臘梅花揮發(fā)油成分分析及生物活性初探

臘梅花揮發(fā)油成分分析及生物活性初探【摘要】目的研究臘梅花的揮發(fā)油成分及其抗氧化、抑菌活性。方法用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(G-S)結(jié)合Kvats保存指數(shù)(KI)比照的方法別離和鑒定臘梅花揮發(fā)油的組成和含量，通過β-胡蘿卜素/亞油酸漂白體系和DPPH自由基去除體系評(píng)價(jià)其抗氧化活性，濾紙片法檢測(cè)其對(duì)常見細(xì)菌的抑制活性。結(jié)果共鑒定出31種成分，主要為β-石竹烯(16.06%)，Elixene(14.65%)，β-欖香烯(9.26%)和β-蓽澄茄油烯(6.42%);臘梅花揮發(fā)油具有較強(qiáng)的抗脂質(zhì)過氧化物的才能(反響180in后對(duì)亞油酸氧化的抑制率仍為52.08%)，但是對(duì)DPPH自由基的去除才能一般(反響18h后去除率僅為16.38%);抑菌實(shí)驗(yàn)顯示其對(duì)常見的6種革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌和3種革蘭氏陰性細(xì)菌均有抑制作用。結(jié)論臘梅花揮發(fā)油含有大量的活性成分，具有較強(qiáng)的生物學(xué)活性?！娟P(guān)鍵詞】臘梅花;揮發(fā)油;氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用;抗氧化活性;抑菌活性Abstrat：bjetiveTstudytheainheialpnentsftheessentialilfrtheflerfhinanthuspraex(L.)LinkandthEirantixidantandantiirbialativites.ethdsTheheialnstituentsftheessentialilfrtheflerfhinanthuspraex(L.)LinkereidentifiedbyG-SandtheKvatsretentinindex.Theantixidantativityasalsinvestigatedithtdifferentethds:the1,1-diphenyl-2-pirylhydrazyl(DPPH)radialsavengerandtheβ-artene/linlEIaidbleahingtest.Theantiirbialativityastestedbyadisdiffusintest.ResultsThirty-nekindsfvlatilepnentsereidentifiedbyβ-aryphyllene(16.06%),Elixene(14.65%),β-Eleene(9.26%)andβ-ubebene(6.42%)respetively.Theresultsfantixidantativityshedthattheilhadhigherantilipidperxideability(Theinhibitinratetardslinleiaidasstill52.08%after180in),buteakerabilityfsavengingDPPHradial(ThelearaneratetardsDPPHasnly16.38%after18h).Theilasalsfundtstrnglyinhibitthegrthf9bateriatested.nlusinAlargeauntfheialpnentserefundintheessentialilfrtheflerfhinanthuspraex(L.)Linkandexhibithighbilgialativities.Keyrds：hinanthuspraex(L.)Link;Essentialil;G-S;Antixidantativity;Antiirbialativity臘梅hinanthuspraex(L.)Link是臘梅科臘梅屬落葉灌木,為我國(guó)特有,生長(zhǎng)于亞熱帶潮濕的常綠落葉闊葉混交林地帶。臘梅屬植物的葉、花都散發(fā)香氣，含有揮發(fā)性的芳香油等揮發(fā)性成分，是我國(guó)傳統(tǒng)的庭院名花和園林綠化植物,具有色、香、形、姿的欣賞價(jià)值[1]。