檸檬32R1－C－O－CH2R2－C－O－CH＝O＝OH2C－O－P－O－R3O＝－O脂肪酸甘油磷酸R1和R2：烴基R3：乙醇胺絲氨酸肌苷酸膽堿磷脂R1－C－O－CH2R2－C－O－CH＝O＝OH2C－O－P33生物素：是脂肪合成中關(guān)鍵酶—乙酰CoA羧化酶的輔助因子，生物素限量時(shí)，就會(huì)抑制脂肪酸的合成，從而導(dǎo)致膜結(jié)構(gòu)的不完整。青霉素谷氨酸發(fā)酵菌總結(jié)課件34誘變育種的基本過(guò)程：選擇選擇合適的出發(fā)菌株↓制備待處理的菌懸液↓誘變處理↓篩選↓保藏和擴(kuò)大試驗(yàn)誘變育種的基本過(guò)程：選擇選擇合適的出發(fā)菌株35出發(fā)菌株：(1)要有一定的目標(biāo)產(chǎn)物的生產(chǎn)能力(2)對(duì)誘變劑敏感(3)生產(chǎn)性能好，如生長(zhǎng)快、營(yíng)養(yǎng)要求低、產(chǎn)孢子多且早，最好是生產(chǎn)上自然選育的菌株。出發(fā)菌株：36舉例：根據(jù)代謝工程的基本原理,對(duì)谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)TWQ080進(jìn)行逐級(jí)誘變處理,最終選育出一株谷氨酸產(chǎn)生菌GW46-4。然后對(duì)其搖瓶發(fā)酵條件及7L罐發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化,最后又對(duì)出發(fā)菌株和突變菌株的代謝流量進(jìn)行了分析。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)論如下：(1)以本實(shí)驗(yàn)室保藏菌株谷氨酸棒桿菌TWQ080為出發(fā)菌株,經(jīng)過(guò)紫外線(UV)和硫酸二乙酯(DES)逐級(jí)誘變處理,以高濃度糖、高濃度味精和琥珀酸為唯一碳源的平板進(jìn)行定向篩選,最終選育出一株谷氨酸產(chǎn)生菌GW46。然后對(duì)該菌株進(jìn)行了耐高溫馴化,馴化過(guò)程中不斷提高培養(yǎng)溫度,經(jīng)過(guò)多次馴化,育得一耐高溫菌株GW46-4,在未經(jīng)優(yōu)化的條件下產(chǎn)酸92.5g/L,比出發(fā)菌株提高了31.2%。(2)對(duì)菌株GW46-4的種子培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)最佳種子培養(yǎng)基配方：葡萄糖25g/L、玉米漿30g/L、磷酸氫二鉀1.5g/L、尿素6g/L、硫酸鎂0.4g/L；最佳培養(yǎng)條件：初始pH7.0,裝液量30mL/250mL。舉例：根據(jù)代謝工程的基本原理,對(duì)谷氨酸棒桿菌(Coryneb37代謝途徑分析策略2代謝控制育種策略代謝途徑分析2代謝控制育種策略38葡萄糖丙酮酸草酰乙酸檸檬酸蘋(píng)果酸乙醛酸異檸檬酸α-酮戊二酸反丁烯二酸谷氨酸谷氨酸琥珀酸乙酰CoA設(shè)法阻斷的代謝設(shè)法強(qiáng)化的代謝CO2固定檸檬酸合成酶烏頭酸酶異檸檬酸脫氫酶谷氨酸脫氫酶細(xì)胞膜滲透性裂解酶脫氫酶DCA使有機(jī)酸濃度升高，抑制異檸檬酸裂解酶，解除對(duì)異檸檬酸脫氫酶的抑制，轉(zhuǎn)入TCA。葡萄糖丙酮酸草酰乙酸檸檬酸蘋(píng)果酸乙醛酸異檸檬酸α-酮戊二酸反39生物素減少草酰乙酸減少乙酸減少關(guān)閉DCA琥珀酸氧化酶的能力低積累琥珀酸，阻遏異檸檬酸裂解酶，關(guān)閉DCA環(huán)。生物素減少40

CO2固定

PEP+CO2+GDP草酰乙酸+GTPCO2

