SDS-PAGE測(cè)量蛋白質(zhì)分子量課件

SDS測(cè)量

蛋白質(zhì)分子量EXPERIMENT7

實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)聚丙烯酰胺凝膠聚合原理；學(xué)習(xí)不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠分離原理；掌握垂直板電泳的操作方法；學(xué)習(xí)SDS測(cè)蛋白分子量原理并測(cè)定。聚丙烯酰胺凝膠電泳—PAGE(Polyacryamidegelelectrophoresis)支持介質(zhì)－聚丙烯酰胺凝膠聚合原理：?jiǎn)误w丙烯酰胺Acr交聯(lián)劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺Bis化學(xué)聚合光聚合引發(fā)劑（NH4)2S2O8

（NH4)2S2O8

核黃素

加速劑TEMEDDMAPNTEMED注：（NH4)2S2O8

過(guò)硫酸胺在凝膠形成中提供始自由基，通過(guò)自由基的傳遞，使丙烯酰胺成為自由基，發(fā)動(dòng)聚合反應(yīng)

TEMEDN，N，N，N-四甲基乙二胺DMAPNβ－二甲基胺基丙晴影響聚合因素大氣中氧能淬滅自由基，使聚合反應(yīng)終止，所以在聚合過(guò)程中要使反應(yīng)液與空氣隔絕。某些材料如有機(jī)玻璃，能抑制聚合反應(yīng)。某些化學(xué)藥物可以減慢反應(yīng)速度，如赤血鹽。溫度高聚合快，溫度低聚合慢。堿性條件下凝膠易聚合，其聚合速度與AP濃度的平方根成正比。聚丙烯酰胺凝膠優(yōu)點(diǎn)

化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定；凝膠孔徑可調(diào)；重復(fù)性好；分辨率高；靈敏度高，可以測(cè)定10-6濃度的樣品。凝膠濃度的計(jì)算聚合后的聚丙烯酰胺凝膠的強(qiáng)度、彈性、透明度、粘度和孔徑大小均取決于兩個(gè)重要參數(shù)T和C，T是丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺兩個(gè)單體的總百分濃度。C是與T有關(guān)的交聯(lián)百分濃度。T與C的計(jì)算公式是：上式中a為丙烯酰胺的克數(shù)，b為甲叉雙丙烯酰胺的克數(shù)，m為水或緩沖液體積（ml）。式中a與b的比例很重要。富有彈性，且完全透明的凝膠，a與b的重量比應(yīng)在30左右。）分子量范圍與凝膠濃度的關(guān)系物質(zhì)分子量范圍適用的凝膠濃度（%）蛋白質(zhì)<104

1-4×104

4×104-1×105

1-5×105

>5×10520-3015-2010-155-102-5核酸<104

104-105

105-2×10610-205-10

2-2.55%10%15%294566972002945669720029456697200

不連續(xù)凝膠電泳（disc）的分離原理(一).原理不連續(xù)凝膠電泳系統(tǒng)具有與一般電泳的①電荷效應(yīng)分離外，還具有②濃縮效應(yīng)與③分子篩效應(yīng)，因而，能提高電泳的分辨率；使電荷性質(zhì)與密度相近的但分子量有差別的分子得以分離；或分子量相近、性質(zhì)一樣、電荷性質(zhì)與密度有差別的分子可以分離；或電荷性質(zhì)、分子量大小相近，但構(gòu)型不同時(shí)亦可分離。不連續(xù)凝膠電泳洗脫堿性不連續(xù)－分離酸性樣品酸性不連續(xù)－分離堿性樣品大多數(shù)蛋白質(zhì)分子呈酸性或中性，適合用堿性系統(tǒng)進(jìn)行電泳分離。②分子篩效應(yīng)移動(dòng)界面到達(dá)濃縮膠和分離膠界面時(shí)，凝膠的PH變化明顯，緩沖液中甘氨酸的解離迅速增加，直至完全解離出gly-,其分子量小，遷移超過(guò)蛋白質(zhì)分子。而喪失夾擊的作用；同時(shí)，凝膠的孔徑變小，降低了蛋白質(zhì)的遷移率。故蛋白質(zhì)分子在均一的電壓梯度和PH值中泳動(dòng)，依其分子量的大小而分開(kāi)。③電荷效應(yīng)緩沖液系統(tǒng)濃縮凝膠緩沖液0.5mol/LTris-HCl,PH6.8分離凝膠緩沖液1.5mol/LTris-HCl,PH8.8電極緩沖液系統(tǒng)0.025mol/LTris（三羥甲基氨基甲烷）0.2mol/Gly(甘氨酸)PH8.3樣品緩沖液0.1mol/LTris-HCl,PH6.8,40%甘油、0.05mg/ml溴酚藍(lán)樣品緩沖液的要求：選擇合適的PH與離子強(qiáng)度，以保證樣品的溶解性、穩(wěn)定性、生物活性。并加入便于觀察電泳前沿的指示劑。標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)樣品標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)樣品：是一組（5～7種）已知的合適的分子量范圍的、構(gòu)形相近的一套蛋白質(zhì)，溶解在樣品緩沖液中備用。樣品的濃度分析目的、檢測(cè)方法和樣品的組成是關(guān)鍵；未知樣品濃度：0.1～20mg/ml考瑪斯亮籃染色：1～2mg/ml銀染色:0.02～0.2mg/ml高純度樣品：0.5～2mg/ml加樣電泳