臘梅的花具有諸多的藥理功能,可用于治療感冒、解熱鎮(zhèn)痛、止咳化痰、降壓、改善免疫系統(tǒng)和提取香精等[1～2]。有關(guān)臘梅花化學(xué)成分的研究已有文獻(xiàn)報(bào)道，主要包括生物堿類成分、黃酮類成分、香豆素類成分[2，3]等。利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(G-S)研究植物揮發(fā)性成分也有較多文獻(xiàn)報(bào)道，但對(duì)于臘梅花中揮發(fā)性成分的研究，目前還處于不斷完善中，有關(guān)其抗氧化、抑菌活性的研究尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(G-S)結(jié)合別離峰Kvats保存指數(shù)(KI)匹配的方法首次對(duì)臘梅花揮發(fā)油進(jìn)展定量分析鑒定;用濾紙片法測(cè)定了揮發(fā)油對(duì)9種常見細(xì)菌的抑制活性;以BHT(2,6-二叔丁基對(duì)甲酚)作為陽(yáng)性對(duì)照，采用DPPH自由基去除體系和β-胡蘿卜素/亞油酸漂白體系初步評(píng)價(jià)其抗氧化活性，以期為充分開發(fā)和利用臘梅資源提供理論根據(jù)。1材料與儀器1.2試劑DPPH(2,2-diphenyl-2-pirylhydrazyl)由日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社提供;BHT由Applihe公司提供;亞油酸由Researhrganis公司提供;β-胡蘿卜素購(gòu)自Biheika公司、Teen-40購(gòu)自Siga公司;甲醇、氯仿、丙酮、無(wú)水乙醇等由西安化學(xué)試劑廠提供，均為分析純;超純水;牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。1.3菌種白色葡萄球菌(Staphylusepideridis)A113，大腸桿菌(Esherihiali)A70，凝結(jié)芽胞桿菌(Baillusagulans)A89，藤黃八迭球菌(Sarinaluteu)A119，金黃色葡萄球菌(Staphylusaureus)26003，枯草芽胞桿菌(Baillussubtilis)A20，購(gòu)自西安微生物研究所。肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneuniae)1.1736，普通變形菌(Prteusvulgaris)1.1208，表皮葡萄球菌(Staphylusepideridis)1.2429，購(gòu)自北京微生物研究所。1.4儀器G-S-QP2022型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，日本SHIADZU公司產(chǎn)品;FZ102微型植物粉碎機(jī)，黃驊市中興有限責(zé)任公司產(chǎn)品;RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品;Q/BKYY31-2000型電熱恒溫鼓風(fēng)枯燥箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠產(chǎn)品;SL202N型藥物電子天平，上海明橋精細(xì)科學(xué)儀器產(chǎn)品;HH-6B數(shù)顯恒溫水浴鍋，國(guó)華電器產(chǎn)品;恒溫恒濕培養(yǎng)箱，廣東省醫(yī)療器械廠產(chǎn)品;LS-3250高壓蒸氣滅菌鍋，SANY公司產(chǎn)品;萬(wàn)用電爐，上海樹立儀器儀表產(chǎn)品;共水蒸餾裝置;超凈工作臺(tái)。2方法2.1揮發(fā)油的提取稱取新穎臘梅花830.00g，按?中國(guó)藥典?2022年版Ⅰ部附錄方法提取揮發(fā)油，得到淺黃色揮發(fā)油約0.89l，密封，4℃保存，備用。2.2G-S分析2.2.1G條件RTX-5S型彈性石英毛細(xì)管(0.25×30，0.25μ);柱前壓75.40kPa;載氣為高純度氦氣(99.999%);柱內(nèi)載氣流量1.26l/in;分流比為20∶1;升溫程序：從50℃開場(chǎng)，以15℃/in升至90℃，再以5℃/in升至280℃，保存1in;汽化室溫度為250℃。