丙酮酸蘋(píng)果酸草酰乙酸CO2NAD+NADH+H+PEP羧化酶蘋(píng)果酸酶蘋(píng)果酸脫氫酶PEP羧化酶蘋(píng)果酸酶蘋(píng)果酸脫氫酶41黃色短桿菌中：進(jìn)入分解途徑的情況：1PEP濃度低（減弱親和力）；2TCA中間產(chǎn)物濃度高（反饋抑制，防止草酰乙酸過(guò)剩。固定CO2的情況：1乙酰CoA濃度增加，與F16P共同激活PEP羧化酶；2乙酰CoA氧化，產(chǎn)生的ATP抑制丙酮酸激酶。黃色短桿菌中：42氨的導(dǎo)入α-酮戊二酸還原氨基化天冬氨酸或丙氨酸通過(guò)氨基轉(zhuǎn)移作用將氨基轉(zhuǎn)給α-酮戊二酸谷氨酸合成酶途徑：谷氨酸合成酶對(duì)NH4+親和力更強(qiáng)，不受谷氨酸反饋抑制，當(dāng)NH4+濃度低時(shí)循此途徑。氨的導(dǎo)入α-酮戊二酸還原氨基化43谷氨酸發(fā)酵菌總結(jié)課件44(1)選育強(qiáng)化CO2固定反應(yīng)的突變株選育在以琥珀酸為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)快、大的菌株選育對(duì)氟丙酮酸敏感突變株選育丙酮酸缺陷、天冬氨酸缺陷突變株強(qiáng)化丙酮酸羧化酶基因(2)選育減弱乙醛酸循環(huán)的突變株選育對(duì)琥珀酸敏感突變株選育不利用乙酸的突變株通過(guò)基因工程技術(shù)使異檸檬酸裂解酶活力降低(3)選育強(qiáng)化TCA中檸檬酸至α-酮戊二酸代謝的突變株選育檸檬酸合成酶強(qiáng)的突變株選育抗氟乙酸、氟化鈉、氮絲氨酸和氟檸檬酸的突變株具體策略(1)選育強(qiáng)化CO2固定反應(yīng)的突變株具體策略45谷氨酸發(fā)酵的代謝控制育種策略(4)選育解除谷氨酸對(duì)谷氨酸脫氫酶反饋調(diào)節(jié)的突變株選育抗酮基丙二酸抗性突變株選育耐高谷氨酸的突變株選育抗谷氨酸結(jié)構(gòu)類(lèi)似物突變株選育抗谷氨酰胺突變株(5)選育強(qiáng)化能量代謝的突變株選育抗呼吸抑制劑的突變株選育抗ADP磷酸化抑制劑突變株選育抗抑制能量代謝的抗生素突變株(6)選育減弱HMP后段酶活的突變株選育莽草酸缺陷型或添加芳香族氨基酸能促進(jìn)生長(zhǎng)的突變株選育抗嘌呤、嘧啶類(lèi)似物的突變株選育抗核苷酸類(lèi)抗生素突變株谷氨酸發(fā)酵的代謝控制育種策略(4)選育解除谷氨酸對(duì)谷氨酸脫463細(xì)胞工程育種原生質(zhì)體融合3細(xì)胞工程育種原生質(zhì)體融合474基因工程育種基礎(chǔ)：已獲得相關(guān)基因4基因工程育種基礎(chǔ)：已獲得相關(guān)基因48§4谷氨酸菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)斜面菌種斜面培養(yǎng)基必須有利于菌種生長(zhǎng)而不產(chǎn)酸，要求斜面菌種絕對(duì)純，培養(yǎng)條件有利于菌種繁殖，培養(yǎng)基以多含有機(jī)氮不含或少含糖為原則。斜面菌種不宜多次移接，一般只移接三次。經(jīng)常進(jìn)行菌種分離純化，提供新的菌株供生產(chǎn)使用。一級(jí)種子培養(yǎng)一級(jí)種子培養(yǎng)的目的在于大量繁殖活力強(qiáng)的菌體，培養(yǎng)基組成應(yīng)少含糖分，多含有機(jī)氮。培養(yǎng)條件有利于長(zhǎng)菌。二級(jí)種子培養(yǎng)§4谷氨酸菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)斜面菌種49影響種子質(zhì)量的主要因素培養(yǎng)基組成培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)易于被菌體直接吸收和利用，營(yíng)養(yǎng)成分要適當(dāng)?shù)刎S富和完全，氮源和維生素含量較高，碳源含量少，可以使菌絲粗壯并具有較強(qiáng)的活力。