光吸收檢測(cè)考瑪斯亮籃染色染色銀染色SDS測(cè)蛋白質(zhì)分子量SDS是在PAG系統(tǒng)中引進(jìn)SDS（十二烷基硫酸鈉），SDS能斷裂分子內(nèi)和分子間氫鍵，破壞蛋白質(zhì)的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，強(qiáng)還原劑能使半胱氨酸之間的二硫鍵斷裂，蛋白質(zhì)在一定濃度的含有強(qiáng)還原劑的SDS溶液中，與SDS分子按比例結(jié)合，形成帶負(fù)電荷的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物，這種復(fù)合物由于結(jié)合大量的SDS，使蛋白質(zhì)喪失了原有的電荷狀態(tài)形成僅保持原有分子大小為特征的負(fù)離子團(tuán)塊，從而降低或消除了各種蛋白質(zhì)分子之間天然的電荷差異，由于SDS與蛋白質(zhì)的結(jié)合是按重量成比例的，因此在進(jìn)行電泳時(shí)，蛋白質(zhì)分子的遷移速度取決于分子大小。當(dāng)分子量在15KD到200KD之間時(shí)，蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW為分子量，X為遷移率，k、b均為常數(shù)，若將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對(duì)分子量對(duì)數(shù)作圖，可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，未知蛋白質(zhì)在相同條件下進(jìn)行電泳，根據(jù)它的電泳遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得分子量。

SDS電泳的成功關(guān)鍵之一是電泳過(guò)程中，待別是樣品制備過(guò)程中蛋白質(zhì)與SDS的結(jié)合程度。影響結(jié)合的因素主要有三個(gè)：溶液中SDS單體的濃度。當(dāng)單體濃度大于1mmol/L時(shí)大多數(shù)蛋白質(zhì)與SDS結(jié)合的重量比為1:1.4，如果單體濃度降到0.5mmol/L以下時(shí)，兩者的結(jié)合比僅為1:0.4。這樣就不能消除蛋白質(zhì)原有的電荷差別；為保證蛋白質(zhì)與SDS的充分結(jié)合，它們的重量比應(yīng)該為1:4或1:3；樣品緩沖液的離子強(qiáng)度。SDS電泳的樣品緩沖液離子強(qiáng)度較低，通常是10～100mmol/L；二硫鍵是否完全被還原。采用SDS測(cè)蛋白質(zhì)MW時(shí)，只有完全打開(kāi)二硫鍵，蛋白質(zhì)分子才能被解聚，SDS才能定量地結(jié)合到亞基上而給出相對(duì)遷移率和分子量對(duì)數(shù)的線性關(guān)系。因此在用SDS處理樣品同時(shí)常用巰基乙醇處理，巰基乙醇是強(qiáng)還原劑，可使被還原的二硫鍵不易再氧化，從而使很多不溶性蛋白質(zhì)溶解而與SDS定量結(jié)合。有許多蛋白質(zhì)是由亞基（如血紅蛋白）或兩條以上肽鏈（如胰凝乳蛋白酶）組成的，它們?cè)赟DS和巰基乙醇作用下，解離成亞基或單條肽鏈，因此這一類(lèi)蛋白質(zhì)，測(cè)定時(shí)只是它們的亞基或單條肽鏈的MW。已發(fā)現(xiàn)有些蛋白質(zhì)不能用SDS測(cè)定分子量。如電荷異?；驑?gòu)象異常的蛋白質(zhì)，帶有較大輔基的蛋白質(zhì)（某些糖蛋白）以及一些結(jié)構(gòu)蛋白，如膠原蛋白等。一般至少采用兩種方法測(cè)定未知樣品的分子量，互相驗(yàn)證。2.實(shí)驗(yàn)試劑