S條件：EI源，離子源溫度200℃;接口溫度250℃;電子能量70eV;倍增器電壓0.9kV;溶劑延時(shí)4in;掃描范圍40～600au。樣品稀釋1000倍進(jìn)樣，進(jìn)樣量2μl。2.2.2定性定量方法各色譜峰相應(yīng)的質(zhì)譜圖經(jīng)人工解析、NIST27和NIST147譜庫(kù)檢索定性，利用同型別離柱(RTX-5)測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的KI值計(jì)算各峰的KI值，同時(shí)與KI的標(biāo)準(zhǔn)文獻(xiàn)值進(jìn)展比照來確定揮發(fā)油的組分，文獻(xiàn)中沒有KI值的組分那么采用質(zhì)譜庫(kù)檢索的結(jié)果[4]。定量分析采用峰面積歸一法計(jì)算各成分的相對(duì)百分含量。利用同型別離柱(RTX-5)測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的KI值計(jì)算各峰的KI值[4，5]：KI=100n+100(tx-tn)/(tn+1-tn)式中，tx為測(cè)定物質(zhì)的保存時(shí)間，n為相應(yīng)正烷烴的碳原子數(shù)，tn、tn+1分別為碳原子數(shù)相差為1的正烷烴(tntxt)流出峰的保存時(shí)間(in)。2.3抗氧化活性測(cè)定β-胡蘿卜素/亞油酸漂白體系：取6l0.1g/l的β-胡蘿卜素的氯仿溶液，參加40μl亞油酸和400μlTeen-40，旋轉(zhuǎn)蒸餾至氯仿完全揮干后，參加200l去離子水，超聲溶解，得乳狀液A。取5l乳狀液A參加200μl2g/L樣品臘梅花揮發(fā)油甲醇溶液，50℃孵育，檢測(cè)波長(zhǎng)470n，180in內(nèi)每隔20in測(cè)定一次吸光度。以BHT為陽(yáng)性對(duì)照，每組實(shí)驗(yàn)均平行3次。以測(cè)定的吸光度值計(jì)算臘梅花揮發(fā)油以及陽(yáng)性對(duì)照BHT在β-胡蘿卜素所建立的乳化體系中的抑制率[4～6]。抑制率(I%)的計(jì)算可按照下面的公式。I%=(1-Rsaple/Rntrl)×100%式中，Rsaple為樣品臘梅花揮發(fā)油以及陽(yáng)性對(duì)照BHT的降解速率，Rntrl為實(shí)驗(yàn)陰性對(duì)照甲醇的降解速率;R=ln(a/b)×(1/t)，其中，t為時(shí)間(in)，a為t=0in時(shí)的吸光度，b為t=20,40,…180in時(shí)的吸光度。DPPH自由基去除體系：將2g/l的樣品臘梅花揮發(fā)油2l參加2×104l/L的DPPH1l的甲醇溶液中，50℃水浴18h后，在517n波長(zhǎng)測(cè)定吸光度值。以0.2g/lBHT為陽(yáng)性對(duì)照，每組實(shí)驗(yàn)均平行3次。對(duì)DPPH的去除率(I%)可用下式計(jì)算[3,4,7]：I%=(1-Asaple/Antrl)×100%式中，Antrl為1lDPPH溶液+2l甲醇的吸光度，Asaple為1lDPPH溶液+2l樣品溶液、BHT溶液的吸光度。2.4抑菌活性的測(cè)定將各菌種[8]接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，培養(yǎng)18～24h后，制備成菌懸液，菌懸液濃度調(diào)在106～107fu/l。取0.ll菌液于培養(yǎng)基外表并涂布均勻。將直徑為6已滅菌的濾紙片，浸于15μl的揮發(fā)油，貼于平板上，以0.5g/l鹽酸四環(huán)素作為陽(yáng)性對(duì)照。4℃放置2h后，移至恒溫恒濕培養(yǎng)箱中37℃下培養(yǎng)24～36h。測(cè)量抑菌圈的直徑[9～11]，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.3結(jié)果3.1揮發(fā)油成分鑒定及分析G-S技術(shù)是植物揮發(fā)油成分鑒定的常用方法，G-S結(jié)合別離峰Kvats保存指數(shù)(KI)匹配的方法可大大進(jìn)步化合物鑒定的準(zhǔn)確性[4～7]。從表1可以看出，臘梅花揮發(fā)油以單萜和倍半萜類物質(zhì)為主，占總量的78.72%，其中單萜類物質(zhì)含量較少為2.82%，倍半萜類物質(zhì)占總量的75.9%。