另一方面，種子培養(yǎng)基應(yīng)盡可能與發(fā)酵培養(yǎng)基接近，以適合發(fā)酵的需要。溫度pH溶解氧濃度前期需氧量少，后期需氧量多。接種量種齡影響種子質(zhì)量的主要因素培養(yǎng)基組成50看圖說(shuō)話看圖說(shuō)話51氨基酸發(fā)酵工藝學(xué)3谷氨酸生產(chǎn)菌的特征、育種及擴(kuò)大培養(yǎng)氨基酸發(fā)酵工藝學(xué)3谷氨酸生產(chǎn)菌的特征、育種及擴(kuò)大培養(yǎng)52關(guān)鍵詞提示菌落形態(tài)、菌體形態(tài)重要生理特征育種策略谷氨酸生產(chǎn)菌種制備關(guān)鍵詞提示菌落形態(tài)、菌體形態(tài)53谷氨酸發(fā)酵菌總結(jié)課件54第一節(jié)谷氨酸生產(chǎn)菌棒狀桿菌科(Corynebacteriaceae)

棒桿菌屬北京棒桿菌C.pekinenseCorynebacterium鈍齒棒桿菌C.crenatum谷氨酸棒桿菌C.glutamicum百合棒桿菌C.lilium美棒桿菌C.callunae力士棒桿菌C.herculis小桿菌屬嗜氨小桿菌MicrobacteriumammoniaphilumMicrobacterium節(jié)桿菌屬球形節(jié)桿菌ArthrobacterglobiformisArthrobacter短桿菌科(Brevibacteriaceae)

短桿菌屬乳糖發(fā)酵短桿菌B.lactofermentumBrevibacterium叉開(kāi)短桿菌B.divaricatum黃色短桿菌B.flvum硫殖短桿菌B.thiogenitalis產(chǎn)氨短桿菌B.ammoniagenes第一節(jié)谷氨酸生產(chǎn)菌棒狀桿菌科(Corynebacteria55特征1.1棒狀桿菌屬(Corynebacterium)直到微彎的桿菌，一端膨大呈棒狀，折斷分裂形成“八”字形或柵狀排列。G+1.2短桿菌屬(Brevibacterium)短的不分枝直桿菌。G+1.3小桿菌屬(Microbacterium)桿狀，與棒桿菌相似。G+1.4節(jié)桿菌屬(Arthrobacterium)培養(yǎng)過(guò)程中，球菌桿菌，桿菌球菌。G+G-,G-G+特征1.1棒狀桿菌屬(Corynebacterium)56Corynebacterium：放線菌目中一屬革蘭染色陽(yáng)性、不運(yùn)動(dòng)、非抗酸性、無(wú)芽孢的桿菌。菌體直形、彎形或多形，常呈棒狀。一般不運(yùn)動(dòng)。好氧或兼性厭氧，化能有機(jī)營(yíng)養(yǎng)型。進(jìn)行氧化性或發(fā)酵性代謝。過(guò)氧化氫酶陽(yáng)性。G+Cmo1%值為51～59。Corynebacterium：放線菌目中一屬革蘭染色陽(yáng)性、57谷氨酸棒桿菌C.glutamicum谷氨酸棒桿菌C.glutamicum58基因特征GC含量類(lèi)E.coli，分類(lèi)屬于革蘭氏陽(yáng)性菌策略： 全序列測(cè)序 注釋蛋白信息 分析異同 