(1)30%丙烯酰胺（Acr）：稱(chēng)Acr30g，甲叉雙丙烯酰胺

（Bis）0.8g，加蒸餾水至100ml，過(guò)濾后置棕色瓶中，

4℃貯存可用1-2月。

（2）10%SDS（十二烷基硫酸鈉）

（3）1.5mol/LpH8.8Tris-HCl分離膠緩沖液：稱(chēng)取

Tris18.2g加入50ml水，用1mol/L鹽酸調(diào)pH8.9，最

后用蒸餾水定容至100ml。

（4）1.0mol/LpH6.8Tris-HCl濃縮膠緩沖液：稱(chēng)取

Tris12.1g，加入50ml水，用1mol/L鹽酸調(diào)pH6.8，

最后用蒸餾水定容至100ml。

（5）0.05mol/LpH6.8Tris-HCl樣品溶解緩沖液：稱(chēng)取

Tris0.6g，加入50ml水，用1mol/L鹽酸調(diào)pH6.8，最

后用蒸餾水容至100ml。

（7）10%過(guò)硫酸銨(AP)

（8）TEMED（四甲基乙二胺）

（9）樣品溶解液：SDS（100mg）+巰基乙醇（0.1ml）+

溴酚藍(lán)（2mg）+甘油（2g）+0.05mol/LpH8.3Tris-

HCl（2ml），最后定容至10ml。

（10）固定液：取50%甲醇454ml，冰乙酸46ml混勻。

（11）染色液：稱(chēng)取考馬斯亮藍(lán)R2500.125g，加上述固定液

250ml，過(guò)濾后備用。

（12）脫色液：冰乙酸75ml，甲醇50ml，加蒸餾水定容至1000ml。

（13）電極緩沖液（內(nèi)含0.1%SDS，0.05mol/LTris-0.384mol/L甘氨酸緩沖液pH8.3）：稱(chēng)Tris6.0g，甘氨酸28.8g，加入SDS1g，加蒸餾水使其溶解后定容至1000ml。

2.實(shí)驗(yàn)試劑分離膠(10%15ml)濃縮膠(5%5ml)ddH2O5.4ml3.2ml30%Acr5.0ml0.85mlBuffer1.5mol/LpH=8.8Tris-HCl3.8ml0.5mol/LpH=6.8Tris-HCl0.65ml10%SDS150μl50μl10%Ap150μl50μlTEMED500μl200μl

配膠

3.樣品及MW標(biāo)準(zhǔn)參照物溶液的制備樣品溶液和上樣緩沖液混勻，使用前在100℃水浴1min，以除去可能出現(xiàn)的亞穩(wěn)態(tài)聚合物。4.上樣。15μl/孔5.電泳上槽接負(fù)極，下槽接正極，打開(kāi)電泳儀開(kāi)關(guān)，開(kāi)始時(shí)將電流調(diào)至10mA，待樣品進(jìn)入分離膠時(shí)，將電流調(diào)至20-30mA。待指示劑染料靠遷移至下沿1～1.5cm處停止電泳，需2～3h。6.凝膠板剝離與染色：電泳結(jié)束后，撬開(kāi)玻璃板，將凝膠板做好標(biāo)記后放在大培養(yǎng)皿內(nèi)，將凝膠放入0.05%考馬斯亮藍(lán)R250（內(nèi)含20％磺基水楊酸）染色液中，使染色液沒(méi)過(guò)膠板，染色30min左右。注意事項(xiàng)丙烯酰胺具有中等毒性。常人每天允許的最大暴露量不超過(guò)0.5μg/kg，皮膚接觸可致中毒，癥狀為紅斑、脫皮、眩暈、動(dòng)作機(jī)能失調(diào)、四肢無(wú)力等。丙烯酰胺是神經(jīng)毒劑，可以透過(guò)皮膚，不要接觸皮膚，戴手套、口罩操作。一定要催化充分，使之完全聚合。沒(méi)有聚合的丙烯酰胺不要傾倒到水源附近。集中處理，實(shí)驗(yàn)中全部的膠由專(zhuān)門(mén)受過(guò)訓(xùn)練的人收集到一起，在一個(gè)特殊標(biāo)明的容器中保存，并進(jìn)一步催化使之反應(yīng)完全，最后送交學(xué)校危險(xiǎn)品倉(cāng)庫(kù)，統(tǒng)一處理。Forexample:MarkersProetinsABA+B200kD116kD

66kD45kD31kD21.5kD14.4kD6.5kD12%SeparatingGel思考題1.簡(jiǎn)述聚丙烯酰胺凝膠聚合的原理，如何調(diào)節(jié)凝膠的孔徑?2.為什么樣品會(huì)在濃縮膠中被壓縮成層？3.上樣緩沖液中蔗糖及溴酚藍(lán)各有何用途？4.上下兩槽電泳緩沖液電泳后，能否混合存放？為什么？4