β-石竹烯(16.06%)、Elixene(14.65%)、β-欖香烯(9.26%)、β-蓽澄茄油烯(6.42%)、大牛兒烯B(4.53%)、α-香檸檬烯(3.93%)、δ-杜松烯(3.66%)、法呢烯(3.51%)和胡蘿卜醇(2.42%)是其特征組分。并檢測(cè)出的4種成分：Elixene(14.65%)、9-十八烯醇(0.60%)、9-二十六碳烯(0.30%)和土青木香烯(0.52%)在前人研究的文獻(xiàn)中尚未見報(bào)道。表1臘梅花揮發(fā)油成分組分及其相對(duì)含量3.2抗氧化活性檢測(cè)結(jié)果3.2.1β-胡蘿卜素/亞油酸漂白體系β-胡蘿卜素/亞油酸漂白體系主要評(píng)價(jià)的是抗氧化物質(zhì)在乳化脂質(zhì)體系中的抗氧化才能[5，6]。從圖1可以明晰地看出吸光度值隨時(shí)間變化的規(guī)律，樣品的吸光度值的下降速率要明顯快于陽(yáng)性對(duì)照BHT。樣品臘梅花揮發(fā)油的降解速率從剛開場(chǎng)的61.00%下降至52.08%，吸光度值下降了0.304;而陽(yáng)性對(duì)照BHT的降解速率那么從開場(chǎng)的83.41%下降至70.76%，吸光度值下降了0.204。也就是說，通過β-胡蘿卜素/亞油酸檢測(cè)，樣品臘梅花揮發(fā)油具有較強(qiáng)的抗氧化活性，但是要低于陽(yáng)性對(duì)照BHT，因?yàn)樗翘烊坏目寡趸镔|(zhì)，也具有進(jìn)一步開發(fā)利用的價(jià)值。圖1臘梅花揮發(fā)油的抗氧化活性(β-胡蘿卜素/亞油酸漂白體系)3.2.2DPPH自由基去除體系DPPH自由基在有機(jī)溶劑中是一種穩(wěn)定的自由基，其甲醇溶液在517n附近有強(qiáng)吸收(顯深紫色)。當(dāng)有自由基去除劑存在時(shí)，孤對(duì)電子被配對(duì)，該物質(zhì)顏色由紫色變?yōu)辄S色，通過測(cè)定517n處吸收的變化或觀察其顏色的變化可評(píng)價(jià)自由基去除劑抗氧化活性的大小[12]。抑制率(I%)可以反映出對(duì)自由基的去除作用，抑制率越大，抗氧化活性越強(qiáng)，反之那么弱。如圖2所示，用β-胡蘿卜素漂白法檢測(cè)，樣品的抗氧化才能較強(qiáng)，180in后樣品仍具有較高的抑制率為52.08%，BHT的抑制率為70.76%。但是經(jīng)DPPH自由基去除體系檢測(cè)，樣品在18h后抑制率從31.62%下降至16.38%，下降了15.24%;陽(yáng)性對(duì)照BHT卻從86.57%下降至79.89%，下降了6.68%。以上結(jié)果說明，臘梅花揮發(fā)油具有較強(qiáng)的脂質(zhì)過氧化抑制才能，但是對(duì)自由基的去除才能一般，這可能與其揮發(fā)油的成分組成是相關(guān)的[4，12]。圖2臘梅花揮發(fā)油的抗氧化活性(DPPH自由基去除體系與β-胡蘿卜素/亞油酸漂白體系的比擬)3.3抑菌活性檢測(cè)結(jié)果如表2所示，臘梅花揮發(fā)油對(duì)所實(shí)驗(yàn)的9種常見細(xì)菌表現(xiàn)出不同強(qiáng)度的抑菌活性。其中對(duì)于白色葡萄球菌的抑制效果最明顯，抑菌圈直徑為23.59，與鹽酸四環(huán)素(25.59)相當(dāng)。對(duì)于普通變形菌的抑制才能最低，抑菌圈直徑為9.28，遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于鹽酸四環(huán)素(18.58)，而對(duì)其他7種細(xì)菌的抑制才能表現(xiàn)適中。表2濾紙片法測(cè)定結(jié)果4討論采用共水蒸餾裝置提取臘梅花中的揮發(fā)油，并用G-S結(jié)合別離峰Kvats保存指數(shù)(KI)匹配的方法，準(zhǔn)確、快速鑒定了臘梅花揮發(fā)油中的31種主要成分。臘梅花揮發(fā)油成分以單萜和倍半萜類化合物為主,占總量的78.72%;其中β-石竹烯(16.06%)、Elixene(14.65%)、β-欖香烯(9.26%)、β-蓽澄茄油烯(6.42%)、大牛兒烯B(4.53%)、α-香檸檬烯(3.93%)、δ-杜松烯(3.66%)、法呢烯(3.51%)和胡蘿卜醇(2.42%)是其特征組分。