克隆谷氨酸合成相關(guān)基因基因特征GC含量類(lèi)E.coli，分類(lèi)屬于革蘭氏陽(yáng)性菌59谷氨酸生產(chǎn)菌株形態(tài)及生理共性細(xì)胞為球形、棒形或短桿形革蘭氏染色陽(yáng)性，無(wú)芽孢，無(wú)鞭毛，不能運(yùn)動(dòng)都是需氧型微生物都是生物素缺陷型微生物脲酶強(qiáng)陽(yáng)性不分解淀粉、纖維素、油脂、酪蛋白以及明膠等發(fā)酵中菌體發(fā)生明顯的形態(tài)變化，同時(shí)發(fā)生細(xì)胞膜滲透性的變化CO2固定反應(yīng)酶系活力強(qiáng)異檸檬酸裂解酶活力欠缺或微弱，乙醛酸循環(huán)弱α－酮戊二酸氧化能力缺失或微弱還原型輔酶Ⅱ進(jìn)入呼吸鏈能力弱檸檬酸合成酶、烏頭酸酶、異檸檬酸脫氫酶以及谷氨酸脫氫酶活力強(qiáng)能利用醋酸，不能利用石蠟具有向環(huán)境中泄漏谷氨酸的能力不分解利用谷氨酸，并能耐高濃度的谷氨酸，產(chǎn)谷氨酸5%以上谷氨酸生產(chǎn)菌株形態(tài)及生理共性細(xì)胞為球形、棒形或短桿形60國(guó)內(nèi)谷氨酸生產(chǎn)主要菌株天津短桿菌(T613)及其突變株鈍齒棒桿菌(AS1.542)用其突變株北京棒桿菌(AS1.299)及其突變株國(guó)內(nèi)谷氨酸生產(chǎn)主要菌株天津短桿菌(T613)及其突變株611北京棒桿菌(AS1299)的形態(tài)和生理特征(1)形態(tài)特征

短桿至小棒狀，有時(shí)微彎曲，兩端鈍圓，不分枝，呈多種形態(tài)。單個(gè)、成對(duì)及“V”字形排列。G+。胞內(nèi)有橫隔。不運(yùn)動(dòng)。無(wú)芽孢。1北京棒桿菌(AS1299)的形態(tài)和生理特征62北京棒桿菌(AS1299)的形態(tài)和生理特征(2)培養(yǎng)特征★普通肉汁瓊脂斜面：中間劃直線培養(yǎng)，中度生長(zhǎng)，菌胎線狀，24h白色，48h淡黃色，顏色逐漸加深，表面光滑、濕潤(rùn)、有光澤，無(wú)黏性，無(wú)水溶性色素。★普通肉汁瓊脂平板：菌落圓形，24h白色，48h淡黃色，中央隆起，表面濕潤(rùn)、光滑，有光澤，邊緣整齊且呈半透明狀，無(wú)黏性，不產(chǎn)生水溶性色素?！锲胀ㄈ庵后w培養(yǎng)：稍渾濁，有時(shí)表面沿管壁呈薄環(huán)狀，搖動(dòng)培養(yǎng)管，底部有粒狀沉渣?！锲胀ㄈ庵傊┐蹋罕砻姘l(fā)育良好，沿穿刺線生長(zhǎng)弱，且不向四周擴(kuò)散?！锩髂z平板及明膠穿刺：菌落形狀不規(guī)則，扁平，邊緣不整齊，淡黃色。穿刺培養(yǎng)時(shí)，沿穿刺線生長(zhǎng)不明顯，表面發(fā)育良好。不液化明膠?！锺R鈴薯塊：培養(yǎng)三周仍不生長(zhǎng)。北京棒桿菌(AS1299)的形態(tài)和生理特征63北京棒桿菌(AS1299)的形態(tài)和生理特征(3)生理特征★對(duì)氧的要求：好氧及兼性厭氧?！锱c溫度的關(guān)系：菌株26~37℃培養(yǎng)生長(zhǎng)良好，不耐高溫，41℃生長(zhǎng)較弱?！飌H的影響：Ph5~10均能生長(zhǎng)，最適pH6~7.5?！镞€原硝酸鹽：反映強(qiáng)烈?！锸锱Ｄ膛囵B(yǎng)：7d后微產(chǎn)堿?！锊凰獾矸??！锊环纸饫w維素?！镫迕冈囼?yàn)：強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)。★產(chǎn)酸物質(zhì)的測(cè)定：G、果糖、甘露糖、蔗糖、麥芽糖★生長(zhǎng)因素試驗(yàn)：生物素是必需生長(zhǎng)因素。硫胺素明顯促生長(zhǎng)。北京棒桿菌(AS1299)的形態(tài)和生理特征642鈍齒棒桿菌(AS1542)的形態(tài)和生理特征

(1)形態(tài)特征短桿至棒狀，有時(shí)微彎曲，兩端鈍圓，不分枝。單個(gè)、成對(duì)及“V”字形排列。折斷分裂。G+。胞內(nèi)有橫隔。不運(yùn)動(dòng)。無(wú)芽孢。2鈍齒棒桿菌(AS1542)的形態(tài)和生理特征65鈍齒棒桿菌(AS1542)的形態(tài)和生理特征