并且檢測(cè)出4種新的成分：Elixene(14.65%)、9-十八烯醇(0.60%)、9-二十六碳烯(0.30%)和土青木香烯(0.52%)。已報(bào)道的江婷等[13]分析的臘梅花揮發(fā)油的主要成分為α-法呢烯(9.833%)，大香葉烯D(9.693%)，石竹烯(8.757%)和β-欖香烯(7.252%)，本實(shí)驗(yàn)所鑒定出的組分與結(jié)果與其在含量和組成上有一定差異，二者的特征組分也不盡一樣，這可能是由于研究測(cè)試的材料來源、提取及檢測(cè)方法不同所致。在β-胡蘿卜素/亞油酸體系中，臘梅花揮發(fā)油在180in后仍然具有很高的抑制率(52.08%)，說明樣品具有很高的抗脂質(zhì)氧化物的活性。在DPPH自由基去除體系中，臘梅花揮發(fā)油的抑制率數(shù)值較低而且下降很快，說明樣品對(duì)于DPPH自由基的去除才能不是很強(qiáng)。這可能與樣品的化學(xué)組分有關(guān)，β-石竹烯(16.06%)和δ-杜松烯(3.66%)，這2個(gè)倍半萜烯具有一定的自由基去除才能，但反響速度緩慢;橙花叔醇(0.21%)的羥基屬于烯丙基上的叔醇基，不但沒有提供質(zhì)子的才能，甚至還表現(xiàn)出一定的氧化性質(zhì)[3，12]。臘梅花揮發(fā)油對(duì)革蘭氏陽(yáng)性、陰性細(xì)菌都具有抑制作用，通過抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)，就可以預(yù)防相應(yīng)疾病的發(fā)生。它對(duì)于白色葡萄球菌的抑制才能最強(qiáng)，對(duì)于普通變形菌的抑制才能最低。抑菌活性的強(qiáng)弱與其化學(xué)組分有關(guān)，α-松油醇(0.67%)對(duì)很多細(xì)菌、真菌具有抑制作用，如金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、表皮葡萄球菌、白色念珠菌[11];氧化丁香烯(1.95%)盡管在此油中含量較少，被認(rèn)為具有很有效的抗菌特性[10];另一個(gè)含量較少的單萜類物質(zhì)沉香醇(0.78%)被報(bào)道它對(duì)很多種細(xì)菌、真菌具有抑制活性[14]，總之但是其抑菌機(jī)理還不是很清楚，有待進(jìn)一步的研究[8，11]?？偟膩碚f，在臘梅花的揮發(fā)油中,有許多具有生物活性的物質(zhì)。臘梅花具有較強(qiáng)的抗氧化活性，對(duì)常見的致病菌具有很明顯的抑菌效果，具有較廣的抗菌譜，提示了臘梅具有良好的藥用價(jià)值和開發(fā)前景。本文對(duì)其抗氧化、抗菌活性進(jìn)展了初步研究，不僅為說明其作用機(jī)制提供了研究思路，也為該資源的開發(fā)提供了一定的理論根據(jù)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】[1]中國(guó)科學(xué)院植物研究所.中國(guó)植物志[].北京:科學(xué)出版社,1979:1.[2]肖炳坤,劉耀明.蠟梅屬植物分類、化學(xué)成分和藥理作用研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代中藥研究與理論,2022,17(2):59.[3]朱華年,朱永勝,胡豐林.臘梅葉提取物的去除自由基活性及薄層色譜和液質(zhì)聯(lián)用分析[J].安徽農(nóng)學(xué)通報(bào),2022,13(16):30.[4]鐘瑞敏,張振明,王羽梅.楊梅葉芳香精油的成分鑒定及抗氧化活性[J].華南理工大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2022,34(3):49.[5]SinghG,auryaS,DelapasnaP,etal.Aparisnfheial,antixidantandantiirbialstudiesfinnanleafandbarkvlatileils,leresinsandthEirnstituents[J].FdheTxil,2022,45(9):1650.[6]TepeB,AkpulatHA,Sken,etal.Sreeningftheantixidativeandantiirbialprpertiesftheessentialilsf