(2)培養(yǎng)特征★普通肉汁瓊脂斜面：中間劃直線培養(yǎng)，中度生長(zhǎng)，菌胎線狀，近草黃色，表面濕潤(rùn)、無(wú)光澤，無(wú)黏性，不產(chǎn)生水溶性色素?！锲胀ㄈ庵傊桨澹壕鋱A形，近草黃色，表面濕潤(rùn)、光滑，無(wú)光澤，邊緣頓齒狀，較薄，半透明，無(wú)黏性，不產(chǎn)生水溶性色素?！锲胀ㄈ庵后w培養(yǎng)：稍渾濁，表面有薄菌膜，底部有較多沉渣?！锲胀ㄈ庵傊┐蹋罕砻婕把卮┐叹€生長(zhǎng)，且不向四周擴(kuò)散?！锩髂z穿刺培養(yǎng)：表面及沿穿刺線生長(zhǎng)。不液化明膠?！锺R鈴薯塊：培養(yǎng)三周仍不生長(zhǎng)。鈍齒棒桿菌(AS1542)的形態(tài)和生理特征66鈍齒棒桿菌(AS1542)的形態(tài)和生理特征

(3)生理特征★對(duì)氧的要求：兼性厭氧?！锱c溫度的關(guān)系：菌株20~37℃培養(yǎng)生長(zhǎng)良好，不耐高溫，42℃不生長(zhǎng)?！飌H的影響：pH6~9生長(zhǎng)良好，pH10生長(zhǎng)微弱，pH4~5已不能生長(zhǎng)?！镞€原硝酸鹽：反映強(qiáng)烈?！锸锱Ｄ膛囵B(yǎng)：7d后微產(chǎn)堿?！锼獾矸邸！锊环纸饫w維素?！镫迕冈囼?yàn)：強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)?！锂a(chǎn)酸物質(zhì)的測(cè)定：G、果糖、甘露糖、蔗糖、麥芽糖、水楊苷、七葉靈★生長(zhǎng)因素試驗(yàn)：生物素是必需生長(zhǎng)因子。鈍齒棒桿菌(AS1542)的形態(tài)和生理特征673天津短桿菌(T613)的形態(tài)和生理特征(1)形態(tài)特征典型的短桿狀，有時(shí)微彎曲，兩端稍鈍圓，不分枝。單個(gè)、成對(duì)及“V”字形排列。折斷分裂。G+。不運(yùn)動(dòng)。無(wú)芽孢。3天津短桿菌(T613)的形態(tài)和生理特征68天津短桿菌(T613)的形態(tài)和生理特征(2)培養(yǎng)特征★普通肉汁瓊脂斜面：中間劃直線培養(yǎng)，中度生長(zhǎng)，菌胎線狀、隆起，淺黃色，表面濕潤(rùn)、有光澤，不透明，不產(chǎn)生水溶性色素?！锲胀ㄈ庵傊桨澹壕鋱A形，淺黃色，表面濕潤(rùn)、光滑，隆起，邊緣整齊，較薄，半透明，無(wú)黏性，不產(chǎn)生水溶性色素?！锲胀ㄈ庵后w培養(yǎng)：渾濁，沒(méi)有菌蓋，表面沿管壁有一圈菌膜，底部有棉絮狀和粒狀沉渣?！锲胀ㄈ庵傊┐蹋罕砻姘l(fā)育良好，沿穿刺線生長(zhǎng)較弱，且不向四周擴(kuò)散?！锩髂z穿刺培養(yǎng)：表面發(fā)育良好，沿穿刺線生長(zhǎng)不明顯，不液化明膠。★馬鈴薯塊：培養(yǎng)15d仍不生長(zhǎng)。天津短桿菌(T613)的形態(tài)和生理特征69天津短桿菌(T613)的形態(tài)和生理特征(3)生理特征★對(duì)氧的要求：好氧及兼性厭氧?！锱c溫度的關(guān)系：菌株26~37℃培養(yǎng)生長(zhǎng)良好，75℃處理10min不再生長(zhǎng)?！飌H的影響：pH6~10生長(zhǎng)良好，pH5生長(zhǎng)微弱，pH4和pH11已不能生長(zhǎng)?！镞€原硝酸鹽：反映強(qiáng)烈?！锊凰獾矸?。★不分解纖維素?！镫迕冈囼?yàn)：強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)?！锂a(chǎn)酸物質(zhì)的測(cè)定：G、果糖、甘露糖、蔗糖、麥芽糖、水楊苷、七葉靈★生長(zhǎng)因素試驗(yàn)：生物素是必需生長(zhǎng)因子。硫胺素是促生長(zhǎng)作用。天津短桿菌(T613)的形態(tài)和生理特征70北京棒桿菌(7338)與鈍齒棒桿菌(B9)的比較后提取容易，收率較高，質(zhì)量較好分泌色素較多北京棒桿菌(7338)與鈍齒棒桿菌(B9)的比較后提取容易，71天津短桿菌(T613)與鈍齒桿菌(B9)的比較

T613感染噬菌體時(shí)，不能換用B9，調(diào)換7338.天津短桿菌(T613)與鈍齒桿菌(B9)的比較T613感染72目前味精行業(yè)采用的主要菌株鈍齒棒桿菌B9和天津短桿菌TG-866是我國(guó)味精行業(yè)生產(chǎn)上的重要菌種。二者融合子F263.S9114華南理工大學(xué)FD415上海復(fù)旦大學(xué)TG961天津科技大學(xué)目前味精行業(yè)采用的主要菌株73作業(yè)：列表比較菌種形態(tài)特征培養(yǎng)特征生理特性生產(chǎn)特性其他北京棒桿菌鈍齒棒桿菌天津短桿菌作業(yè)：列表比較菌種形態(tài)特征培養(yǎng)特征生理特性生產(chǎn)特性其他74文獻(xiàn)導(dǎo)航/search.aspx?q=Corynebacterium%20crenatum文獻(xiàn)導(dǎo)航http://www.authormapper.co75§2谷氨酸生產(chǎn)菌在發(fā)酵過(guò)程中的形態(tài)變化細(xì)胞壁細(xì)胞形態(tài)+

生物素細(xì)胞壁§2谷氨酸生產(chǎn)菌在發(fā)酵過(guò)程中的形態(tài)變化細(xì)胞壁細(xì)胞形態(tài)76過(guò)程變化斜面小，革蘭氏染色淺種子大而粗壯，革蘭氏染色深第一個(gè)10小時(shí)大而粗壯，革蘭氏染色深第二個(gè)10小時(shí)細(xì)胞形態(tài)急劇變化，伸長(zhǎng)、膨大。非積累型積累型。16或20小時(shí)后伸長(zhǎng)，膨大，不規(guī)則狀，缺乏“V”字形排列，有的呈彎曲形，邊緣顏色淺，稍模糊，有的邊緣褶皺，甚至殘缺不齊，菌體形態(tài)基本清楚發(fā)酵后期細(xì)胞較長(zhǎng)，有模隔的多節(jié)花生狀，產(chǎn)酸高。過(guò)程變化斜面小，革蘭氏染色淺種子大而粗壯，革蘭氏染色深第一個(gè)77感染噬菌體后：感染時(shí)期細(xì)胞形態(tài)生產(chǎn)表現(xiàn)發(fā)酵前期菌體細(xì)胞明顯減少，細(xì)胞不規(guī)則，發(fā)圓，發(fā)胖，缺乏V字形排列，細(xì)胞碎片，嚴(yán)重時(shí)出現(xiàn)拉絲、拉網(wǎng)，互相堆在一起，幾乎找不到完整的菌體細(xì)胞。排氣口二氧化碳迅速下降，相繼出現(xiàn)OD值下跌、pH上升或不上升、耗糖緩慢發(fā)酵中后期細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，邊緣不整齊，毛刺狀，有細(xì)胞碎片。OD值下降，泡沫多，粘度大、耗糖緩慢等，補(bǔ)加適量營(yíng)養(yǎng)物可適當(dāng)挽救。感染噬菌體后：感染時(shí)期細(xì)胞形態(tài)生產(chǎn)表現(xiàn)發(fā)酵前期菌體細(xì)胞明顯減78策略：以日常維護(hù)優(yōu)選為背景……§3谷氨酸發(fā)酵的育種谷氨酸生產(chǎn)菌選擇壓代謝控制細(xì)胞工程基因工程誘變細(xì)胞融合高糖高谷氨酸策略：以日常維護(hù)優(yōu)選為背景……§3谷氨酸發(fā)酵的育種谷氨酸79日常菌種工作定期分純小劑量誘變刺激高產(chǎn)菌制做安瓿管日常菌種工作80育種方法1自然選育與誘變育種自然選育誘變育種變異幅度大于自然選育。2代謝控制育種育種方法1自然選育與誘變育種81選育細(xì)胞膜滲透性好的突變株抗VP類(lèi)衍生物選育對(duì)溶菌酶敏感突變株選育二氨基庚二酸缺陷突變株選育溫度敏感突變株選育細(xì)胞膜滲透性好的突變株抗VP類(lèi)衍生物82磷脂質(zhì)磷酸甘油磷酸二羥丙酮3-磷酸甘油醛脂肪酸乙酰CoA檸檬酸酮戊二酸L-GA葡萄糖C16酸C18酸乙酸葡萄糖表活劑生物素n-石蠟油酸油酸－G途徑石蠟途徑甘油缺陷部位表活劑拮抗部位細(xì)菌谷氨酸排泄控制部位L-GA磷脂質(zhì)磷酸甘油磷酸二羥丙酮3-磷酸甘油醛脂肪酸乙酰CoA檸檬83R1－C－O－CH2R2－C－O－CH＝O＝OH2C－O－P－O－R3O＝－O脂肪酸甘油磷酸R1和R2：烴基R3：乙醇胺絲氨酸肌苷酸膽堿磷脂R1－C－O－CH2R2－C－O－CH＝O＝OH2C－O－P84生物素：是脂肪合成中關(guān)鍵酶—乙酰CoA羧化酶的輔助因子，生物素限量時(shí)，就會(huì)抑制脂肪酸的合成，從而導(dǎo)致膜結(jié)構(gòu)的不完整。青霉素谷氨酸發(fā)酵菌總結(jié)課件85誘變育種的基本過(guò)程：選擇選擇合適的出發(fā)菌株↓制備待處理的菌懸液↓誘變處理↓篩選↓保藏和擴(kuò)大試驗(yàn)誘變育種的基本過(guò)程：選擇選擇合適的出發(fā)菌株86出發(fā)菌株：(1)要有一定的目標(biāo)產(chǎn)物的生產(chǎn)能力(2)對(duì)誘變劑敏感(3)生產(chǎn)性能好，如生長(zhǎng)快、營(yíng)養(yǎng)要求低、產(chǎn)孢子多且早，最好是生產(chǎn)上自然選育的菌株。出發(fā)菌株：87舉例：根據(jù)代謝工程的基本原理,對(duì)谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)TWQ080進(jìn)行逐級(jí)誘變處理,最終選育出一株谷氨酸產(chǎn)生菌GW46-4。然后對(duì)其搖瓶發(fā)酵條件及7L罐發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化,最后又對(duì)出發(fā)菌株和突變菌株的代謝流量進(jìn)行了分析。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)論如下：(1)以本實(shí)驗(yàn)室保藏菌株谷氨酸棒桿菌TWQ080為出發(fā)菌株,經(jīng)過(guò)紫外線(UV)和硫酸二乙酯(DES)逐級(jí)誘變處理,以高濃度糖、高濃度味精和琥珀酸為唯一碳源的平板進(jìn)行定向篩選,最終選育出一株谷氨酸產(chǎn)生菌GW46。然后對(duì)該菌株進(jìn)行了耐高溫馴化,馴化過(guò)程中不斷提高培養(yǎng)溫度,經(jīng)過(guò)多次馴化,育得一耐高溫菌株GW46-4,在未經(jīng)優(yōu)化的條件下產(chǎn)酸92.5g/L,比出發(fā)菌株提高了31.2%。(2)對(duì)菌株GW46-4的種子培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)最佳種子培養(yǎng)基配方：葡萄糖25g/L、玉米漿30g/L、磷酸氫二鉀1.5g/L、尿素6g/L、硫酸鎂0.4g/L；最佳培養(yǎng)條件：初始pH7.0,裝液量30mL/250mL。舉例：根據(jù)代謝工程的基本原理,對(duì)谷氨酸棒桿菌(Coryneb88代謝途徑分析策略2代謝控制育種策略代謝途徑分析2代謝控制育種策略89葡萄糖丙酮酸草酰乙酸檸檬酸蘋(píng)果酸乙醛酸異檸檬酸α-酮戊二酸反丁烯二酸谷氨酸谷氨酸琥珀酸乙酰CoA設(shè)法阻斷的代謝設(shè)法強(qiáng)化的代謝CO2固定檸檬酸合成酶烏頭酸酶異檸檬酸脫氫酶谷氨酸脫氫酶